海马组织切片培养

本实验的总体目标是培养海马区脑片。首先通过解剖分离出海马体，实验的第二步是将海马体切成薄片。

该实验步骤的第三步是分离并筛选海马体切片。实验步骤的最后一步是培养海马体切片。最终，可通过解剖镜或显微镜观察，获得显示健康有机海马体切片的结果。

大家好，我叫Jimena Opitz，是华盛顿大学Andres Bar博士实验室的一名科研人员。我将在西雅图演示海马体器官型离体培养（organotypic hippocampus, LICs culture）的操作流程。通常，初次接触该方法的研究人员会面临一定困难，原因在于需要快速解剖并切取海马组织，同时必须防止污染，确保无菌解剖溶液和切片培养的洁净条件。

培养基可提前最多三周配制，并按照书面方案中的描述在 4 摄氏度下保存。在进行海马脑片培养前，需先准备好培养物。必须对组织培养罩以及解剖过程中将使用的器械进行彻底灭菌。

首先，用70%乙醇擦拭组织培养罩的内表面。然后将解剖显微镜和所有解剖器械放入罩内。通过在载物台上放置一张干净的聚四氟乙烯片并安装新刀片，来准备组织切片机。

将组织切片机置于超净工作台内，使用紫外灯对所有表面和设备进行15分钟的消毒。紫外消毒程序完成后关闭紫外灯。在超净工作台内进行操作。

首先，准备用于培养海马脑片的六孔组织培养板。将750微升SEM加入六孔板的每个孔中。然后使用无菌镊子，将细胞培养插件放入组织培养板的每个孔中。

注意操作时不要在插入物下方困住气泡。每个细胞培养插入物的膜必须被脑片培养基润湿，这一点非常重要。如果膜是干燥的，请检查是否存在气泡。

如果膜位于 SCM 弯月面之上，可向孔中添加更多培养基。将制备好的培养板放入组织培养箱中，在 35 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育，直至使用。

最后，准备一个冰桶，装入冰盐混合物，并将其放置在通风橱内的断头操作区域旁边。取一个100毫升的烧杯，加入解剖液，将烧杯插入冰盐混合物中，并用5%二氧化碳和95%氧气混合气体对溶液鼓泡10至20分钟，直至溶液颜色由粉红色变为橙色。

解剖液形成由冷冻和液体溶液组成的浆状混合物。现在，解剖环境和组织培养板已准备好用于解剖。P3至P7包裹。

本实验使用幼鼠进行操作。每次可同时制备最多三只幼鼠的脑片培养，本流程将以单只幼鼠为例进行说明。

迅速从断头的幼鼠身上取出脑组织，放入盛有100毫升解剖液Slurry Chill的烧杯中，浸泡1分钟。在此期间，向60毫米组织培养皿底部加入约10毫升冰冻解剖液，制备解剖皿。使用圆头小勺或显微铲，将脑组织从100毫升烧杯转移至盛有冷解剖液的60毫米培养皿中。确保脑组织完全浸没于解剖液中。

将含有脑组织的培养皿置于解剖显微镜下。通过解剖显微镜观察并定位脑组织。使用无菌解剖镊将脑组织移至视野中央。

用解剖镊子夹住脑组织的中线位置，并将其压在培养皿底部。使用海马体解剖工具，轻轻将大脑皮层半球从中脑区域剥离，同时保持中脑原位不动；理想情况下，不要将皮层半球从脑的其他部分完全分离，此时海马体已暴露。取海马体解剖工具，从一侧半球中挖出海马体。

然后使用解剖针尽可能清除海马体以外的组织。待第一个海马体分离并清理完毕后，从另一侧半球重复此过程以获取第二个海马体。接下来，使用无菌剪刀剪掉 P 1000 滤芯吸头的尖端。

将移液枪吸头安装到无菌的 P 1000 移液枪上。轻柔地吸取一个海马体，并将其移至组织切片机的聚四氟乙烯膜片上。然后以同样方式将第二个海马体放置到切片机上。

将海马半球置于其凹面侧，使其与刀片垂直对齐，并用特氟龙片吸去多余液体。将刻度盘或千分尺调至零位。将海马切成400 µm的切片。

另取一个剪去尖端的 P 1000 滤芯吸头，安装到无菌的 P 1000 移液器上。将约 10 毫升冷的 SCM 培养基倒入一个 60 毫米的无菌组织培养皿中。使用移液器吸取适量培养基，将海马脑片从切片机转移到培养皿中。

在对所有切片重复转移操作后，避免产生气泡，将培养皿置于解剖显微镜下。最后，使用虹膜刮匙和直刮匙，轻轻地将切片彼此分离。

将结构完整且无损伤的脑片与受损脑片分离开。结构清晰的海马脑片现已准备好进行培养。从培养箱中取出预先准备好的六孔组织培养板（内含 SCM 培养基和细胞培养插件），使用带有剪去尖端的宽口吸头的 P1000 移液器，将每张膜上转移 4 至 5 个独立脑片。

必要时，使用虹膜铲分离切片。注意不要将切片放置得过于靠近插入壁或彼此之间距离过近。小心操作，避免触碰切片，吸去细胞培养上表面多余的培养基。

插入膜。最后，将含有海马脑片培养物的培养板放回组织培养箱中，设置温度为35摄氏度，二氧化碳浓度为5%。

48 小时后，从组织培养罩内的培养箱中取出培养板。用移液器吸除培养基。每孔加入 750 µL 新鲜预热的 SCM。

再次确认细胞培养小室膜下无气泡产生。此为一个健康的海马脑片，已准备好进行培养。海马体的CA1、CA3和齿状回区域清晰可见且未受损伤。

图中显示的是一个受损的海马脑片，未用于培养。最后，这是一个海马脑片在培养四天后的健康示例。请注意，该脑片在解剖显微镜下呈白色，且表面洁净。

海马体中的 CA1、CA3 和齿状回区域清晰可见且未受损伤。一旦掌握，该技术若操作得当，约需一小时即可完成。

在进行该操作时，必须牢记使用适当的类固醇技术，并对组织操作轻柔。观看本视频后，您应能够充分掌握如何培养器官型组织及进行海马组织裂解。

感谢您的使用，祝您的实验顺利成功。