利用神经球实验建立小鼠胚胎神经干细胞培养

本视频实验方案的目的是利用神经球检测法从小鼠胚胎脑中分离并扩增神经干细胞。该操作步骤包括获取 E14 小鼠胚胎，随后进行脑部显微解剖以分离纹状体隆起区域，将所获组织解离以获得单细胞悬液，最后将细胞接种于神经球培养体系中。大家好，我是来自佛罗里达大学脑研究所 Brent Frennels 博士实验室的 Hassan Ali。

今天我将向您展示如何利用神经球检测法，从小鼠胚胎脑组织中建立神经球培养体系。我们实验室常规使用该方法来分离和扩增神经干细胞。好了，让我们开始吧。

麻醉一只时间交配的妊娠小鼠。在妊娠第14天，实施颈椎脱位，并用70%乙醇清洗腹部。用大号镊子夹住腹部皮肤，然后用大剪刀剪开皮肤及下方筋膜。

为了暴露腹腔和子宫角，取出含有胚胎的子宫角，并将其转移至含有冷HIM的50 ml锥形管中。将子宫组织转移至PC2级生物安全柜后，从50 ml管中移除HIM，并用足量的新鲜冷HIM冲洗组织，以去除血液和毛发等污染物，重复冲洗两到三次。将子宫组织转移至含有冷HIM的10厘米培养皿中。

使用小型弯头镊子和剪刀打开子宫角，将胚胎转移至含有冷Hem的新培养皿中。重复此操作，直至所有胚胎均被采集完毕。随后将胚胎置于解剖显微镜下观察。

在颈髓水平分离胚胎的头部，并将其转移至另一个含有冷Hem的培养皿中。使用精细的弯镊子夹住头部，并用显微剪刀进行操作。首先在鼻部上方做一水平切口，然后从额头沿中线向头后部继续剪开。

务必切开皮肤和颅骨，避免损伤下方的脑组织。使用弯头镊子将切开部位的边缘向后推动，从颅骨中取出脑组织。重复此操作，直至所有脑组织均从颅骨中移除。

使用弯头镊子固定脑组织，使背侧朝上，然后用显微剪刀从嗅球开始沿每个半球向后剪开皮层。为暴露神经节隆起，保持脑组织位置稳定，用45度角倾斜的镊子分离出完整的神经节隆起，并将其转移至另一个培养皿中。此处清晰显示了神经节隆起及其内侧和外侧部分。

或者，您可以使用精细镊子去除周围组织，分离神经节隆起。您还可以将整个隆起切成内侧和外侧两半，如果您希望培养这些区域的细胞。

重复此操作，直至所有脑组织完成显微解剖。使用1毫升神经干细胞培养基收集组织碎片，并转移至15毫升离心管中。让组织团块在15毫升离心管中自然沉降，以确保不残留任何组织。

吸除部分上清液，冲洗培养皿底部，将残留的组织转移至15 ml离心管中。将移液器枪头紧贴管底，上下吹打悬液3到4次，以充分解离组织，获得单细胞悬液。

静置悬浮液1分钟，使未解离的细胞团块沉淀，将大部分细胞悬液转移至另一支15 ml离心管中。向残留的团块中加入1毫升神经干细胞培养基，将其解离为单个细胞。合并两管中的内容物。

然后以700 RPM或110 G离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于1毫升完全神经干细胞培养基中。取10微升细胞悬液，与90微升台盼蓝充分混匀。

然后取 10 µL 该悬液，转移至血细胞计数板中，进行细胞计数。将总共 20 mL 完全神经干细胞培养基转移至一个 50 mL 锥形管中，用于接种一个 T80 培养瓶。

然后混匀细胞悬液，并加入适量细胞，使终浓度为每毫升200,000个细胞，或每T80培养瓶400万个细胞。加入EGF，使其终浓度为每毫升20纳克。将含有完全神经干细胞培养基和生长因子的细胞混匀，然后将细胞悬液转移至T80培养瓶中。

标记烧瓶，并在显微镜下观察细胞，以确保获得单细胞悬液且无组织团块。将烧瓶转移至37°C、含5%CO2的培养箱中培养5至7天。5至7天后，在显微镜下评估烧瓶中的细胞状态。

此时，神经球已经形成，直径应在 150 至 200 微米之间，可进行传代培养。将培养瓶中的内容物收集至适当大小的无菌组织培养管中，离心后弃去上清液。将神经球重悬于 1 毫升预热的胰蛋白酶溶液中，置于 37°C 水浴中孵育 2 分钟。

然后加入等体积的胰蛋白酶抑制剂，轻轻但充分混匀，以终止胰蛋白酶活性。再次离心并弃去上清液。接着将细胞重悬于1毫升完全神经干细胞培养基中，并按前述方法进行细胞计数。为接种一个T175培养瓶，将总共40毫升完全神经干细胞培养基转移至一个50毫升锥形管中。

然后混匀细胞，并加入适量细胞，使终密度为每 M 孔 50,000 个细胞或每 T175 培养瓶 200 万个细胞。接着加入 EGF，使其终浓度为 20 纳克/毫升。将含有完全神经干细胞培养基和生长因子的细胞混匀，然后将细胞悬液转移至 T175 培养瓶中。

标记烧瓶并将其转移至培养箱中培养5至7天。这是原代E14神经干细胞培养的一个示例。接种后第3天，箭头所示为正在增殖的神经干细胞簇。

您还可以观察到附着在基质上并已分化的细胞。这是原代 E14 神经干细胞培养物在接种七天后的示例。如您所见，存在多种不同大小的细胞球。

还存在一些已分化的细胞。与原代成年神经球培养物相比，碎片量要少得多。此外，神经球结构松散，周边带有微小突起，表明神经球处于健康且有活力的状态。

应避免类球体生长过大，否则由于中心区域细胞死亡，类球体可能颜色变深。过大的类球体还可能贴附于基质并发生分化。此图为传代一次的E14神经球在接种后第五天的示例。

这里再次可以看到球体边缘的微小突起。我们刚刚向您展示了如何按照此处所述的相同步骤，从 E 14 小鼠纹状体隆起培养神经球。您也可以从其他脑区（如大脑皮层和中脑）培养神经球。

感谢观看，祝您的神经球培养实验顺利成功。