Name: 器官型海马切片培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 学习器官型海马切片培养技术，通过解剖、切片、分选和培养步骤，在体外维持海马组织结构和突触连接长达两周。该方法适用于神经科学研究，可扩展至其他脑区，为脑功能与疾病研究提供可靠的实验模型。

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本工作由美国国立神经疾病与卒中研究所（NINDS）- 美国国立卫生研究院（NIH）R01NS060756 项目资助

1. 开始制备海马脑片前的准备。
<ol>
<li>通过放置一片聚四氟乙烯片并安装新刀片来准备组织切片机。</li>
<li>用70%乙醇擦拭组织培养（TC）操作台，并将解剖显微镜放入其中。使用紫外灯对操作台、显微镜、组织切片机及所有解剖器械进行15分钟的灭菌处理。</li>
<li>准备六孔组织培养板。每孔加入750 μL切片培养基（SCM），并在每孔中放置细胞培养插入式培养皿。确保膜完全润湿且下方无气泡。将培养板置于35°C、通入5% CO2的培养箱中备用。</li>
<li>将50 mL低Na+人工脑脊液（ACSF，解剖液）倒入100 mL烧杯中，并将其置于冰盐混合物上。用5% CO2 / 95% O2混合气体对低Na+ ACSF进行通气，直至液体颜色改变，并形成冰浆状的固液混合物（10–20分钟）。</li>
<li>取一只P5–P7日龄的大鼠幼崽。最多可使用三只幼崽。</li>
</ol>
2. 海马切片制备。
<ol>
<li>使用锋利的手术剪剪下动物头部，切开皮肤并暴露颅骨。用小剪刀沿耳间线从一侧到另一侧剪开，再沿矢状缝剪开颅骨。可选择在前部横向剪一刀，以方便去除颅骨并暴露脑组织。迅速用圆头小勺形解剖铲舀出脑组织，放入解剖液冰浆中冷却约 1 分钟。将约 10 mL 冰冷的解剖液倒入 60 mm 培养皿中，并将脑组织从烧杯转移至该培养皿中，确保脑组织完全浸没在解剖液中。</li>
<li>在解剖显微镜下：将脑组织置于 60 mm 培养皿底部，用解剖镊在中线位置固定脑组织。使用海马体解剖工具分离大脑半球，保留中脑部分，使两侧半球的海马体暴露出来。然后用海马体解剖工具轻柔地将海马体舀出，再用解剖针彻底分离海马体，并尽可能清除周围组织。</li>
<li>使用截去尖端的 P1000 滤芯吸头，轻柔吸取海马体，并将其转移至切片机上的聚四氟乙烯（Teflon）片上，使海马体凹面朝下放置。</li>
<li>将海马体垂直于刀片方向排列，以获得冠状切片，并去除多余液体。</li>
<li>以每 400 μm 的间隔对海马体进行切片。</li>
<li>向 60 mm 培养皿中倒入约 10 mL 冷的 SCM 培养基，使用另一截去尖端的 P1000 滤芯吸头和冷 SCM 将切好的海马体切片从切片机转移至培养皿中，注意避免产生气泡。</li>
<li>借助虹膜铲和直铲，轻柔地将各切片彼此分离。</li>
<li>将形态完整、无损伤的切片与受损切片分开。</li>
</ol>
3. 海马切片培养
<ol>
<li>从培养箱中取出含有 SCM 和细胞培养插件的六孔板。借助另一支剪过的 P1000 滤芯吸头，将单个脑片转移至膜上，每张膜放置 4–5 片。注意避免将脑片置于靠近插件壁或彼此过于接近的位置。必要时，使用虹膜铲分离脑片。去除多余培养基。脑片一旦置于膜上，应尽量减少接触。</li>
<li>将培养板放回培养箱，在 35°C 和 5% CO2 条件下继续培养。</li>
<li>在超净台内每 48 小时更换一次 SCM，用巴斯德吸管吸除原有培养基，每孔加入 750 μL 新鲜预热的 SCM。注意确保膜下不产生气泡。</li>
</ol>
4. 溶液
<ol>
<li>低钠+ ACSF - 用于脑片培养的解剖溶液 
去离子无菌 H2O添加： 
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>500 mL</td>
 <td>对于 1000 mL</td>
 <td>终浓度</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CaCl2 (1 M)</td>
 <td>0.5&nbsp; mL</td>
 <td>1 mL</td>
 <td>1 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-葡萄糖</td>
 <td>0.901 g</td>
 <td>1.802 g</td>
 <td>10 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>0.149 g</td>
 <td>0.298 g</td>
 <td>4 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl₂2 (1 M)</td>
 <td>2.5 mL</td>
 <td>5 mL</td>
 <td>5 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaHCO₃3</td>
 <td>1.092 g</td>
 <td>2.184 g</td>
 <td>26 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>蔗糖</td>
 <td>40 g</td>
 <td>80 g</td>
 <td>234 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.5% 酚红溶液（溶于 DPBS）</td>
 <td>0.5 mL</td>
 <td>1 mL</td>
 <td>0.1% v/v</td>
 </tr>
</tbody>
</table> 
混合约30分钟 
通过0.22 μm滤膜过滤灭菌 
分装成50 mL等份，于4 °C保存，时间不超过2个月。</li>
<li>切片培养基（SCM） 
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>500 mL</td>
 <td>对于 1000 mL</td>
 <td>终浓度</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MEM Eagle 培养基</td>
 <td>4.2 g</td>
 <td>8.4 g</td>
 <td>8.4 g/l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>马血清，热灭活</td>
 <td>100 mL</td>
 <td>200 mL</td>
 <td>20%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td>
 <td>2.5 mL</td>
 <td>5 mL</td>
 <td>1 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CaCl2 (1 M)</td>
 <td>0.5 mL</td>
 <td>1 mL</td>
 <td>1 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgSO₄4 (1 M)</td>
 <td>1 mL</td>
 <td>2 mL</td>
 <td>2 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>胰岛素（1 mg/mL），溶于0.01 N HCl中</td>
 <td>0.5 mL</td>
 <td>1 mL</td>
 <td>1 mg/L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>抗坏血酸溶液（25% w/v）</td>
 <td>0.024 mL</td>
 <td>0.048 mL</td>
 <td>0.00125%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-葡萄糖</td>
 <td>1.16g</td>
 <td>2.32g</td>
 <td>13 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaHCO₃3</td>
 <td>0.22g</td>
 <td>0.44g</td>
 <td>5.2 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hepes</td>
 <td>3.58克</td>
 <td>7.16克</td>
 <td>30 mM</td>
 </tr>
</tbody>
</table> 
混合至完全溶解，并恢复至室温。 
用 1 N NaOH 将 pH 值调节至 7.27–7.28 
测量渗透压。用去离子并灭菌的 H 调整至 320 mmol/kg2O. 预计加入约25–40 mL。再次检测渗透压。 
***调节渗透压时pH值可能会发生轻微变化，这是正常的，更重要的是确保渗透压处于正确范围（317–323）。 
通过0.22 μm滤器过滤除菌。 
分装成20 mL等份，在4°C下保存，可存放两到三周。 
谷氨酰胺储备液：配制成200 mM浓度，分装为2.5 mL每份，-20 °C保存。 
抗坏血酸储备液：配制成25%（w/v）浓度，分装为每份100 μL，于-20 °C保存。</li>
</ol>

5. 代表性结果：
在解剖镜下观察，切片应呈白色，无黑色斑点，CA1、CA3和齿状回区域轮廓清晰且无损伤。细菌污染容易通过培养基中移动的黑色小颗粒或SCM出现浑浊来识别。置于显微镜下观察时，切片在培养4天后表面应干净，细胞体清晰可辨。若培养4天后仍无法看到清晰的细胞体，且表面覆盖大量碎片，则表明切片状态不健康。

<ol><li>Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+and+memory%3A+an+evaluation+of+the+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).</li>
<li>Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. ntroduction <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+and+structure+of+the+issue%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation and structure of the issue.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, 607-611 (2003).</li>
<li>Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShepherd%2C+GM+%22The+synaptic+organization+of+the+brain%22">The synaptic organization of the brain</a>. , 5th edn, University Press. Oxford. (2004).</li>
<li>Malinow, R., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+enhancement+shown+by+whole-cell+recordings+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices.</a> Nature. 346, 177-180 (1990).</li>
<li>Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+green+fluorescent+protein+%28GFP%29+into+hippocampal+neurons+through+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Introduction of green fluorescent protein (GFP) into hippocampal neurons through viral infection.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li>
<li>Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-specific+rules+governing+AMPA+receptor+trafficking+to+synapses+in+hippocampal+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons.</a> Cell. 105, 331-343 (2001).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Esteban, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKA+phosphorylation+of+AMPA+receptor+subunits+controls+synaptic+trafficking+underlying+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PKA phosphorylation of AMPA receptor subunits controls synaptic trafficking underlying plasticity.</a> Nat Neurosci. 6, 136-143 (2003).</li>
<li>Mainen, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+in+living+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging in living brain slices.</a> Methods. 18, 231-239 (1999).</li>
<li>Barria, A., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-specific+NMDA+receptor+trafficking+to+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Subunit-specific NMDA receptor trafficking to synapses.</a> Neuron. 35, 345-353 (2002).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Simoni, A. D. e, Griesinger, C. B., Edwards, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+rat+CA1+neurones+in+acute+versus+organotypic+slices%3A+role+of+experience+in+synaptic+morphology+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity.</a> J Physiol. 550, 135-147 (2003).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

该方法基于Stoppini et al. 首次描述的方法11，提供了一种快速培养海马脑片的方式。本方案最关键的环节是保持脑片无菌；因此，必须采用适当的无菌技术，并对所有与组织接触的材料进行正确消毒和灭菌。
不同的血清来源可能影响切片的质量。我们建议先测试多个批次。如果污染问题反复出现，请检查培养箱和组织培养罩是否存在可能的污染源。在整个操作过程中正确使用无菌技术至关重要。
从断头到将脑片放置于膜上并放入培养箱的总时间不应超过1.5小时。如果操作耗时过长，将会影响脑片的存活状态。
将脑片置于多孔膜上，可通过毛细作用形成的薄层 SCM 实现充分的氧气供应和营养供给。该方法可适用于其他脑区，前提是组织密度允许氧气和营养物质充分渗透。因此，组织密度限制了该方法仅适用于较年轻的组织。对于海马组织，来自出生后6至7天（p6-p7）动物的300-400 μm厚脑片似乎可获得最佳结果。此类脑片可通过组织切片机快速制备，从而缩短组织暴露于空气中...

<table><tbody><tr><td>细胞培养小室</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>组织切片机</td><td>Stoelting Co.</td><td>51425/51415</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZX7-ILLD2-100</td><td></td></tr><tr><td>海马体解剖工具</td><td>F.S.T.</td><td>10099-15</td><td></td></tr><tr><td>大型通用剪刀，Perfection</td><td>F.S.T.</td><td>37500-00/37000-00 右/左手型</td><td></td></tr><tr><td>虹膜刮匙</td><td>F.S.T.</td><td>10093-13</td><td></td></tr><tr><td>直型刮匙</td><td>F.S.T.</td><td>10094-13</td><td></td></tr><tr><td>圆头勺状微型刮匙</td><td>VWR international</td><td>57949-039</td><td></td></tr><tr><td>解剖用单刃针头</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72946</td><td></td></tr><tr><td>解剖镊</td><td>Dumont</td><td>#2</td><td></td></tr><tr><td>小型解剖剪刀</td><td>F.S.T.</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>MEM Eagle 培养基</td><td>Cellgro</td><td>50-019 PB</td><td></td></tr><tr><td>马血清（热灭活）</td><td>Invitrogen</td><td>26050-88</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;（1 M）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（1 M）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素（1 mg/ml），溶于 0.01 N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸溶液（25%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr><tr><td>酚红溶液（0.5%，溶于 DPBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;（1 M）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr></tbody></table>

海马组织切片培养

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

海马体是边缘系统的一个组成部分，在长期记忆和空间导航中发挥着重要作用1。海马体神经元在短暂的强烈激活后，能够改变其连接的强度。这种现象被称为长时程增强（long-term potentiation, LTP），可持续数小时至数天，已成为学习与记忆最可能的机制候选者2。此外，海马体结构清晰的解剖学特征及其神经连接性3，使其成为研究突触传递和突触可塑性的经典模型系统4。
随着人们对海马突触生理学的理解不断深入，以及关键分子成分的逐步明确，操控突触蛋白的需求变得愈发迫切。器官型海马体培养技术不仅便于进行基因操作和精确的药理学干预，还能维持突触的组织结构，相较于常规的离体神经元培养方法，更有利于在接近自然的状态下研究突触功能。
本文介绍一种制备和培养海马脑片的方法，该方法可轻松适用于其他脑区。此方法便于通过不同手段（如病毒感染5,6或基因枪转染7）对脑片进行遗传学操作。此外，脑片可方便地回收用于生化检测8，或转移至显微镜下进行成像9或电生理实验10。

我们介绍一种制备海马组织切片的方法，该方法可轻松适用于其他脑区。将脑切片置于多孔膜上，使培养基形成液-气界面。此方法可在培养中维持海马整体结构长达两周。

海马体是边缘系统的一个组成部分，在长期记忆和空间导航中发挥着重要作用1。海马体神经元能够改变……

本实验的总体目标是培养海马区脑片。首先通过解剖分离出海马体，实验的第二步是将海马体切成薄片。该实验步骤的第三步是分离并筛选海马体切片。实验步骤的最后一步是培养海马体切片。最终，可通过解剖镜或显微镜观察，获得显示健康有机海马体切片的结果。大家好，我叫Jimena Opitz，是华盛顿大学Andres Bar博士实验室的一名科研人员。我将在西雅图演示海马体器官型离体培养（organotypic hippocampus, LICs culture）的操作流程。通常，初次接触该方法的研究人员会面临一定困难，原因在于需要快速解剖并切取海马组织，同时必须防止污染，确保无菌解剖溶液和切片培养的洁净条件。培养基可提前最多三周配制，并按照书面方案中的描述在 4 摄氏度下保存。在进行海马脑片培养前，需先准备好培养物。必须对组织培养罩以及解剖过程中将使用的器械进行彻底灭菌。首先，用70%乙醇擦拭组织培养罩的内表面。然后将解剖显微镜和所有解剖器械放入罩内。通过在载物台上放置一张干净的聚四氟乙烯片并安装新刀片，来准备组织切片机。将组织切片机置于超净工作台内，使用紫外灯对所有表面和设备进行15分钟的消毒。紫外消毒程序完成后关闭紫外灯。在超净工作台内进行操作。首先，准备用于培养海马脑片的六孔组织培养板。将750微升SEM加入六孔板的每个孔中。然后使用无菌镊子，将细胞培养插件放入组织培养板的每个孔中。注意操作时不要在插入物下方困住气泡。每个细胞培养插入物的膜必须被脑片培养基润湿，这一点非常重要。如果膜是干燥的，请检查是否存在气泡。如果膜位于 SCM 弯月面之上，可向孔中添加更多培养基。将制备好的培养板放入组织培养箱中，在 35 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育，直至使用。最后，准备一个冰桶，装入冰盐混合物，并将其放置在通风橱内的断头操作区域旁边。取一个100毫升的烧杯，加入解剖液，将烧杯插入冰盐混合物中，并用5%二氧化碳和95%氧气混合气体对溶液鼓泡10至20分钟，直至溶液颜色由粉红色变为橙色。解剖液形成由冷冻和液体溶液组成的浆状混合物。现在，解剖环境和组织培养板已准备好用于解剖。P3至P7包裹。本实验使用幼鼠进行操作。每次可同时制备最多三只幼鼠的脑片培养，本流程将以单只幼鼠为例进行说明。迅速从断头的幼鼠身上取出脑组织，放入盛有100毫升解剖液Slurry Chill的烧杯中，浸泡1分钟。在此期间，向60毫米组织培养皿底部加入约10毫升冰冻解剖液，制备解剖皿。使用圆头小勺或显微铲，将脑组织从100毫升烧杯转移至盛有冷解剖液的60毫米培养皿中。确保脑组织完全浸没于解剖液中。将含有脑组织的培养皿置于解剖显微镜下。通过解剖显微镜观察并定位脑组织。使用无菌解剖镊将脑组织移至视野中央。用解剖镊子夹住脑组织的中线位置，并将其压在培养皿底部。使用海马体解剖工具，轻轻将大脑皮层半球从中脑区域剥离，同时保持中脑原位不动；理想情况下，不要将皮层半球从脑的其他部分完全分离，此时海马体已暴露。取海马体解剖工具，从一侧半球中挖出海马体。然后使用解剖针尽可能清除海马体以外的组织。待第一个海马体分离并清理完毕后，从另一侧半球重复此过程以获取第二个海马体。接下来，使用无菌剪刀剪掉 P 1000 滤芯吸头的尖端。将移液枪吸头安装到无菌的 P 1000 移液枪上。轻柔地吸取一个海马体，并将其移至组织切片机的聚四氟乙烯膜片上。然后以同样方式将第二个海马体放置到切片机上。将海马半球置于其凹面侧，使其与刀片垂直对齐，并用特氟龙片吸去多余液体。将刻度盘或千分尺调至零位。将海马切成400 µm的切片。另取一个剪去尖端的 P 1000 滤芯吸头，安装到无菌的 P 1000 移液器上。将约 10 毫升冷的 SCM 培养基倒入一个 60 毫米的无菌组织培养皿中。使用移液器吸取适量培养基，将海马脑片从切片机转移到培养皿中。在对所有切片重复转移操作后，避免产生气泡，将培养皿置于解剖显微镜下。最后，使用虹膜刮匙和直刮匙，轻轻地将切片彼此分离。将结构完整且无损伤的脑片与受损脑片分离开。结构清晰的海马脑片现已准备好进行培养。从培养箱中取出预先准备好的六孔组织培养板（内含 SCM 培养基和细胞培养插件），使用带有剪去尖端的宽口吸头的 P1000 移液器，将每张膜上转移 4 至 5 个独立脑片。必要时，使用虹膜铲分离切片。注意不要将切片放置得过于靠近插入壁或彼此之间距离过近。小心操作，避免触碰切片，吸去细胞培养上表面多余的培养基。插入膜。最后，将含有海马脑片培养物的培养板放回组织培养箱中，设置温度为35摄氏度，二氧化碳浓度为5%。48 小时后，从组织培养罩内的培养箱中取出培养板。用移液器吸除培养基。每孔加入 750 µL 新鲜预热的 SCM。再次确认细胞培养小室膜下无气泡产生。此为一个健康的海马脑片，已准备好进行培养。海马体的CA1、CA3和齿状回区域清晰可见且未受损伤。图中显示的是一个受损的海马脑片，未用于培养。最后，这是一个海马脑片在培养四天后的健康示例。请注意，该脑片在解剖显微镜下呈白色，且表面洁净。海马体中的 CA1、CA3 和齿状回区域清晰可见且未受损伤。一旦掌握，该技术若操作得当，约需一小时即可完成。在进行该操作时，必须牢记使用适当的类固醇技术，并对组织操作轻柔。观看本视频后，您应能够充分掌握如何培养器官型组织及进行海马组织裂解。感谢您的使用，祝您的实验顺利成功。

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

器官型海马切片培养

器官型海马脑片培养模型是一种用于在多种实验范式中研究神经元损伤的体外模型。本文中，我们描述了制备脑片培养物以及定量神经元损伤的方法。...

用于检测神经元损伤的海马组织切片培养模型

本视频演示了一种从幼鼠脑组织制备海马区器官型脑片培养物的方法。该方法概述了海马体解剖、脑片切割以及培养所需的步骤和条件，旨在促进海马脑片中细胞的存活与生长，最终建立器官型脑片培养体系。...

制备幼年大鼠海马的器官型脑片培养

本文介绍了一种利用前脑和小脑脑片培养系统研究NG2细胞和少突胶质细胞的技术。该方法可在保持组织细胞结构完整性的同时，通过简便地调控细胞外环境，观察少突胶质细胞谱系中细胞增殖与分化的动态过程。...

用于研究少突胶质细胞动态及髓鞘形成的器官型脑片培养技术

配对记录是指对两个突触连接的神经元同时进行全细胞膜片钳记录，从而能够精确地表征单个神经元之间突触的电生理学和药理学特性。本文详细描述了在具备电生理学实验条件的任何实验室中，于海马脑片组织培养上建立该技术的具体方法和所需条件。...

器官型海马切片中的成对全细胞记录

本文介绍了一种内嗅-海马体脑片器官型培养的实验方案，该方法可重现缺血性脑损伤的多个方面。通过在研究神经元变化的同时，对神经血管系统的变化进行观察，该方案成为研究脑损伤后神经组织可塑性变化的多功能工具。...

内侧颞叶-海马器官型脑片培养中神经血管重塑的分析

本文介绍了一种利用脑片组织培养技术研究海马体出生后神经发生的实验方法。该方法可实现 体外...

用于研究出生后神经发生的器官型脑片培养

器官型海马切片培养（OHSC）是一种 体外 模拟的模型 体内...

用于研究肿瘤细胞神经保护作用及侵袭性的海马组织切片器官型培养模型

我们描述了一种在小鼠前脑器官型脑片培养物中实现基因编码的基于FRET的传感器ATeam1.03YEMK细胞类型特异性表达的实验方案。此外，我们展示了如何利用该传感器对神经元和星形胶质细胞中的细胞ATP水平进行动态成像。...

使用基于FRET的传感器ATeam1.03YEMK对小鼠脑组织切片中细胞内ATP进行成像

本文描述了鼻周皮层-海马体脑片的制备方法。在逐步且受控的血清剥夺条件下，这些脑片会表现出逐渐发展的类似癫痫样活动，可被视为一种癫痫发生的离体模型。该系统是监测自发性活动动态变化的优良工具，也可用于评估癫痫发生过程中神经炎症特征的进展。...

内嗅皮层-海马器官型脑片培养中的癫痫发生模型

本方案描述了从小鼠中制备表现出自发尖波涟漪活动的水平海马-内嗅皮层（HEC）切片的方法。切片在简化的界面式孵育室中孵育，并在浸没条件下用快速流动的人工脑脊液进行记录，以促进组织供氧及网络水平自发活动的出现。...

急性小鼠脑切片以研究海马区自发性网络活动

本文旨在描述一种系统性的方案，用于获取小鼠的水平脑切片。该方法的目的是保持海马纤维通路（如穿通通路和苔藓纤维束）的完整性，以评估与齿状回相关的神经过程。...

小鼠脑水平海马切片

学习器官型海马切片培养技术，通过解剖、切片、分选和培养步骤，在体外维持海马组织结构和突触连接长达两周。该方法适用于神经科学研究，可扩展至其他脑区，为脑功能与疾病研究提供可靠的实验模型。

海马组织切片培养

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