Name: 双链DNA定量，使用日立F - 7000荧光分光光度计和PicoGreen染料 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 学习使用日立F-7000荧光分光光度计和PicoGreen染料进行双链DNA定量分析。该方法可建立线性标准曲线，实现高通量、高灵敏度的DNA精确定量，适用于各类生物学研究中的DNA浓度测定需求。

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1. 仪器设置
<ol>
 <li>打开荧光分光光度计，并预热1小时。</li>
 <li>使用Excel创建一个包含标准品和样品数据的文件，如图1所示，并将其保存为逗号分隔值（csv）格式。 
 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig1.jpg" alt="以电子表格格式显示的标准品和样品浓度数据表（单位：mg/ml）" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图1"> 
 图1. 标准品与样品数据。 
 
 </li>
 <li>按以下步骤设置荧光分光光度计：
 <ol>
 <li>点击 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon1.jpg" alt="代表实验室分析技术的流程图图标，包含试管和色谱图" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图标1"> 按钮，将打开“分析方法”窗口，如图2所示。 
 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig2.jpg" alt="F-7000 FL荧光分光光度计上的光度法设置；光谱分析的数据输入界面" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图2"> 
 图2. 分析方法窗口，通用选项卡。 
 
 进行以下设置：
 <ul>
 <li>在“测量”字段中，从下拉菜单中选择“光度法”。</li>
 <li>在“操作员”字段中，输入相应操作员的姓名。</li>
 <li>“仪器”字段无需填写，软件将自动选择。</li>
 <li>使用微孔板读板仪时，“采样”字段不可用。</li>
 <li>在“备注”字段中输入您希望包含在报告中的任何注释。</li>
 <li>在“附件”字段中，输入本次测试所用附件的相关信息。</li>
 <li>注意窗口右侧的按钮。</li>
 <li>“加载”按钮用于加载先前保存的分析方法。</li>
 <li>“保存”按钮用于更新一组已保存并加载的测试参数或分析方法，并使用相同名称覆盖原文件。</li>
 <li>“另存为”按钮允许将一组新的测试参数或分析方法以指定名称保存。</li>
 </ul>
 现在点击“定量”选项卡，见图3，并进行以下设置。 
 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig3.jpg" alt="波长分析的定量方法设置；校准和浓度参数输入" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图3"> 
 图3. 分析方法窗口，定量选项卡。 
 <ul>
 <li>在“定量类型”字段中，选择“波长”。这表示将使用选定波长进行荧光读数。</li>
 <li>在“校准类型”字段中，选择1st阶。</li>
 <li>在“波长数量”字段中，选择1。</li>
 <li>在“浓度单位”字段中，输入ng/mL。</li>
 <li>不要勾选“手动校准”和“强制曲线过零点”复选框。</li>
 <li>在“小数点后位数”字段中，选择2。</li>
 <li>在“最低浓度限值”字段中，输入0。</li>
 <li>在“最高浓度限值”字段中，输入10000。</li>
 </ul>
 
 现在点击“仪器”选项卡，并进行以下设置。 
 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig4.jpg" alt="荧光数据分析方法界面；光谱参数设置，发射/激发选项" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图4"> 
 图4. 分析方法窗口，仪器选项卡 
 <ul>
 <li>在“数据模式”字段中，选择“荧光”。</li>
 <li>“斩波速度”字段当前不可用，仅用于磷光测量。</li>
 <li>在“波长模式”字段中，选择“Both WL fixed”（双波长固定）。</li>
 <li>在“EX / WL1”字段中输入480nm。</li>
 <li>在“EM / WL1”字段中输入520nm。</li>
 <li>EX和EM下的所有其他字段当前均不可用。</li>
 <li>在“EX狭缝”字段中，从下拉菜单中选择5.0nm。</li>
 <li>在“EM狭缝”字段中，从下拉菜单中选择5.0nm。</li>
 <li>不要勾选“PMT电压 1-1000V”字段前的复选框。</li>
 <li>在“PMT电压”字段中，从下拉菜单中选择700V。</li>
 <li>在“自动统计计算次数”字段中选择2。</li>
 <li>在“重复次数”字段中选择1。</li>
 <li>在“积分时间”字段中选择0.1s。</li>
 <li>在“延迟”字段中输入或选择0s。</li>
 </ul>
 点击“监测”选项卡。 
 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig5.jpg" alt="分析方法设置对话框；数据处理软件中的Y轴限值设置" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图5"> 
 图5. 分析方法窗口，监测选项卡。 
 <ul>
 <li>在“Y轴”、“最大值”字段中，选择10000。</li>
 <li>在“Y轴”、“最小值”字段中，选择0。</li>
 <li>勾选“数据采集后打开数据处理”左侧的复选框。</li>
 <li>除非您希望在读数完成后自动打印报告，否则不要勾选“数据采集后打印报告”左侧的复选框。</li>
 </ul>
 点击“报告”选项卡，见图6。 
 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig6.jpg" alt="报告打印的分析方法设置；包括数据、方法、校准曲线选项" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图6"> 
 图6. 分析方法窗口，报告选项卡。 
 <ul>
 <li>在“输出”字段中，从下拉菜单中选择“打印报告”。如果您希望将数据导出到Excel，也可以选择“使用Microsoft Excel”；如果使用可选附加程序“报告生成器”以生成自定义报告，则选择“使用打印生成器表格”。</li>
 <li>勾选您希望包含在报告中的项目对应的复选框。</li>
 <li>要保存“分析方法”窗口各个选项卡中选定的所有参数，请再次点击“通用”选项卡，将这些参数以文件名保存在便于日后查找的位置，然后点击“确定”按钮关闭此窗口。</li>
 <li>至此，仪器测试参数设置完成。</li>
 <li>接下来我们将设置微孔板读板仪。</li>
 <li>点击 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon2.jpg" alt="用于科学研究中数据可视化与分析的MPR软件图标" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图标2"> 按钮，将调出MPR设置窗口并置于顶层。</li>
 </ul>
 在MPR设置窗口的“板”选项卡中，为标准品和样品选择孔位，如图7所示。 
 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig7.jpg" alt="用于微孔板分析的MPR设置窗口示意图，突出显示样品位置调整" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图7"> 
 图7. MPR设置窗口，板选项卡。 
 <ul>
 <li>点击A1位置并拖动鼠标至E1，然后点击 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon3.jpg" alt='软件用户界面中标记为“标准品设置”的按钮' data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图标3"> 按钮。这将选定用于标准品的孔位，这些孔位将以绿色高亮显示。</li>
 <li>现在需要为样品选择F1至H3的孔位。从F1位置开始拖动鼠标至H3位置，然后点击 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon4.jpg" alt='标记为“样品设置”的按钮，用于选择或输入选项' data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图标4"> 按钮，这些孔位将以黄色高亮显示。</li>
 <li>然后对A2至E3位置重复相同操作，以选定用于样品测量的孔位。</li>
 <li>现在，加载预先准备好的包含标准品和样品信息的逗号分隔变量（csv）文件。</li>
 </ul>
 点击“MPR设置窗口”中的“孔信息”选项卡，如图8所示。 
 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig8.jpg" alt="用于96孔板样品定位的MPR设置示意图，突出显示初始孔坐标" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图8"> 
 图8. MPR设置窗口，孔信息选项卡。 
 <ul>
 <li>然后点击 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon5.jpg" alt='石油工程软件中用于数据库访问的“加载孔信息”UI按钮' data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图标5"> 按钮。将打开一个Windows资源管理器窗口，如图9所示，可用于定位“孔信息.csv”文件并加载。 
 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig9.jpg" alt="MPR设置窗口；用于荧光分析的DNA输入，显示从CSV文件导入数据" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图9"> 
 图9. 加载孔样品信息。 
 加载“孔信息”文件后，“孔信息”界面将如图10所示。 
 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig10.jpg" alt="用于荧光分析的微孔板读板仪设置界面，显示浓度数据" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图10"> 
 图10. 已加载的样品孔信息。 
 </li>
 </ul>
 </li>
 </ol>
 </li>
</ol>
2. Picogreen 检测样品制备
<ol>
 <li>通过将1 mL 20 X TE缓冲液加入19 mL去离子H2O中，制备1X TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA）。</li>
 <li>通过将50 μL 200 X PicoGreen试剂加入9.95 mL 1 X TE缓冲液中，制备PicoGreen试剂溶液。</li>
 <li>通过将双链DNA标准品（Lambda dsDNA）原液（100 μg/mL）进行系列稀释，制备标准溶液。首先，将25 μL双链DNA原液（100 μg/mL）与25 μL 1 X TE缓冲液混合，配制50 μg/mL的双链DNA溶液。然后，按照下表所列体积，将双链DNA溶液与缓冲液混合，制备标准溶液：
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>双链DNA浓度</td>
 <td>双链DNA体积</td>
 <td>缓冲液体积</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 μg/mL</td>
 <td>20 μL的50 μg/mL双链DNA</td>
 <td>980 μL 1 X TE缓冲液</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.1 μg/mL</td>
 <td>100 μL的1 μg/mL双链DNA</td>
 <td>900 μL 1 X TE缓冲液</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.01 μg/mL</td>
 <td>100 μL的0.1 μg/mL双链DNA</td>
 <td>900 μL 1 X TE缓冲液</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.001 μg/mL</td>
 <td>100 μL的0.01 μg/mL双链DNA</td>
 <td>900 μL 1 X TE缓冲液</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </li>
</ol>
3. 标准品和样品荧光的测定
<ol>
 <li>按照图7所示及下表，将每种标准品各150 μL加入96孔板的A1-E1孔中：
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>孔</td>
 <td>标准品</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>A1</td>
 <td>1 μg/mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B1</td>
 <td>0.1 μg/mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C1</td>
 <td>0.01 μg/mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D1</td>
 <td>0.001 μg/mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E1</td>
 <td>1 X TE Buffer</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </li>
 <li>将未知样品各150 μL加入图7所示的F1至H3孔中</li>
 <li>将步骤1.2中配制的PicoGreen溶液倒入适用于多通道移液器的槽中。使用多通道移液器向A1-H3孔中每孔加入150 μL PicoGreen溶液。用移液器轻轻混匀溶液与标准品。</li>
 <li>将板置于避光处，静置2-5分钟以使反应显色。</li>
</ol>
4. 代表性结果
通过F-7000软件在测定标准品并由软件计算校准曲线后所提供的不同参数，可对校准曲线的质量进行评估。
决定系数反映了测定标准品与计算所得校准曲线的拟合优度。该值越接近“1”，表示测定值与校准曲线的拟合程度越好。
如果该值远偏离“1”，则必须重新测量标准品、重新配制，或调整校准曲线的拟合方式。
图11显示了使用PicoGreen染料对dsDNA进行定量时获得的标准曲线示例，其计算得到的决定系数= 0.99993。
<img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig11.jpg" alt="标准校准曲线，一阶线性回归，ng/ml，浓度分析，R²=0.999。" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图11"> 
 图11. 双链DNA校准曲线示例。

<ol><li>Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+PicoGreen+reagent+and+development+of+a+fluorescence-based+solution+assay+for+double-stranded+DNA+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.</a> Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).</li>
</ol>

Luis A. Moreno 和 Kendra L. Cox 供职于生产本文所用仪器的美国日立高新技术公司。

在样品制备过程中仔细移液，以及使用稳定且灵敏的荧光分光光度计，对于获得良好且可重复的结果至关重要。
对于本实验所用的荧光分光光度计，建议在微孔板读板仪中使用300 μL的最终样品体积。样品体积过低会降低检测灵敏度，而体积过大则可能导致孔与孔之间的交叉污染。

<table><tbody><tr><td>蒸馏水 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Quant-iT Picogreen dsDNA 定量检测试剂盒</td><td>试剂</td><td></td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Nalge Nunc 荧光微孔板，货号 237108</td><td>耗材</td><td></td><td>237108</td><td></td></tr><tr><td>12 通道 Eppendorf 移液器</td><td>耗材</td><td></td><td>3516677</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;L Eppendorf 移液器</td><td>耗材</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L Eppendorf 移液器</td><td>耗材</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>耗材</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>耗材</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>耗材</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hitachi F-7000 荧光分光光度计，配备 FL Solutions 2.1 软件</td><td>设备</td><td></td><td>5J1-0003</td><td></td></tr><tr><td>F-7000 荧光分光光度计用微孔板读板附件</td><td>设备</td><td></td><td>5J0-0139</td><td></td></tr></tbody></table>

使用日立f-7000荧光分光光度计和picogreen染料定量双链dna

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

DNA的定量，尤其是在低浓度条件下的定量，是一项具有广泛应用的重要任务，涉及多种生物学应用，包括标准分子生物学实验（如DNA的合成与纯化）、诊断应用（如DNA扩增产物的定量）以及药物制剂中DNA分子的检测。在本视频中，我们将演示配备微孔板读板附件的日立F-7000荧光分光光度计，利用Molecular Probes Quant-it PicoGreen染料试剂盒进行双链DNA（dsDNA）定量的能力。
F-7000 荧光分光光度计可提供高灵敏度和高速测量。该系统具有高度灵活性，能够测量荧光、化学发光和磷光。提供多种测量模式，包括波长扫描、时间扫描、光度测量和三维扫描测量。当在微孔板中使用 300 μL 样品体积时，该仪器对荧光素的检测灵敏度可达 50 皮摩尔，并可实现最高 60,000 nm/分钟的扫描速度。其动态范围宽达五个数量级，可在较宽浓度范围内使用校准曲线。光学系统采用全反射式光学元件，以实现最大能量和最高灵敏度。标准波长范围为 200 至 750 nm，若选用可选的近红外光电倍增管，波长范围可扩展至 900 nm。系统可通过可选的外部温控液体循环器，实现对微孔板读板仪的温度控制，控温范围为 5 至 60 摄氏度。微孔板读板仪支持 96 孔微孔板，使用动力学模式时，96 个孔的测量时间少于 60 秒。
F-7000 和酶标仪的软件控制功能也具有高度灵活性。样品可按列或行格式设置，且可任意选择多个孔位进行样品检测，从而实现对微孔板的最佳利用。此外，该软件支持导入在 Excel 中创建并以逗号分隔值（即“csv”格式）保存的微孔板样品配置文件。微孔板的检测配置可由软件保存并随时调用，便于操作并提高工作效率。检测数据结果可输出为标准报告、Excel 文件，或导入可选的报告生成程序。

使用 Molecular Probes PicoGreen 染料和配备微孔板读板附件的日立 F-7000 荧光分光光度计对双链 DNA 进行定量检测的演示。

使用日立F-7000荧光分光光度计和PicoGreen染料定量双链DNA

DNA 定量，尤其是在低浓度条件下的定量，是一项具有广泛应用的重要任务，涉及标准分子生物学等多个生物领域……

本实验的总体目标是展示配备微孔板读板仪的F 7,000荧光分光光度计利用Pico Green染料进行双链DNA定量的能力。首先需准备样品和试剂，然后进行仪器设置。该实验步骤的第三步是将样品加入到微孔板读数仪中。最后一步是进行标准品和样品的测量。最终可获得显示线性校准曲线的结果，该曲线可用于未知样品的双链DNA定量。打开日立F 7,000型荧光分光光度计，使氙灯在Excel中预热一小时。创建一个包含标准品和样品数据的文件，并将其保存为逗号分隔值（CSV）格式。首先设置荧光分光光度计，点击“方法”按钮，打开分析方法窗口。在测量字段中，从下拉菜单中选择光度法。然后点击定量选项卡。在定量类型字段中，选择波长，以表明荧光读数将使用指定波长进行。校准类型选择一阶，波长数量选择一个。浓度单位输入“纳克每毫升”。确保不勾选“手动校准”和“强制曲线过零点”选项。小数点后位数选择两位，下限浓度输入0，上限浓度输入10,000。接下来，单击仪器选项卡，在数据模式字段中选择荧光。确认斩波速度字段处于非活动状态，因为它仅用于磷光测量。在波长模式字段中，选择“激发波长固定”选项，在发射波长一栏中输入 480 纳米。输入520纳米。将激发（EX）和发射（EM）下的所有其他字段保持为非活动状态。将激发狭缝和发射狭缝均设置为5.0纳米。使用下拉菜单，保持光电倍增管电压前方的复选框未选中状态，电压值设为 1000 伏特。对于光电倍增管电压，从下拉菜单中选择 700 伏特。同时，选择自动统计计算次数为 2，重复次数为 1，积分时间为 0.1 秒，延迟为 0。现在打开“监测”选项卡，将 Y 轴最大值字段设为 10,000，Y 轴最小值设为 0。然后选中“数据采集后打开数据处理”左侧的复选框，如有需要，还可选中“数据采集后打印报告”左侧的复选框，以便在读数完成后自动打印报告。最后，为保存分析方法窗口各个选项卡中所有已选参数，请点击“常规”选项卡，并在指定位置以新文件名保存。单击确定按钮以关闭此窗口。至此，仪器测试参数设置完成。为设置酶标仪，请单击 MPR 按钮，使 MPR 设置窗口显示在前端。首先选择标准品的孔位。例如，点击 A1 位置并拖动鼠标至 E1。然后点击标准品设置按钮。这将选择用于标准品的位置，这些位置会以绿色高亮显示。然后选择样本的位置。同样，点击并拖动鼠标覆盖板上相应的位置，然后点击样本集按钮，系统将自动以黄色高亮显示所选位置。继续对需要测量的样品位置重复相同操作。将标准品和样品信息载入先前准备好的逗号分隔变量文件中。单击 MPR 设置窗口中的孔信息标签。单击加载孔信息按钮，将打开一个 Windows 资源管理器窗口，用于选择孔信息点 csv 文件。加载信息后，窗口应以表格形式显示。为配制 Pico Green 染料的工作液，将 50 µL 的 200 X Pico Green 染料加入 9.95 mL 的 TE 缓冲液中。对于标准曲线，用 TE 缓冲液对 Lambda 双链 DNA 进行系列稀释，得到终浓度为 1 至 100 纳克/毫升的稀释液；将每种标准品各 150 微升加入 96 孔板中指定的孔内。接着，将每种待测样品各 150 微升加入板中相应的指定孔内。然后使用多通道移液器向每个孔中加入 150 微升 PicoGreen 溶液，并混匀溶液与 DNA 样品。将酶标板置于避光处，轻轻孵育 2 至 5 分钟，使反应充分显色。点击 MPR 显示屏上的按钮，调出 MPR 设置窗口，然后点击“交换位置”按钮。微孔板承载平台将移至仪器前方，自动打开微孔板读板仪的门，将 96 孔板放置在承载平台上，确保 A1 孔朝向仪器前方，随后关闭微孔板读板仪的门。单击初始位置按钮，将微孔板中的位置A移至测量位置。单击监视器显示按钮，使测量窗口显示在屏幕上方。单击测量按钮，开始测量标准品和未知样品。良好的标准曲线可通过F 7,000软件提供的不同参数进行评估。例如，使用Pico Green染料对双链DNA进行定量所获得的该理想标准曲线，其计算得到的决定系数为0.99993。所描述的高通量系统是一系列技术的串联组合，包括Pico Green染料、配备微孔板读板器的Hitachi F 7,000荧光分光光度计，以及用于自动化数据采集、存储、分析和呈现的软件程序。多种强大技术的结合能够满足对少量双链 DNA 进行精确分析的日益增长的需求。

quantification-dsdna-using-hitachi-f-7000-fluorescence

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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