Name: 酶谱法检测功能的基质金属蛋白酶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学习使用明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶活性，通过电泳分离和染色分析培养上清液或体液样本中的MMP功能。该方法可定量评估酶活性水平，为研究组织重塑和疾病机制提供可靠工具。

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我们感谢贝勒医学院分子与细胞生物学系的 S. Ressler 博士建议使用蛋白浓缩器来提高细胞培养上清液中基质金属蛋白酶（MMPs）的浓度。
本项目获得了克拉拉·埃尔德·怀特·格雷厄姆捐赠研究基金和美国国立卫生研究院/国家关节炎与肌肉骨骼及皮肤病研究所（NIH/NIAMS，项目编号AR059838）向CB提供的资助。本内容仅由作者负责，不一定代表NIH的官方观点。

1. 上样并运行凝胶电泳
<ol>
	<li>所有样品必须经过适当处理，以保持酶的活性，并在采集后立即使用，或在 -80°C 下冷冻保存。样品中不得含有还原剂（如 β-巯基乙醇），且在上样前不得煮沸。</li>
	<li>打开装有凝胶的夹心盒袋，用去离子水冲洗夹心盒。
	<ul>
		<li>移除夹心盒底部的保护胶带以及凝胶顶部的梳子。</li>
		<li>用电泳缓冲液（用去离子水稀释至1X）冲洗加样孔三次。</li>
		<li>将凝胶放入Mini-Cell中，确保夹心盒较小的一侧朝内。用凝胶固定楔锁紧位置。Mini-Cell可同时平行运行一个或两个凝胶。</li>
		<li>向顶部（内侧）腔室加入1X电泳缓冲液，液面需高于加样孔，检查是否存在泄漏。若发现泄漏，应倒出缓冲液并重新放置凝胶。</li>
		<li>向底部腔室加入1X电泳缓冲液。</li>
	</ul>
 </li>
	<li>在其中一个加样孔中加入10 μL蛋白分子量标记物。
	<ul>
		<li>将等体积的上样缓冲液与样品混合，使用上样枪头（每个样品之间需更换枪头）加入凝胶的加样孔中。每个加样孔最多可加载20 μL总体积。</li>
	</ul>
 </li>
	<li>将盖子盖上Mini-Cell，并将电极线连接至电源。打开电源，设定为恒压125 V，运行90分钟。观察底部腔室导线上是否产生微小气泡，以确认电流流通。</li>
	<li>首次运行凝胶时，应每隔15分钟监测一次电泳进程，以上样缓冲液中含有的溴酚蓝作为指示剂。待指示染料迁移至凝胶底部时，停止电泳。</li>
</ol>
2. 凝胶的复性与显影
<ol>
	<li>每块凝胶分别准备 100 mL 1× 变性缓冲液和 200 mL 变性缓冲液，均使用去离子水配制。</li>
	<li>当溴酚蓝示踪染料迁移至凝胶底部时，关闭电源，打开 Mini-Cell，取出凝胶。使用凝胶刀（或药匙）将夹板的两侧分开，并切去一角以标记凝胶的方向。</li>
	<li>小心将凝胶从夹板中取出，放入盛有 100 mL 复性缓冲液的容器中。室温下轻柔振荡孵育 30 分钟。</li>
	<li>吸除复性缓冲液，向凝胶中加入 100 mL 显色缓冲液。室温下轻柔振荡孵育 30 分钟。</li>
	<li>吸除显色缓冲液，再向凝胶中加入 100 mL 显色缓冲液。于 37°C 孵育过夜（16–18 小时）。</li>
	<li>吸除显色缓冲液，在室温下用去离子水轻柔振荡洗涤三次，每次 5 分钟。</li>
	<li>扫描凝胶，记录蛋白标准品条带的精确位置，因为这些条带在后续染色后可能变淡或不可见。</li>
	<li>向凝胶中加入 20 mL SimplyBlue Safestain 进行染色。室温下轻柔振荡孵育 1 小时。</li>
	<li>吸除 SimplyBlue Safestain 染色液，用 100 mL 或更多去离子水在室温下轻柔振荡脱色 1 小时。</li>
	<li>为获得更佳结果，更换新鲜去离子水，继续在室温下轻柔振荡孵育 1 小时或更长时间。</li>
</ol>
3. 数据分析
<ol>
	<li>小心地将凝胶从水中取出，并放入塑料文件保护套中。</li>
	<li>以300 dpi或更高的分辨率扫描凝胶。将图像保存为TIFF格式（图1A）。</li>
	<li>使用ImageJ（或其他类似软件）测量条带强度。
	<ul>
		<li>在ImageJ中打开TIFF文件（图1A）。</li>
		<li>通过选择“Image&gt;Type&gt;8-bit”将图像显示为黑白模式（图1B）。</li>
		<li>使用矩形选择工具勾勒第一条条带，绘制的矩形高度至少应为宽度的两倍（此为软件要求）。</li>
		<li>按下“1”键或选择“Analyze&gt;Gels&gt;Select first lane”，该条带将被自动勾勒。</li>
		<li>会出现一个新的矩形，将其移动到下一条条带，然后选择“Analyze&gt;Gels&gt;Select next lane”。重复此步骤，直至所有条带均被选中（图1B）。</li>
		<li>按下“3”键或选择“Analyze&gt;Gels&gt;Plot lanes”，生成每条条带的轮廓图（图1C）。</li>
		<li>使用直线选择工具（通常已自动选中），绘制基线，使目标峰成为一个完全封闭的区域。</li>
		<li>选择魔棒工具，点击每个峰内部以选中该峰。</li>
		<li>选择“Analyze&gt;Gels&gt;Label peaks”，获得包含每个选中峰面积的表格。这些数据可直接作图（图1D），也可相对于某一选定条带的数值进行归一化处理。当汇总多个重复凝胶的数据以确定结果的统计学显著性时，此归一化步骤尤为重要。</li>
	</ul>
	</li>
</ol>
4. 典型结果
我们展示了一块凝胶，其中11个加样孔加载了含有不同浓度MMP-2的细胞培养上清液（图1A）。直接观察该凝胶可明显看出某些加样孔之间MMP-2浓度存在显著差异。例如，可以清楚地看到，第4和第5孔中的MMP-2含量远高于第11孔，甚至高于第10孔。为了对条带进行客观定量，我们使用ImageJ软件进行了密度测定（图1B-D），结果证实第11孔与第4和第5孔之间的MMP-2含量差异约为4倍，而第10孔与第4和第5孔之间的MMP-2含量差异约为2倍。
<img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig1.jpg" alt="电泳结果；凝胶条带、吸收峰、条带强度的柱状图分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 明胶酶谱法检测MMP-2。A，明胶凝胶的扫描图像。凝胶顶部标示了加样孔编号。B，与A相同的凝胶以黑白形式显示，用于密度测定。在ImageJ中用矩形框选每个条带。C，对应于A和B图凝胶的两个密度测定曲线示例（条带#4和#11）。在每个峰的基部画一条直线，形成封闭区域。D，A和B图凝胶条带峰面积在归一化前（左）和归一化后（右）的图示，归一化依据为条带#1的密度。
<img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig2.jpg" alt="凝胶电泳图及柱状图，显示不同样本中Pro-MMP-2和MMP-2的蛋白水平。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 本图展示了酶谱法如何用作一种半定量技术。我们在连续7个加样孔中加载了系列稀释样本（1:1梯度稀释），并分别测量了pro-MMP-2和MMP-2条带的密度。

<ol><li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+matrix+metalloproteinases+in+the+morphogenesis+of+the+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex.</a> Cerebellum. 4, 239-245 (2005).</li>
<li>Pasternak, B., Aspenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metalloproteinases+and+their+inhibitors+-+diagnostic+and+therapeutic+opportunities+in+orthopedics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Orthop%22%5BJournal%5D)">Metalloproteinases and their inhibitors - diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics.</a> Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).</li>
<li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases%3A+regulators+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li>
<li>Lagente, V., Boichot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+matrix+metallopreoteinases+in+the+inflammatory+process+of+respiratory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Role of matrix metallopreoteinases in the inflammatory process of respiratory diseases.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 48, 440-444 (2010).</li>
<li>Rodríguez, D., Morrison, C. J., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metallopreoteinases%3A+what+do+they+not+do%3F+New+substrates+and+biological+roles+identified+by+murine+models+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Matrix metallopreoteinases: what do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1803, 39-54 (2010).</li>
<li>Bourboulia, D., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+%28MMPs%29+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+%28TIMPs%29%3A+positive+and+negative+regulators+in+tumor+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): positive and negative regulators in tumor cell adhesion.</a> Semin. Cancer Biol. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Heussen, C., Dowdle, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+analysis+of+plasminogen+activators+in+polyacrylamide+gels+containing+sodium+dodecyl+sulfate+and+copolymerized+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates.</a> Analytical Biochem. , 102-196 (1980).</li>
<li>Lombard, C., Saulnier, J., Wallach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+of+matrix+metalloproteinases+%28MMPs%29+activities%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Assays of matrix metalloproteinases (MMPs) activities: a review.</a> Biochimie. 87, 265-272 (2005).</li>
<li>Snoek-van Beurden, P. A., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymographic+techniques+for+the+analysis+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> Biotechniques. 38, 73-83 (2005).</li>
<li>Kupai, K., Szucs, G., Cseh, S., Hajdu, I., Csonka, C., Csont, T., Ferdinandy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+activity+assays%3A+importance+of+zymography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase activity assays: importance of zymography.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 205-209 (2010).</li>
<li>Kleiner, D. E., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+zymography%3A+detection+of+pictogram+quantities+of+gelatinases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative zymography: detection of pictogram quantities of gelatinases.</a> Anal. Biochem. 218, 325-329 (1994).</li>
<li>Yu, W. H., Woessner, J. F. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin-enhanced+zymographic+detection+of+matrilysin+and+collagenases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Heparin-enhanced zymographic detection of matrilysin and collagenases.</a> Anal. Biochem. 293, 38-42 (2001).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

我们已展示了如何对细胞培养上清液中的MMP-2进行酶谱分析。
上样量需根据样品来源及目标基质金属蛋白酶（MMP）的经验值确定。上样量过少将导致无法检测，而过多则可能引起信号饱和，因为蛋白酶在条带区域可降解的底物量有限。如有必要，可在加入上样缓冲液前用去离子水稀释样品，或将孵育时间从过夜缩短至4小时。也可使用浓缩装置（例如 Millipore 货号 # UFC803024）对溶液中的蛋白质进行浓缩。如果条带仍难以观察，可能需要延长凝胶孵育时间，甚至可达48小时。在处理组织培养上清样品时，需注意胎牛血清（及其他血清）中含有MMP，可能影响实验结果。因此，我们均在无血清培养基中培养后收集上清液。
方案中第2.9和2.10段所述的洗涤步骤旨在去除消化条带的背景染色。延长洗涤时间可进一步降低背景，但也会减弱整个凝胶中底物的染色强度。若需延长洗涤时间，建议每隔几小时扫描一次凝胶，以选择对比度最佳的图像。
该技术也可用于检测其他基质金属蛋白酶（MMP）。例如，MMP-9 可在明胶凝胶上被检测到，而 MMP-1、MMP-8 和 MMP-13 也可在一定程度上被检测，因为明胶并非它们的首选底物。MMP-1 和 MMP-13 最好通过胶原蛋白酶谱法进行检测，而酪蛋白是 MMP-11 的首选底物，同时也可用于检测 MMP-1、MMP-3、MMP-7、MMP-12 和 MMP-139。 
当 MMP-7（基质溶解素）和胶原酶（MMP-1 和 MMP-13）在酪蛋白或明胶凝胶中含量较低时，检测较为困难。在上样时向样品中添加肝素，可显著提高 MMP-7 的检测灵敏度。而对于 MMP-1 和 MMP-13，需在电泳开始后将肝素加入凝胶中12。
由于zymography在酶变性并复性后测定其酶活性，因此可检测样品中所有基质金属蛋白酶（MMPs）的活性，包括酶、酶原以及与内源性抑制剂（如TIMP-2）结合的酶。然而，通过比较活性酶与酶原条带的密度，可以确定样品中MMP的活化程度，其中酶原的分子量略高。
仅靠酶谱法通常不足以鉴定基质金属蛋白酶（MMP）。将MMP的迁移位置与已知分子量的标准蛋白进行比较有助于鉴定，但需注意，某些标准蛋白含有还原剂，当在非还原条件下使用时，可能导致显示的分子量不同9。一种可行方法是在同一凝胶中加载可溶性重组MMP作为对照。然而，MMP可能与其他蛋白结合，从而改变其表观分子量。在显影缓冲液孵育过程中，可将特异性MMP抑制剂加入凝胶（或将凝胶一分为二，仅在其中一半加入），作为药理学工具用于鉴定目标MMP。建议结合第二种技术（如Western印迹、免疫细胞化学或ELISA）辅助鉴定目标MMP。需要注意的是，Western印迹的检测灵敏度通常远低于酶谱凝胶，使用该技术时可能导致假阴性结果。

<table><tbody><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell CE 标志电泳装置</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>电源（型号 302）</td><td>VWR international</td><td>93000-744</td><td></td></tr><tr><td>Novex 10% 明胶zymogram凝胶，1.0 mm，12 孔</td><td>Invitrogen</td><td>EC61752BOX</td><td></td></tr><tr><td>Blue Juice 凝胶上样缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>10816015</td><td></td></tr><tr><td>凝胶上样吸头</td><td>VWR international</td><td>53509-015</td><td></td></tr><tr><td>蛋白质分子量标准品</td><td>Invitrogen</td><td>LC5800</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tris-甘氨酸-SDS 电泳运行缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>LC2675</td><td></td></tr><tr><td>Novex zymogram 复性缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>LC2670</td><td></td></tr><tr><td>Novex zymogram 显色缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>LC2671</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Epson Perfection 4490 Photo 扫描仪</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/</td><td>n/a</td><td>作者：W. Rasband，NIH/NIMH</td></tr></tbody></table>

通过明胶酶谱法检测功能性基质金属蛋白酶

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

基质金属蛋白酶（MMPs）是一类含锌的内肽酶，通过切割肽键降解蛋白质。目前已鉴定出二十余种MMPs，根据其结构和底物特异性可分为六类（胶原酶、明胶酶、膜型MMP（MT-MMP）、基质溶解素、基质金属蛋白酶-7（matrilysins）及其他）。MMPs在细胞侵袭、软骨降解、组织重塑、伤口愈合及胚胎发生中发挥关键作用，因此既参与正常生理过程，也参与多种疾病的发病机制，如类风湿性关节炎、癌症和慢性阻塞性肺疾病1-6。本文将重点介绍广泛表达的MMP-2（明胶酶A，IV型胶原酶），并演示如何通过1980年由C. Heussen和E.B. Dowdle首次报道的一种常用、简单但极为敏感的技术——明胶酶谱法（zymography）——检测细胞培养上清中的MMP-27-10。该技术为半定量方法，因此当在同一凝胶中加载已知浓度的重组MMP作为参照时，可用于测定待测样本中的MMP水平11。
含有基质金属蛋白酶（MMPs）的溶液（例如细胞培养上清液、尿液或血清）被加样至含有十二烷基硫酸钠（SDS；用于使蛋白质线性化）和明胶（MMP-2 的底物）的聚丙烯酰胺凝胶中。样品缓冲液的设计目的是增加样品黏度（便于加样）、提供示踪染料（溴酚蓝；用于监测样品迁移）、提供变性分子（使蛋白质线性化）以及调节样品的 pH 值。随后，在电泳缓冲液中施加电流，使蛋白质在恒定迁移速率下进行迁移。迁移距离与蛋白质的分子量呈负相关（小分子蛋白质比大分子蛋白质在凝胶中迁移更快，因此迁移得更远）。电泳结束后，将凝胶置于复性缓冲液中，使蛋白质恢复其三级结构，这是酶活性所必需的。接着将凝胶转移至显影缓冲液中，以允许蛋白酶降解其底物。显影缓冲液中还含有对氨基苯基汞乙酸盐（APMA），用于将无蛋白水解活性的前体 MMPs（pro-MMPs）激活为具有活性的 MMPs。下一步是对底物（本例中为明胶）进行染色。洗去凝胶上多余的染料后，蛋白酶降解区域呈现为透明条带。条带越透明，表明其所含蛋白酶浓度越高。随后可通过密度测定法（例如使用 ImageJ 软件）测定条带染色强度，从而实现样品间的比较。

本方案描述了一种基于活性的检测方法，用于检测培养上清液或体液中的基质金属蛋白酶。

基质金属蛋白酶（MMPs）是一类含锌的内肽酶，通过水解肽键降解蛋白质。目前已发现二十余种MMPs，……

本实验的总体目标是检测功能性基质金属蛋白酶的活性。首先通过添加不含还原剂的上样缓冲液来制备样品以进行zymography分析。然后将样品加入明胶Zymography凝胶中，并电泳至示踪染料迁移至凝胶底部。电泳结束后，凝胶需进行复性、孵育、染色和脱色。该实验流程的最后一步是扫描凝胶以进行数据分析。最终可通过条带密度分析获得结果，显示样品中基质金属蛋白酶的活性。您好，我来自范德堡大学医学院分子生理学与生物物理学系Kristin Bittel博士的实验室。今天我们将向您展示一种通过明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶的实验方法。在我们的实验室中，该方法用于研究原代培养细胞所分泌的基质金属蛋白酶。因此，让我们开始学习。在本方案开始之前，应充分准备好所有的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs），以维持酶的活性。样品可立即使用，或保存于负80摄氏度。此处使用基质金属蛋白酶2（MMP-2），也称为明胶酶A或IV型胶原酶，以演示通过明胶酶谱法可视化MMP活性。制备好MMP酶后，取一个10%明胶Zymogram凝胶袋，其中含有置于盒式夹心中的凝胶。用去离子水冲洗该夹心盒。从胶板底部移除保护胶带，并从顶部取出梳子。用三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸SDS电泳运行缓冲液冲洗加样孔三次。将凝胶放入小型电泳装置中，确保胶板盒的较窄一侧朝内。使用凝胶固定楔锁紧凝胶。向装置的上层电泳槽中加入Tris-甘氨酸SDS电泳缓冲液，液面需高出加样孔水平，并检查是否存在泄漏。同样，用电泳运行缓冲液填充电泳装置的下层室。然后上样 10 微升的蛋白质分子量标记物。将等量样品与不含还原剂的上样缓冲液混合。与常规SDS-PAGE不同，样品无需煮沸，可直接上样至凝胶孔中。使用凝胶加样枪头时，每个孔最多可容纳20 µL体积。盖上迷你电泳槽的盖子，并将电极导线连接至电源。打开电源，将电泳仪设置为恒定125伏，运行90分钟。首次运行凝胶时，观察下层电泳槽导线处是否有微小气泡产生，以确认电流通过。每15分钟监测一次电泳迁移进程，以加样缓冲液中含有的溴酚蓝作为指示剂，观察每块凝胶的迁移情况。用去离子水配制 100 毫升一倍浓度的 xmo 克 Rena 缓冲液和 200 毫升 xmo 克显影缓冲液。当溴酚蓝示踪染料迁移至凝胶底部时，关闭电源。打开迷你电泳槽，取出凝胶。将胶板夹的两侧分开。使用胶刀切去一个角以标记凝胶的方向。小心地将凝胶从胶板夹中取出，并放入含有100毫升Rena缓冲液的容器中。将凝胶在室温下轻轻振荡孵育30分钟，弃去Renaturing缓冲液，向凝胶中加入100毫升显色缓冲液。在室温下轻轻振荡孵育30分钟。然后弃去显色缓冲液，再向凝胶中加入100毫升新鲜的显色缓冲液。在 37 摄氏度下将凝胶孵育过夜。过夜孵育后，移除显影缓冲液，并用去离子水轻轻振荡洗涤凝胶。室温下孵育 5 分钟，重复此洗涤步骤两次。将凝胶置于塑料膜保护袋中，并去除气泡。然后使用图像扫描仪对凝胶进行扫描，以保存蛋白质标准条带的精确位置，因为染色后这些条带将变得几乎不可见。将20毫升Simply Blue安全染色液加入凝胶中进行染色。在室温下孵育凝胶1小时。在温和振荡条件下，移除Simply Blue安全染色液，并将凝胶置于100毫升去离子水中，在室温下继续温和振荡孵育。一小时后，更换为新鲜的去离子水，并继续孵育凝胶至少一小时。若需使用流式细胞术分析数据，首先小心地将凝胶从水中取出，放入塑料文件袋中。使用照片扫描仪以每英寸300点或更高的分辨率扫描凝胶。将图像保存为TIFF格式。在Image J或类似的定量分析软件中打开TIFF文件，以测量条带强度。通过选择图像类型为8位，以黑白模式显示图像。使用矩形选择工具勾勒第一条条带，绘制一个高度至少是宽度两倍的矩形。选择“分析凝胶”，然后选择第一条泳道，该条带将被选中。随后将出现一个新的矩形。将其移动到下一个条带，选择“分析凝胶”，再选择下一个泳道。重复此过程，直至所有条带均被选中。选择“分析凝胶”中的“绘制泳道”功能，以生成每条条带的轮廓图。使用直线选择工具绘制基线，使目标峰成为一个完全封闭的区域。选择魔棒工具，然后单击每个峰的内部以选中该峰。选择分析凝胶并标记峰，以获得包含每个选定峰面积的表格。这些数据可直接作图，也可归一化至所选条带的数值。在合并多个重复凝胶的数据以确定结果的统计学显著性时，这种归一化尤为重要。本图所示凝胶的每个加样孔中均加入了不同的细胞培养物，上清液中含有不同量的MMP-2。通过直接观察该凝胶，可见某些加样孔之间的MMP-2浓度存在明显差异。例如，通过密集细胞计数法结合 Image J 软件对条带进行客观定量分析，结果表明，第四和第五孔中的 MMP2 含量明显高于第十和第十一孔，MMP2 含量差异约为四倍。在11号孔与4号和5号孔之间，MMP-2的量存在差异。同样，在10号孔与4号和5号孔之间，MMP-2的量也观察到两倍的差异。我们只是向您展示如何检测功能指标。金属通过 xog 持留。进行此操作时，重要的是要记住不要煮沸样品，否则在凝胶上将无法看到任何条带。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

酶谱法检测功能的基质金属蛋白酶

本文中，我们描述了使用磁力镊子以高度可并行的方式在单分子水平上研究力对酶促蛋白水解作用的影响。...

使用磁镊进行多重单分子力促蛋白水解测量

在本视频中，我们采用酶谱法（zymography）这一电泳技术，分析生物样品中的蛋白水解活性。...

荧光肽类底物酶谱法：一种利用荧光底物在酶谱凝胶中检测蛋白酶活性的改良技术

本视频演示了利用明胶酶谱凝胶电泳技术检测细胞培养上清液中基质金属蛋白酶（MMPs）活性的方法。具有活性的MMPs可降解聚丙烯酰胺凝胶中嵌入的MMP特异性底物，在染色后背景呈深色的情况下，降解区域表现为清晰的透明条带。...

明胶酶谱电泳：一种通过检测酶活性来分析基质金属蛋白酶的电泳技术

精确质量测定是蛋白质研究过程中的重要步骤。基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱（MS）可用于此类测定，其主要优势在于对盐类、去污剂和污染物具有良好的耐受性。本文展示了一种利用MALDI-MS分析分子量大于100...

基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱法分析完整蛋白质（分子量大于100 kDa）

本方案描述了如何制备由明胶和I型胶原组成的二维混合基质，以及I型胶原的三维凝胶栓，用于研究线性侵袭体。这些方案可用于研究线性侵袭体的形成、基质降解活性，以及原代细胞和癌细胞系的侵袭能力。...

用于研究线性侵袭体形成与活性的二维和三维基质

本文介绍了一种利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF）测定粗鼠组织提取物中蛋白酶特异性的实验方案。...

通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法测定小鼠组织提取物中蛋白酶特异性的方法：调控pH值以诱导特异性改变

本文介绍了一种改良的荧光肽底物酶谱法的详细实验方案，该方法采用荧光标记的肽段作为可降解底物，取代传统的天然蛋白质。通过在荧光肽酶谱中对生物样品进行电泳，能够检测到比以往酶谱技术更广泛种类的蛋白酶。...

荧光肽底物酶谱法检测蛋白酶活性

本文介绍了一种将细胞包封并培养在功能化聚乙二醇（PEG）水凝胶中的实验方案，该水凝胶含有可被荧光基质金属蛋白酶（MMP）降解的肽段。通过标准的微孔板读数仪，可直接从水凝胶培养物中检测细胞的MMP活性及代谢活性。...

在三维水凝胶中测量全细胞基质金属蛋白酶及代谢活性

采用 His标签纯化、透析和活化方法，以提高在细菌中表达的可溶性、有活性的基质金属蛋白酶-3 催化结构域蛋白的产量。通过 SDS-PAGE...

利用亲和层析法进行人基质金属蛋白酶-3的细菌表达与纯化

蛋白酶对细菌致病至关重要，可促进侵袭并逃避宿主免疫。以单步法提取细菌胞质和膜蛋白并保持其活性状态极具挑战性。本视频文章展示了从钩端螺旋体（Leptospira）中提取全细胞蛋白，用于明胶酶谱分析，以检测和表征明胶酶。...

一步法提取与细菌明胶酶的明胶酶谱分析

学习使用明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶活性，通过电泳分离和染色分析培养上清液或体液样本中的MMP功能。该方法可定量评估酶活性水平，为研究组织重塑和疾病机制提供可靠工具。

通过明胶酶谱法检测功能性基质金属蛋白酶

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