Name: 建立小鼠胚胎神经干细胞培养神经球含量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T20:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: 学习利用神经球培养法从E14小鼠胚胎脑节隆起分离和扩增神经干细胞。本方法包括胚胎采集、脑组织显微解剖和细胞培养，为神经发育与再生研究提供可靠的体外模型。

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本工作得到了Overstreet基金会的资助。

1. 解剖前的基本准备：
<ol>
<li>通过将 NeuroCult NSC 基础培养基与 NeuroCult NSC 增殖添加剂按 9:1 的比例混合，配制适量体积的完全 NSC 培养基。</li>
<li>将培养基置于 37°C 水浴中预热。</li>
<li>为解剖和清洗操作，配制含高浓度抗生素（10%）的冷 HEPES 缓冲最低必需培养基（HEM）。 alternatively，也可使用添加抗生素的 NSC 基础培养基完成此步骤。</li>
<li>将含抗生素的冷 HEM 25–30 mL 分装至无菌的 50 mL 离心管中，用于胚胎收集。</li>
<li>需要准备数个 10 cm 塑料培养皿，用于在解剖过程中盛放胚胎和脑组织，以及存放已解剖的组织。</li>
<li>用于取出胚胎（大剪刀、小尖头剪刀、大镊子、小弯头镊子）或进行胚胎脑解剖（小镊子、弯头精细镊子、45° 角精细镊子和小剪刀）的手术器械，需使用玻璃珠灭菌器在 250°C 下灭菌，或采用其他可用的高压灭菌方法进行灭菌。</li>
<li>使用 70% 酒精擦拭解剖显微镜，并将其置于超净台或 PC2 级生物安全柜内进行设置。</li>
</ol>
2. 收集 E14 小鼠脑组织并进行显微解剖：
<ol>
<li>一只交配后定时的孕鼠在第14天被麻醉th 根据所在机构批准的动物实验方案确定妊娠时间。</li>
<li>颈椎脱位用于确保动物不会遭受疼痛和痛苦。</li>
<li>将麻醉后的小鼠仰卧于吸水纸巾上，用70%乙醇清洗腹部以消毒该区域。</li>
<li>用大号镊子夹住腹部皮肤，然后用大剪刀剪开皮肤及皮下筋膜，以暴露腹腔和子宫角。</li>
<li>使用小型镊子和剪刀取出子宫，并将其转移至含有冷HEM的50 ml锥形管中。</li>
<li>将子宫组织转移至超净台，然后用足量新鲜无菌的冷HEM溶液冲洗一至两次，以去除可能的污染物（如血液和毛发）。</li>
<li>将子宫组织转移至含有冷HEM的10 cm培养皿中。</li>
<li>使用小型弯头镊子和剪刀打开子宫角，将胚胎转移至一个新的10 cm培养皿中，该培养皿内含有冷的HEM。</li>
<li>在颈脊髓水平分离胚胎头部，并转移至另一含有冷HEM的培养皿中。</li>
<li>将培养皿转移至解剖显微镜下，以去除颅骨中的脑组织。</li>
<li>用精细的弯头镊子从头部尾侧夹住，使头部背侧朝上。使用显微剪刀，首先在眼睛上方做一水平切口，然后沿中线从额头向头后部延伸。确保切开皮肤和颅骨，避免损伤下方的脑组织。</li>
<li>使用弯头镊子将切开部位的边缘向后推动，从而将脑组织从颅骨中取出。重复此操作，直至所有脑组织均从颅骨中移除。</li>
<li>使用弯镊固定脑组织，使背侧朝上，然后用显微剪刀从每侧半球的嗅球向后沿皮层做切口，直至半球后部，以暴露纹状体隆起。</li>
<li>使用一把弯钳和另一只手的 45° 另一手持斜角镊，撑开皮层的切开瓣，分离出神经节隆起。</li>
<li>将解剖的组织置于无菌的10 cm培养皿中，并重复此操作，直至所有脑组织完成显微解剖。</li>
<li>使用1 mL移液器吸头吸取1 mL NSC培养基收集组织块，并转移至15 mL离心管中。</li>
<li>将组织充分但轻柔地吹打分散，方法是将移液枪头抵住离心管底部，上下吹吸悬液。通过这种方式将组织团块分散成单细胞。吹打3–4次，直至形成乳白色样的悬液。随后静置悬液1–2分钟，使未完全解离的团块沉淀。</li>
<li>将几乎全部的细胞悬液转移至另一离心管中，然后向残留的细胞团块中加入1 mL NSC培养基，按前述方法将其解离为单细胞。</li>
<li>将各管内容物合并，在室温下以700 rpm（110g）离心5分钟。</li>
<li>吸除上清液至接近实际沉淀，然后将细胞重悬于1 mL完全NSC培养基中。</li>
<li>用移液器轻轻吹打培养基，以获得均匀的单细胞悬液。</li>
<li>10 μL 细胞悬液与 90 μL 台盼蓝染色法进行细胞计数。</li>
<li>最后，将细胞以2x10的密度接种5 细胞/毫升，置于添加了20纳克/毫升表皮生长因子（EGF）的完全NSC培养基中。T25培养瓶使用5毫升培养基，T75培养瓶使用20毫升，T175培养瓶使用40毫升。</li>
<li>神经球在培养5-7天后形成，培养条件为 37° C 在含5% CO₂的湿润培养箱中26-7天后，细胞球直径应达到150-200微米，即可进行传代培养（传代）。</li>
</ol>
3. 胚胎神经干细胞的传代与扩增：
<ol>
<li>当神经球准备进行传代培养时（直径为 150–200 μm），将含有悬浮神经球的培养基从培养瓶中移出，转移至适当大小的无菌组织培养管中，在室温下以 700 rpm（110 g）离心 5 分钟。</li>
<li>弃去上清液，将神经球重悬于 1 mL 的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液中。</li>
<li>将细胞悬液置于 37°C 水浴中孵育 2–3 分钟，然后加入等体积的大豆胰蛋白酶抑制剂以终止胰蛋白酶活性。</li>
<li>轻轻吹打细胞悬液，确保胰蛋白酶已完全失活。</li>
<li>将细胞悬液在 700 rpm（110 g）条件下离心 5 分钟，弃去上清液后，将细胞重悬于 1 mL 完全 NSC 培养基中。</li>
<li>取 10 μL 细胞悬液与 90 μL 台盼蓝混合，进行细胞计数。</li>
<li>将细胞以 5×104 个细胞/mL 的浓度接种于完全 NSC 培养基中，培养基中添加 20 ng/mL EGF，并根据培养瓶规格加入适量培养基：T25 培养瓶使用 5 mL，T75 培养瓶使用 20 mL，T175 培养瓶使用 40 mL。</li>
<li>在 37°C、含 5% CO2 的湿润化培养箱中孵育 5–7 天后，可形成次级神经球。</li>
</ol>
4. 代表性结果：
在原代胚胎神经干细胞（NSC）培养中，大多数细胞在接种后会变得肥大并贴附于组织培养皿上。尽管大部分细胞会在2-3天后死亡或发生分化，但仍有增殖能力的细胞会形成小细胞簇，并从基质上脱落（图1）。在培养最初48小时内形成的较大球形聚集体不应被误认为是原代神经球。聚集体的形成主要取决于培养物中碎片及未充分解离的组织团块的多少。真正的神经球在相差显微镜下透光性好、亮度高，且随着体积增大而变得更加圆润（图2）。存活且健康的神经球外表面可见细小的微突起（图3）。培养5-7天后，神经球应呈圆形但不致密，直径应在150至 200 μm 直径。如果神经球培养时间过长（培养9-10天后），可能会因球体中心细胞死亡而形成聚集体或颜色变深（见视频）。过大的神经球最终可能开始分化 原位 （附着于基质并向外围迁移）。此外，大神经球的解离及传代培养也较为困难。
<img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig1.jpg" alt="显示酵母细胞出芽、明场显微镜、菌落形成、无性繁殖的细胞培养。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 接种后第 3 天的原代 E14 神经干细胞（NSC）培养。箭头指示增殖中的神经干细胞簇。原始放大倍数：20x
<img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig2.jpg" alt="显微镜下的细胞培养球体，显示三维细胞生长，显微图像，实验室研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 接种后7天的原代E14神经干细胞培养。原始放大倍数：10×
<img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig3.jpg" alt="细胞聚团、显微镜图像、肿瘤球体、研究、癌症研究、生物学分析" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 接种后第5天的E14代次神经球。注意球体边缘的微突起（箭头所示）。原始放大倍数：20×

<ol><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+forebrain%3A+a+relatively+quiescent+subpopulation+of+subependymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells.</a> Neuron. 13, 1071-1082 (1994).</li>
<li>Craig, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+growth+factor+expansion+of+endogenous+subependymal+neural+precursor+cell+populations+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain.</a> J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).</li>
<li>Golmohammadi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+frequency+and+distribution+of+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain.</a> Stem Cells. 26, 979-987 (2008).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. eynolds <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li>
<li>Louis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+neural+stem+and+progenitor+cells+in+the+neural+colony-forming+cell+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay.</a> Stem Cells. 26, 988-996 (2008).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

神经球培养法是分离与扩增神经干细胞的首选方法 1-5 由于其操作简便且可重复性强，该检测方法是大规模生成未分化中枢神经系统前体细胞的宝贵工具，这些细胞可用于 体外 和 体内 研究。需要强调的是，神经球既可由真正的神经干细胞产生，也可由更为局限的前体细胞产生。因此，仅通过计算神经球形成频率会高估任何特定神经细胞群体中真正神经干细胞的数量 6为准确评估真正神经干细胞（NSCs）的频率，强烈建议使用专为此目的开发的神经集落形成细胞检测法（Neural Colony Forming Cell Assay, N-CFCA）。7.
为了获得稳定且高质量的E14神经干细胞神经球培养，我们建议：
<ol>
<li>在开始收获胚胎前，准备好所需的物品。</li>
<li>在整个解剖过程中，将胚胎保持在低温的HEM或基础NSC培养基中。</li>
<li>应尽快完成解剖操作（1小时内），因为组织随着时间推移会变软并具有黏性，增加解剖难度。</li>
<li>不要让细胞球生长过大。通常应根据...

<table><tbody><tr><td>NeuroCult NSC 基础培养基</td><td>培养基</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05700</td><td></td></tr><tr><td>NeuroCult NSC 增殖添加剂</td><td>培养基添加剂</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05701</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>大豆胰蛋白酶抑制剂</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen/Strep）</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>*MEM</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>41500-018</td><td>HEM 组分</td></tr><tr><td>*HEPES</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>HEM 组分</td></tr><tr><td>*蒸馏水</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15230-147</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>筛具</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>T25 培养瓶</td><td>培养器皿</td><td>Nalge Nunc international</td><td>136196</td><td></td></tr><tr><td>T80 培养瓶</td><td>培养器皿</td><td>Nalge Nunc international</td><td>178905</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>培养器皿</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>培养器皿</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>精细弯镊</td><td>手术工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251&amp;#8208;35</td><td></td></tr><tr><td>小型精细镊</td><td>手术工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272&amp;#8208;30</td><td></td></tr><tr><td>小型镊子</td><td>手术工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050&amp;#8208;10</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>手术工具</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>生长因子</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>2028-EG</td><td></td></tr><tr><td>b-FGF</td><td>生长因子</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3139-FB</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>生长因子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784</td><td>用 PBS 重悬</td></tr><tr><td colspan="5">&lt;p class=&quot;jove_content">*配制 HEM：取 1&amp;#215;10 L 的 MEM 粉剂包，加入 160 ml 1 M HEPES，用蒸馏水定容至 8.75 L，调节最终 pH 至 7.4，并于 4&amp;#x00B0;C 保存。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

利用神经球实验建立小鼠胚胎神经干细胞培养

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

在哺乳动物中，干细胞作为未分化细胞的来源，在动物整个生命周期中维持不同组织和器官的细胞生成与更新。它们具有替代因衰老、损伤或疾病而丢失细胞的潜力。神经干细胞（NSCs）的存在最初由Reynolds和Weiss（1992）在成年哺乳动物中枢神经系统（CNS）中通过一种新型无血清培养系统——神经球检测法（neurosphere assay, NSA）首次描述。利用该检测方法，也可从胚胎期中枢神经系统的不同区域分离并扩增神经干细胞。这些 体外 扩增的神经干细胞（NSCs）具有多向分化潜能，可分化为中枢神经系统（CNS）的三种主要细胞类型。尽管神经球培养法（NSA）看似操作简单，但为获得可靠且一致的结果，必须严格遵循本视频所展示的各项操作步骤。本视频以胚胎第14天（E14）小鼠脑组织为材料，实际演示了NSA的操作流程，用于生成并扩增神经干细胞，并提供了实现可重复性神经球培养的关键技术细节。该操作流程包括：获取E14小鼠胚胎、显微解剖分离脑组织中的神经节隆起区、在神经干细胞培养基中将所获组织解离成单细胞悬液，最后将细胞接种于NSA培养体系中。培养5至7天后，获得的原代神经球可进行传代，以进一步扩增神经干细胞数量，用于后续实验。

本视频方案演示了如何利用神经球实验从胚胎第14天小鼠脑的神经节隆起中分离并扩增神经干细胞。

在哺乳动物中，干细胞作为未分化细胞的来源，在整个生命周期中维持不同组织和器官的细胞生成与更新。

本视频实验方案的目的是利用神经球检测法从小鼠胚胎脑中分离并扩增神经干细胞。该操作步骤包括获取 E14 小鼠胚胎，随后进行脑部显微解剖以分离纹状体隆起区域，将所获组织解离以获得单细胞悬液，最后将细胞接种于神经球培养体系中。大家好，我是来自佛罗里达大学脑研究所 Brent Frennels 博士实验室的 Hassan Ali。今天我将向您展示如何利用神经球检测法，从小鼠胚胎脑组织中建立神经球培养体系。我们实验室常规使用该方法来分离和扩增神经干细胞。好了，让我们开始吧。麻醉一只时间交配的妊娠小鼠。在妊娠第14天，实施颈椎脱位，并用70%乙醇清洗腹部。用大号镊子夹住腹部皮肤，然后用大剪刀剪开皮肤及下方筋膜。为了暴露腹腔和子宫角，取出含有胚胎的子宫角，并将其转移至含有冷HIM的50 ml锥形管中。将子宫组织转移至PC2级生物安全柜后，从50 ml管中移除HIM，并用足量的新鲜冷HIM冲洗组织，以去除血液和毛发等污染物，重复冲洗两到三次。将子宫组织转移至含有冷HIM的10厘米培养皿中。使用小型弯头镊子和剪刀打开子宫角，将胚胎转移至含有冷Hem的新培养皿中。重复此操作，直至所有胚胎均被采集完毕。随后将胚胎置于解剖显微镜下观察。在颈髓水平分离胚胎的头部，并将其转移至另一个含有冷Hem的培养皿中。使用精细的弯镊子夹住头部，并用显微剪刀进行操作。首先在鼻部上方做一水平切口，然后从额头沿中线向头后部继续剪开。务必切开皮肤和颅骨，避免损伤下方的脑组织。使用弯头镊子将切开部位的边缘向后推动，从颅骨中取出脑组织。重复此操作，直至所有脑组织均从颅骨中移除。使用弯头镊子固定脑组织，使背侧朝上，然后用显微剪刀从嗅球开始沿每个半球向后剪开皮层。为暴露神经节隆起，保持脑组织位置稳定，用45度角倾斜的镊子分离出完整的神经节隆起，并将其转移至另一个培养皿中。此处清晰显示了神经节隆起及其内侧和外侧部分。或者，您可以使用精细镊子去除周围组织，分离神经节隆起。您还可以将整个隆起切成内侧和外侧两半，如果您希望培养这些区域的细胞。重复此操作，直至所有脑组织完成显微解剖。使用1毫升神经干细胞培养基收集组织碎片，并转移至15毫升离心管中。让组织团块在15毫升离心管中自然沉降，以确保不残留任何组织。吸除部分上清液，冲洗培养皿底部，将残留的组织转移至15 ml离心管中。将移液器枪头紧贴管底，上下吹打悬液3到4次，以充分解离组织，获得单细胞悬液。静置悬浮液1分钟，使未解离的细胞团块沉淀，将大部分细胞悬液转移至另一支15 ml离心管中。向残留的团块中加入1毫升神经干细胞培养基，将其解离为单个细胞。合并两管中的内容物。然后以700 RPM或110 G离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于1毫升完全神经干细胞培养基中。取10微升细胞悬液，与90微升台盼蓝充分混匀。然后取 10 µL 该悬液，转移至血细胞计数板中，进行细胞计数。

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神经科学

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从出生后（P1–3）小鼠神经发生微环境中分离与扩增神经球

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