Name: 通过注射和电穿孔的斑马鱼Otocyst的MIF Morpholinos直接运抵影响内耳发展 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-07T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 学习通过显微注射和电穿孔技术将吗啉寡核苷酸直接递送至斑马鱼耳囊的方法，用于研究内耳发育和神经发生。该技术可特异性分析基因功能，避免对脑组织的非特异性影响。

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本工作获得了聋病研究基金会向 Y-c S 提供的资助以及美国国家科学基金会（NSF，项目号 IOS 0930096）向 KFB 提供的资助。 KFB：美国国立卫生研究院/国家耳聋与其他沟通障碍研究所（NIH/NINDCD）2 RO1 DC04184，<a href="https://commons.era.nih.gov/commons/genericStatus.do?actionRole=nonPI&amp;applID=7854446&amp;uhf-token=Ugf7JvudZTCbTUW9jSAR1snMUgg%3D">3R01DC004184-08W1</a>，NSF DBI 0832862，NSF IOS 0930096

1. 制备电穿孔电极
<ol>
<li>剪取适当长度（约 3-5 cm）的 75 μm 直径钨丝（A-M Systems, Inc. Carlsborg, WA）</li>
<li>将钨丝穿过 Molex 电缆连接器（引脚为冲压黄铜材质）</li>
<li>用热缩管（SPC Technology, Chicago, IL）包裹钨丝与 Molex 电缆连接器，并使用本生灯或热风枪加热，使热缩管紧固在导线上</li>
<li>为 sharpen 钨丝尖端，将钨丝浸入 1.0 N 氢氧化钠溶液（Conrad et al. 1993），以回形针作为另一电极，使用方波电穿孔仪进行电解。我们采用的条件为：5 次 50 伏脉冲，每次持续 100 ms，脉冲间间隔 50 ms。电极尖端应 sharpen 至直径 15–20 μm</li>
<li>在用于电穿孔前，将钨丝存放于模型黏土压出凹槽的托盘中保存</li>
</ol>
2. 设置电穿孔工作站
<ol>
<li>将打磨好的 75μm 钨电极固定在显微操作器上（World Precision Instruments）。</li>
<li>将显微操作器置于解剖显微镜载物台（Leica）两侧。</li>
<li>将电极连接至 Protect CUY-21 Edit 方波电穿孔仪（图 1）。</li>
<li>打开电穿孔仪，设置电穿孔参数，包括电压、脉冲持续时间和脉冲次数。本实验中最有效的参数为：3 次 13 伏特脉冲，每次持续 5.0 毫秒，脉冲间隔 100 毫秒。若电穿孔在胚胎中产生气泡，应缩短脉冲时长。</li>
</ol>
3. 向斑马鱼耳囊显微注射吗啉代寡核苷酸
<ol>
<li>从繁殖缸中收集斑马鱼胚胎。将胚胎置于含有0.3 PPM亚甲蓝的胚胎培养液中，在28.5°C条件下过夜孵育（Westerfield, 2005）。</li>
<li>使用Sutter P-97电极拉制仪拉制玻璃针。</li>
<li>将琼脂糖凝胶基质（含1%琼脂糖的鱼用水，置于10 mm培养皿中）在水浴中加热至37°C。</li>
<li>将1%低熔点琼脂糖（LMPA）在鱼用水中加热至完全融化，并保持在37°C水浴中保温。</li>
<li>用吗啉寡核苷酸溶液（GeneTools, Corvallis, OR）填充玻璃针，剪切针尖至合适直径。将注射针安装到显微操作器（Kuhn）上。</li>
<li>将针尖剪切至约10 μm，并插入矿物油中测试，确保针尖可充分输送吗啉寡核苷酸溶液。</li>
<li>在受精后24小时（hpf）去除胚胎的绒毛膜，并用含0.3 PPM亚甲蓝的鱼用水中的MS222（三卡因，Sigma）麻醉胚胎。</li>
<li>将3至5个麻醉后的胚胎整齐排列在琼脂糖凝胶基质上，保持胚胎右侧朝上，以便进行一致且方便的观察分析。</li>
<li>在每个胚胎上方滴加1至2滴1% LMPA，待其凝固以固定胚胎位置。</li>
<li>旋转培养皿，使耳囊位于右侧。</li>
<li>将注射针插入耳囊腔内，使用连接氮气罐的PV820气动皮升注射泵（World Precision Instruments）注入吗啉寡核苷酸溶液（图2）。</li>
</ol>
4. 电穿孔实验步骤
<ol>
<li>注射后立即将固定好的胚胎转移至电穿孔工作站</li>
<li>将正极电极放置在耳泡后方的组织上，但不要刺入；将负极电极插入耳泡前方的脑组织中</li>
<li>通过脚踏开关或手动按压开关施加电流</li>
<li>将鱼用水倒入琼脂糖中，用旋转动作和玻璃移液管将胚胎从琼脂糖中取出。注意避免损伤胚胎。对于难以取出的胚胎，可用针头轻轻去除胚胎周围的所有低熔点琼脂糖（LMPA）</li>
<li>将胚胎置于含亚甲蓝鱼用水的培养皿中，并培养至所需发育阶段以进行分析（形态学、免疫组织化学、原位杂交等以及显微观察）</li>
</ol>

5. 代表性结果： 

<img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig1.jpg" alt="用于细胞分析的解剖显微镜装置，包括样品培养皿和光学镜头。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 电穿孔装置。电极由磨尖的75μm钨丝制成，并通过导线连接至Protect CUY-21 Edit方波电穿孔仪。这些电极被固定在显微操作器上。
<img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig2.jpg" alt="用于电生理实验的显微镜装置，用于记录神经元活动的电极定位。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 注射工作站。为标准化起见，所有胚胎均注射于右耳。
<img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig3.jpg" alt="比较斑马鱼吗啉代注射与电穿孔效应的荧光显微镜图像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 用鬼笔环肽对3天龄胚胎中的肌动蛋白丝进行染色。(A) 注射对照吗啉代（MO）的3天龄胚胎在后部斑（pm）显示出强烈的鬼笔环肽染色信号。(B) 注射对照MO后进行电穿孔的胚胎，其后部斑中的鬼笔环肽染色水平与仅注射的胚胎相似。(C) 单独向耳囊注射mif吗啉代并未引起鬼笔环肽染色的减少，而同时注射mif吗啉代并进行电穿孔则导致后部斑中鬼笔环肽染色显著减弱（D）。am，前部斑。
<img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig4.jpg" alt="荧光显微镜图像，5 dpf 斑马鱼，后部/前部耳石区域，对照/电穿孔条件。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. 使用 5 dpf 幼鱼进行肌动蛋白丝的鬼笔环肽染色。当使用标准对照吗啉代时，仅注射（A）与注射联合电穿孔（B）之间无明显差异。然而，与仅注射 mif 吗啉代的胚胎（C）相比，注射 mif 吗啉代并进行电穿孔的 5 dpf 幼鱼在后部耳石（pm）区域显示出鬼笔环肽染色减弱（D），尽管其程度较 3 dpf 时轻微。am，前部耳石。
<img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig5.jpg" alt="斑马鱼胚胎显微观察；后部斑块区域；电穿孔效应；荧光成像分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5. 3 dpf 胚胎的乙酰化微管蛋白染色。图 (A) 中的胚胎未接受任何注射或电穿孔处理。图 (B) 中的胚胎接受了电穿孔但未进行注射。同时接受注射和电穿孔处理的胚胎（C, D）使用 mif 形态素后，微管蛋白染色明显弱于对照组。（pm，后部斑块）。
<img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig6.jpg" alt="斑马鱼荧光显微镜观察；不同处理条件下后部斑块区（pm）与前部斑块区（am）的比较。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6. 注射对照吗啉代的3天龄胚胎中乙酰化微管蛋白染色结果。（A）未经任何处理的胚胎，其后部斑块区（pm）显示出强烈的乙酰化微管蛋白染色信号，并伴有广泛的神经支配。（B）注射对照吗啉代的胚胎。（C）仅接受电穿孔处理的胚胎。（D）注射对照吗啉代并进行电穿孔的对照胚胎，其后部斑块区的乙酰化微管蛋白信号强度和神经支配程度与未经处理的对照组相似。

<ol><li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).</li>
<li>Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+essential+for+axis+formation+and+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development.</a> J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).</li>
<li>Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+placode+to+polarization%3A+new+tunes+in+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">From placode to polarization: new tunes in inner ear development.</a> Development. 131, 4119-4135 (2004).</li>
</ol>

本文的制作由Gene Tools, LLC赞助，该公司生产视频和文本中提到的试剂。

我们已成功将反义寡核苷酸MO注入24小时受精龄斑马鱼胚胎的耳部。注射并进行电穿孔后继续培养的胚胎具有活力。若胚胎在电穿孔过程中存活，则其生长速率与未经处理的胚胎、仅注射的胚胎以及仅进行电穿孔的胚胎相比均正常。
通过鬼笔环肽和乙酰化微管蛋白标记，我们观察了耳部注射并电穿孔 mif 和 mif-like 吗啉代寡核苷酸（MOs）后产生的效应。对后部椭圆囊感觉毛细胞中肌动蛋白丝进行鬼笔环肽染色显示，在24 hpf阶段对 mif 和 mif-like MO 进行电穿孔会导致毛细胞和/或静纤毛数量发生变化，而仅注射MO的胚胎则无此变化（图3）。毛细胞数量的减少与Shen et al.（已投稿）的研究结果一致，即针对 mif 和 mif-like 的MO会导致球囊斑中毛细胞数量减少。在注射MO并进行电穿孔的胚胎中观察到毛细胞数量减少，表明电穿孔可能有助于MO穿过细胞膜，从而相较于仅向听泡注射的胚胎，增强了形态学效应。通过乙酰化微管蛋白染色观察到前庭耳蜗神经节形态的变化。神经支配范围受到影响，表现为经注射并电穿孔的胚胎中神经突分支减少（图5）。此外，可能存在神经节细胞凝聚程度降低和/或神经节细胞数量减少，因为在同时接受注射和电穿孔的胚胎中，乙酰化微管蛋白染色信号显著减弱。由于已有研究表明 mif 对神经系统发育至关重要（Suzuki et al., 2004），电穿孔后观察到的变化可能是由于 mif 和 mif-like MO 溶液在神经母细胞中的转染效率提高所致。
将反义寡核苷酸吗啉代（morpholinos）直接电穿孔导入正在发育的组织中，是控制胚胎发育过程中特定组织时空基因表达的有效工具。将mif和mif-like吗啉代（MOs）电穿孔导入内耳组织后，导致后耳石器和前庭耳蜗神经节出现异常形态。与未经处理、仅注射或仅电穿孔的胚胎相比，经注射并电穿孔的胚胎其后耳石器中的感觉毛细胞数量减少。此外，前庭耳蜗神经节对后部感觉斑的神经支配程度以及前庭耳蜗神经节（SAG）的体积也有所下降。电穿孔是一种将大分子转染至特定组织的有价值方法，其优势在于可观察特定DNA、RNA或吗啉代（MO）在目标组织中的直接效应，并将其与对其他组织（包括脑、神经嵴和耳周间充质）产生的继发性影响区分开来（Barald 和 Kelley，2004）。

<table><tbody><tr><td>Sutter P-97 电极拉制仪</td><td>设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PV820 气动PicoPump</td><td>设备</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M3301L 手动显微操作器</td><td>设备</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica S6D 体视显微镜</td><td>设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>保护 CUY-21 Edit 方波电穿孔仪</td><td>设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>奥林巴斯FV500共聚焦显微镜</td><td>设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.01 英寸铂金丝</td><td>供应</td><td>A-M Systems</td><td>711000</td><td></td></tr><tr><td>热缩管</td><td>供应</td><td>纽瓦克公司</td><td>03F3172</td><td></td></tr><tr><td>插口压接端子</td><td>供应</td><td>Digi-Key</td><td>82PECT-ND</td><td></td></tr><tr><td>毛细血管</td><td>供应</td><td>Stoelting 公司</td><td>50613</td><td></td></tr><tr><td>油泥</td><td>供应</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料 100 mm 培养皿</td><td>供应</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6孔塑料培养板</td><td>供应</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="5">&lt;ol&gt;&lt;li&gt;MOs：0.3 mM 的组合，用于 &lt;em&gt;mif&lt;/em&gt;, &lt;em&gt;mif样&lt;/em&gt; MO1，以及 &lt;em&gt;mif-like&lt;/em&gt; 使用了MO2。&lt;br/&gt;Mif MO 与斑马鱼起始密码子互补 &lt;em&gt;mif&lt;/em&gt; mRNA：5&amp;rsquo;-acatcggcatgactgcgacagagat-3&amp;rsquo;. 使用了两种吗啉寡聚物（MO）用于 &lt;em&gt;mif-like&lt;/em&gt;. &lt;em&gt;mif-like&lt;/em&gt; MO1 与翻译起始位点互补：5&amp;rsquo;-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3&amp;rsquo;，而 &lt;em&gt;mif-like&lt;/em&gt; 基于内含子1/外显子2边界处AS序列设计的MO2：5&amp;rsquo;-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC-3&amp;rsquo;对照MO来自Gene Tools的随机核苷酸序列：5&amp;rsquo;-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA- 3&amp;rsquo;.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;鱼水中含亚甲蓝（0.3 ppm）&lt;/li&gt;&lt;li&gt; MS222（tricaine，Sigma；鱼水中浓度为 0.64 mM）&lt;/li&gt;&lt;li&gt; 低熔点琼脂糖（LMPA；Roche）&lt;/li&gt;&lt;li&gt; 酚红（Sigma）&lt;/li&gt;&lt;li&gt; 抗乙酰化微管蛋白（Sigma）&lt;/li&gt;&lt;li&gt; Alexa Fluor&amp;#174; 488 山羊抗小鼠二抗（Molecular Probes）&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Texas red-鬼笔环肽（Molecular probes）&lt;/li&gt;&lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

通过显微注射与电穿孔将mif morpholino直接递送至斑马鱼耳囊影响内耳发育

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

近年来，电穿孔已成为一种流行的技术，可用于将 DNA、RNA 和吗啉代寡核苷酸（morpholinos）体内转染到多种组织中，包括斑马鱼的眼、脑和体节。与其他基因操作方法相比，电穿孔的优势在于可通过施加电流，实现对特定组织在空间和时间上的靶向大分子导入。本文描述了利用电穿孔技术将 mif 和 mif-like 吗啉代寡核苷酸转染至斑马鱼发育内耳组织的方法。以往研究表明，在 1 至 8 细胞期将 mif 吗啉代寡核苷酸注射到胚胎中，会导致神经系统、眼睛以及耳部出现广泛的形态学改变。通过在发育后期靶向内耳组织，我们能够区分 MIF 在内耳发育中的直接作用，而非由其他组织影响所致的间接效应。我们利用鬼笔环肽（phalloidin）和乙酰化微管蛋白染色来研究与后耳斑相关的神经元、神经突起和毛细胞的形态，从而评估电穿孔作为斑马鱼内耳靶向转染方法的有效性。我们对 24 小时受精后（24hpf）胚胎的耳泡注射吗啉代寡核苷酸并进行电穿孔处理，并与未接受任何处理、仅注射或仅电穿孔的胚胎进行比较。结果显示，经注射并电穿孔的胚胎相较于对照组，毛细胞数量减少，前庭耳蜗神经节（SAG）的神经支配减弱，且 SAG 神经元数量更少。我们的结果表明，在发育后期直接将吗啉代寡核苷酸递送至耳囊，可避免在 1–8 细胞期递送时对神经系统和神经嵴产生的非特异性影响；同时也使得研究人员能够特异性地研究内耳的直接效应，而非由脑、神经嵴或耳周间充质的初级效应所引发的继发性耳部影响。

已建立一种在受精后24小时（24hpf）将吗啉代寡核苷酸直接递送至斑马鱼耳囊的方法。通过将吗啉代寡核苷酸微量注射至听泡腔内，并结合电穿孔促进其穿透，我们能够避免吗啉代寡核苷酸对脑部的影响，从而获得特异性作用于内耳的效果。

通过显微注射与电穿孔将MIF Morpholino直接递送至斑马鱼耳囊影响内耳发育

近年来，电穿孔已成为一种常用技术，可用于将 DNA、RNA 和吗啉代寡核苷酸在体外转染到多种组织中，包括……

以下实验的总体目标是在受精后一天（24小时）阶段，将反义寡核苷酸、吗啉代寡核苷酸（morpholino，简称morpholino）或其他干扰发育的分子直接递送至斑马鱼的耳囊中。在本示例中，我们使用吗啉代寡核苷酸靶向最早参与静平衡听觉神经节发育的神经营养因子——一种名为巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）的免疫系统细胞因子，以确定对该分子的吗啉代寡核苷酸干预是否会影响内耳发育或神经发生。该过程首先通过显微注射将吗啉代寡核苷酸注入耳囊腔内，随后进行电穿孔处理，从而促进吗啉代寡核苷酸从腔内渗透进入耳囊细胞。接下来，将胚胎在28.5摄氏度下培养，以观察吗啉代寡核苷酸（morphos）对内耳发育和神经发生的影响。在接下来的几天中，获得的结果显示，内耳感觉毛细胞数量减少，同时基于免疫组织化学以及foid染色和染色结果显示，前庭耳蜗神经节（statoacoustic ganglion）对毛细胞的支配也减少，这些染色分别标记了毛细胞表面动纤毛（Kinocilia）中的乙酰化微管蛋白和静纤毛（Stereocilia）中的肌动蛋白（actin）。我们最初在鸡胚中开发了这种吗啉代寡核苷酸注射与电穿孔方法，该工作由实验室中一位非常优秀的本科学生完成。凯蒂·霍姆斯成功将其优化至斑马鱼的尺度。目前的研究团队包括博士后研究员余池、研究生马特·怀亚特，以及实验室前博士后黛布·汤普森，她们共同完善了适用于斑马鱼的这一技术。该方法有望解答发育生物学与听觉研究领域中的一些关键问题，例如，能否将特定形态效应因子对耳等器官系统的直接影响，与影响多个器官系统并继发性波及耳部的广泛发育效应区分开来——如对大脑的作用进而间接影响耳部功能。与现有的在单细胞至四细胞阶段进行显微注射等方法相比，该技术的主要优势在于能够直接在较晚阶段将吗啡肽（morphos）导入内耳。因此，可避免吗啡肽对耳部发育的间接或继发性影响。制作电极时，首先截取长约3至5厘米、直径为75微米的钨丝。将钨丝穿过Molex电缆连接器。接下来，用热缩管包裹钨丝和Molex电缆连接器，并使用本生灯或热风枪加热，使热缩管紧贴导线密封。然后，为了 sharpen 钨丝的尖端，将钨丝浸入1 N的氢氧化钠溶液中，并以回形针作为另一电极，使用方波电流对钨丝进行电解。我们采用的条件是：施加5次50伏的脉冲电压，每次持续100毫秒，脉冲之间间隔50毫秒。将电极尖端浸入1 N氢氧化钠溶液中，重复操作三次。稍微加深电极在氢氧化钠溶液中的插入深度，再进行一次重复操作。继续进一步插入电极，每次推进的距离大致相同，最后再进行一次重复操作。这种梯度锐化可在电极上形成非常精细的尖端，从而更准确地将电极插入发育中的斑马鱼胚胎，并减少损伤。在用于斑马鱼耳泡显微注射吗啉代之前，应将导线压入培养盘中的模型黏土中存放。首先在傍晚设置带有塑料隔板的繁殖缸，以将雄鱼和雌鱼分隔开。将四条雄鱼和四条雌鱼放入水族箱中，并将水族箱置于培养室中，保持14小时光照和10小时黑暗的光周期过夜。次日早晨开灯后，拉开隔板，让鱼不受干扰地静置约20至30分钟。随后将雄鱼与雌鱼分开，并将亲鱼从繁殖水族箱中移出。将它们放入盛有新鲜鱼水的水箱中。通过将含有卵的水倒入滤网，从繁殖水箱中收集胚胎。用新鲜的卵水在滤网中多次冲洗卵，然后将其转移至培养皿中。去除未受精或不透明的卵，并将胚胎置于含有0.3 ppm亚甲蓝的胚胎培养液中，在28.5°C下避光孵育过夜。在注射前，使用Sutter P-97电极拉制仪拉制玻璃针。将含有1%琼脂糖的鱼水中10毫米培养皿中的AROS胶基质（含1%低熔点琼脂糖或LMPA）在水浴中加热至37°C，直至完全融化，并保持在37°C水浴中保温。 用形态溶液填充玻璃针，并将针尖切割至适当直径，约为10至15微米。将注射针安装到显微操作器上，显微操作器连接至带有氮气罐的PV820气动皮升注射泵。在受精后24小时对胚胎进行脱膜处理，并使用含0.3 ppm亚甲蓝的三卡因溶液对其进行麻醉。接下来，将三至五个麻醉后的胚胎背侧朝上排列在AROS凝胶基底上，以便进行方便且一致的分析；在每个胚胎上滴加一至两滴1% LMPA，待其凝固以固定胚胎位置。旋转培养皿，使耳泡位于右侧。然后将针头插入耳泡腔内，使用脚踏板注入morpho溶液。显微注射后立即把固定好的胚胎转移到电穿孔工作站，以设置电穿孔装置。首先，将打磨好的75微米钨电极用胶带固定在显微操作器上，然后将显微操作器放置在解剖显微镜载物台的两侧。开启电穿孔仪并设置电穿孔参数。本实验确定的最佳参数为：每次2毫秒、共三次13伏的脉冲，脉冲之间间隔100毫秒。插入电极，使耳囊两侧均匀分布，一个电极位于耳囊浅层，另一个电极位于耳囊深层。接着，通过脚踏开关或手动按压开关施加电流，完成电穿孔。将鱼水倒入培养皿中，用玻璃移液器轻轻旋转培养皿，取出胚胎。对于难以取出的胚胎，需小心操作以避免损伤。可用针头轻轻去除周围残留的低熔点琼脂糖（LMPA）。将胚胎转移至含有亚甲蓝鱼水的培养皿中，并将胚胎培养至所需的发育阶段，用于形态学及免疫组织化学分析。在双杂交和显微分析中，此处展示了对鱼类耳部注射并电穿孔形态素的代表性结果。当用Phin红标记时，后部或听觉斑（标记为PM）是鱼类的听觉器官之一。在这张照片中，感觉毛细胞上静纤毛中的肌动蛋白束在乒乓球状结构上呈现为红色小点。通过荧光标记Phin a观察受精后三天的胚胎，仅注射MIF吗啡肽的胚胎与同时接受电穿孔和注射的同龄胚胎相比，毛细胞静纤毛内显示出更多的肌动蛋白纤维。然而，与仅注射吗啡肽相比，注射并进行电穿孔使用标准对照吗啡肽并未导致F和染色减少。在后部斑块中结果相似，但在受精后五天的幼虫中，注射并电穿孔组与仅注射MIF吗啡肽的胚胎相比，差异较不显著。使用标准对照吗啉代时，仅注射与注射联合电穿孔之间没有差异。该胚胎经乙酰化微管蛋白抗体染色，未接受任何MIF吗啉代的注射或电穿孔。该胚胎接受了电穿孔但未进行注射。两个胚胎均显示出正常的乙酰化微管蛋白染色。这两个胚胎均接受了注射和电穿孔处理。与对照组相比，它们的微管蛋白染色明显减弱，且与耳部及周围神经节相关的神经突起也显著减少。当使用对照形态发生素进行注射和电穿孔时，与仅注射形态发生素相比，我们未观察到乙酰化微管蛋白染色范围的减少，也未观察到听觉神经节支配的降低。一旦掌握，该技术若操作得当，约需两小时即可完成。该技术中最难掌握的部分是电穿孔过程，应特别注意避免损伤脑组织，使用尖端锋利的电极将有助于缓解这一问题。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

通过注射和电穿孔的斑马鱼Otocyst的MIF Morpholinos直接运抵影响内耳发展

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斑马鱼胚胎中mRNA和吗啉代反义寡核苷酸的显微注射

本视频展示了如何在单细胞阶段将吗啉代寡核苷酸（morpholino）或 mRNA...

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一种可适应的斑马鱼反向遗传学方法，通过心室注射基因特异性吗啉代寡核苷酸，用于评估基因在发育后期及生理性稳态（如组织再生）过程中的功能。...

利用心脏心室注射反向遗传学吗啉代寡核苷酸方法转染斑马鱼幼鱼中多个难以靶向的组织

通过在卵内电穿孔技术，我们建立了一种方法，可在鸡胚发育过程中特定电路组装阶段，选择性地转染听觉内耳及耳蜗核，实现细胞群特异性的脆性X智力低下蛋白敲低。...

通过听觉环路解析脆性X智力低下蛋白的细胞自主功能 在卵内 电穿孔

子宫内活体注射与电穿孔技术应用于胚胎大鼠新皮质，为操控单个前体细胞提供了强大工具……...

E16 大鼠胚胎的宫内脑室内注射与电穿孔

学习通过显微注射和电穿孔技术将吗啉寡核苷酸直接递送至斑马鱼耳囊的方法，用于研究内耳发育和神经发生。该技术可特异性分析基因功能，避免对脑组织的非特异性影响。

通过显微注射与电穿孔将MIF Morpholino直接递送至斑马鱼耳囊影响内耳发育

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