双链DNA定量，使用日立F - 7000荧光分光光度计和PicoGreen染料
2010年11月5日
示范的dsDNA定量使用分子探针PicoGreen染料和日立F - 7000型荧光分光光度计，配备酶标仪配件。
本实验的总体目标是展示配备微孔板读板仪的F 7,000荧光分光光度计利用Pico Green染料进行双链DNA定量的能力。首先需准备样品和试剂，然后进行仪器设置。
该实验步骤的第三步是将样品加入到微孔板读数仪中。最后一步是进行标准品和样品的测量。最终可获得显示线性校准曲线的结果，该曲线可用于未知样品的双链DNA定量。
打开日立F 7,000型荧光分光光度计，使氙灯在Excel中预热一小时。创建一个包含标准品和样品数据的文件，并将其保存为逗号分隔值（CSV）格式。首先设置荧光分光光度计，点击“方法”按钮，打开分析方法窗口。
在测量字段中，从下拉菜单中选择光度法。然后点击定量选项卡。在定量类型字段中，选择波长，以表明荧光读数将使用指定波长进行。
校准类型选择一阶，波长数量选择一个。浓度单位输入“纳克每毫升”。确保不勾选“手动校准”和“强制曲线过零点”选项。小数点后位数选择两位，下限浓度输入0，上限浓度输入10,000。
接下来，单击仪器选项卡，在数据模式字段中选择荧光。确认斩波速度字段处于非活动状态，因为它仅用于磷光测量。在波长模式字段中，选择“激发波长固定”选项，在发射波长一栏中输入 480 纳米。
输入520纳米。将激发（EX）和发射（EM）下的所有其他字段保持为非活动状态。将激发狭缝和发射狭缝均设置为5.0纳米。
使用下拉菜单，保持光电倍增管电压前方的复选框未选中状态，电压值设为 1000 伏特。对于光电倍增管电压，从下拉菜单中选择 700 伏特。同时，选择自动统计计算次数为 2，重复次数为 1，积分时间为 0.1 秒，延迟为 0。
现在打开“监测”选项卡，将 Y 轴最大值字段设为 10,000，Y 轴最小值设为 0。然后选中“数据采集后打开数据处理”左侧的复选框，如有需要，还可选中“数据采集后打印报告”左侧的复选框，以便在读数完成后自动打印报告。最后，为保存分析方法窗口各个选项卡中所有已选参数，请点击“常规”选项卡，并在指定位置以新文件名保存。
单击确定按钮以关闭此窗口。至此，仪器测试参数设置完成。为设置酶标仪，请单击 MPR 按钮，使 MPR 设置窗口显示在前端。
首先选择标准品的孔位。例如，点击 A1 位置并拖动鼠标至 E1。然后点击标准品设置按钮。
这将选择用于标准品的位置，这些位置会以绿色高亮显示。然后选择样本的位置。同样，点击并拖动鼠标覆盖板上相应的位置，然后点击样本集按钮，系统将自动以黄色高亮显示所选位置。
继续对需要测量的样品位置重复相同操作。将标准品和样品信息载入先前准备好的逗号分隔变量文件中。单击 MPR 设置窗口中的孔信息标签。
单击加载孔信息按钮，将打开一个 Windows 资源管理器窗口，用于选择孔信息点 csv 文件。加载信息后，窗口应以表格形式显示。为配制 Pico Green 染料的工作液，将 50 µL 的 200 X Pico Green 染料加入 9.95 mL 的 TE 缓冲液中。
对于标准曲线，用 TE 缓冲液对 Lambda 双链 DNA 进行系列稀释，得到终浓度为 1 至 100 纳克/毫升的稀释液；将每种标准品各 150 微升加入 96 孔板中指定的孔内。接着，将每种待测样品各 150 微升加入板中相应的指定孔内。然后使用多通道移液器向每个孔中加入 150 微升 PicoGreen 溶液，并混匀溶液与 DNA 样品。
将酶标板置于避光处，轻轻孵育 2 至 5 分钟，使反应充分显色。点击 MPR 显示屏上的按钮，调出 MPR 设置窗口，然后点击“交换位置”按钮。微孔板承载平台将移至仪器前方，自动打开微孔板读板仪的门，将 96 孔板放置在承载平台上，确保 A1 孔朝向仪器前方，随后关闭微孔板读板仪的门。
单击初始位置按钮，将微孔板中的位置A移至测量位置。单击监视器显示按钮，使测量窗口显示在屏幕上方。单击测量按钮，开始测量标准品和未知样品。
良好的标准曲线可通过F 7,000软件提供的不同参数进行评估。例如，使用Pico Green染料对双链DNA进行定量所获得的该理想标准曲线，其计算得到的决定系数为0.99993。所描述的高通量系统是一系列技术的串联组合，包括Pico Green染料、配备微孔板读板器的Hitachi F 7,000荧光分光光度计，以及用于自动化数据采集、存储、分析和呈现的软件程序。
多种强大技术的结合能够满足对少量双链 DNA 进行精确分析的日益增长的需求。
概述
本文演示了使用PicoGreen染料和带有微孔板读板功能的日立F-7000荧光分光光度计对双链DNA（dsDNA）进行定量分析。该方法详细说明了样品制备、仪器设置和测量过程，以获得用于dsDNA定量的线性校准曲线。
关键研究组成部分
科学领域
- 荧光光谱法
- DNA 定量
- 微孔板读板机技术
背景
- PicoGreen 染料是一种用于定量双链 DNA 的高灵敏度荧光染料。
- 日立 F-7000 是一种多功能荧光分光光度计。
- 准确的 DNA 定量对于多种生物学实验至关重要。
- 高通量系统可同时分析多个样品，提高检测效率。
研究目的
- 演示F-7000分光光度计在双链DNA定量中的能力。
- 建立一种可靠的未知DNA样品测定方法。
- 绘制线性校准曲线以实现准确定量。
使用的方法
- 配制PicoGreen试剂和DNA标准品。
- 设置日立F-7000分光光度计参数。
- 将样品加入微孔板读板仪中。
- 测定荧光以生成标准曲线。
主要结果
- 建立了用于双链DNA定量的线性校准曲线。
- 该方法表现出高灵敏度和高准确性。
- 结果显示测定系数为0.99993。
- 该系统可有效分析微量双链DNA。
结论
- PicoGreen 染料与 F-7000 分光光度计相结合，为 DNA 定量提供了一种可靠的检测方法。
- 这种高通量方法能够满足生物研究中对精确分析的需求。
- 该方法可应用于各种需要精确 DNA 测量的研究。
常见问题
执行层面的行业相关性
双链DNA的准确定量是生物制药研发中靶点验证、检测方法开发和临床前模型构建的基础要求。采用PicoGreen染料的Hitachi F-7000荧光分光光度计可实现对dsDNA的高灵敏度、高通量检测，支持下游应用所需可靠标准曲线的生成。该方法可提高核酸定量的预测可信度，降低早期发现研究流程中的变异度，从而在化合物筛选和生物标志物研究中实现可扩展且可重复的数据生成。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：可精确测定双链DNA浓度，适用于克隆、转染及基于PCR的靶标验证实验。
- 操作价值：支持可重复的样品制备与定量，降低假设驱动实验中的技术变异性。
- 预测价值：生成具有高决定系数（R² > 0.999）的线性校准曲线，确保在靶标结合研究中对未知样品进行准确定量。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：提供与96孔板格式兼容的定量荧光读数，适用于检测标准化和试剂滴定。
- 操作价值：使用动力学模式可在60秒内快速完成96个孔的测量，支持高通量筛选的准备工作。
- 可扩展性：软件支持保存和调用微孔板配置，便于不同团队和项目间保持检测设置的一致性。
转化与临床前研究
- 转化连续性：为生物标志物分析、PCR 验证以及临床前模型中的载体生产提供可靠的双链 DNA 定量。
- 风险降低：高灵敏度（50 皮摩尔荧光素当量）和宽动态范围（5 个数量级）可实现稀释系列中准确的定量，降低低丰度靶标的假阴性结果。
- 工作流程整合：将数据输出为 Excel 或报告格式，便于无缝转移至生物信息学和分析流程。
流程与工作流整合
该方法适用于从早期靶点验证到先导化合物鉴定直至临床前开发的整个发现过程，在此过程中，准确的核酸定量对于实验可重复性和数据完整性至关重要。
- 发现生物学：通过实现对双链DNA的精确测量，支持克隆效率、基因表达分析和诱变研究中的假设验证。
- 筛选：提供可重复的定量荧光输出，支持提高检测的稳健性以及化合物文库的标准化。
- 分析：生成线性校准曲线和决定系数（R²），可用于实验间数据比较和质量控制。
- 转化医学研究：通过对药物制剂、病毒载体和生物标志物检测中的DNA进行可靠定量，实现与临床前研究的衔接。
- 企业级复用：可配置的软件和标准化操作流程支持跨部门复用，减少方法重新开发，提高运行效率。
运营与企业影响
- 科学价值：对双链DNA具有高灵敏度和高特异性，可减少假阳性信号，提高分子检测中数据的可信度。
- 操作价值：通过软件实现数据的自动采集、存储和呈现，最大限度减少人工操作和转录错误。
- 战略价值：可靠的定量结果支持在先导化合物优化过程中做出推进或终止决策，确保功能检测中的准确给药和标准化。
- 项目组合影响：通过提供可靠的核酸数据，支持候选分子筛选和制剂研究中的风险调整优先级排序。
实施注意事项
- 需要熟悉荧光光谱法和微孔板读板仪的操作。
- 需要配备带有微孔板读板附件及兼容软件的Hitachi F-7000分光光度计。
- 要求标准化试剂配制（PicoGreen在TE缓冲液中的稀释）和样品处理，以避免荧光淬灭。
- 需优化孵育时间（避光孵育2–5分钟）和波长设置（激发波长480 nm，发射波长520 nm），以确保信号一致性。
- 存在一些实际限制，例如需要避光孵育，以及可能受到污染物或有机溶剂的干扰。
