一种替代传统NASA小鼠后肢去负荷模型的新方法

本实验的总体目标是采用一种更简单、更直接的方法对小鼠进行后肢去负荷（hind limb unloading，简称 hu），以最大程度减少动物所受的应激。该尾部固定方法可有效诱导后肢萎缩，同时不损害小鼠的整体健康和体重。第一步是在成年小鼠尾部植入一个尾环。

在整个研究过程中，必须记录动物的体重和健康状况。然后组装后肢卸载装置，并将其放入将要进行卸载操作的笼子中。待动物恢复后，将其放入装置中以进行卸载程序。

最终，通过测量身体和肌肉质量，可获得结果，这些结果显示出悬吊小鼠后肢出现肌肉萎缩。与现有的方法（如Maori Holton胶带固定法）相比，该技术的主要优势在于小鼠尾部皮肤始终可见。小鼠无法从悬吊装置中逃脱或摆弄圆环，且恢复更快，能维持稳定的体重。

该方法有助于解答肌肉骨骼生理学领域以及重力与空间生物学中的关键问题，例如如何预防长期身体不活动、卧床休息、肢体固定、微重力环境、神经肌肉疾病以及随着年龄增长所导致的骨骼肌萎缩和骨质流失。当我们首次在使用Maury Holden尾部固定技术时遇到操作困难，便萌生了这一想法。在演示该技术的过程中，由于小鼠从后肢固定装置中逃脱，我们持续损失实验动物和实验数据。

今天参与实验的是来自我实验室的高级研究助理安德烈·费拉拉（Andre Ferrara）。协助安德烈工作的还有实验室的博士生杰奎琳·克里斯西（Jacqueline Chrissy）以及同在实验室的本科生安德鲁·邓恩（Andrew Dunn）。首先对手术区域进行消毒，用异氟烷麻醉一只成年小鼠，然后记录小鼠体重，并将其置于加热垫上。用氯己定溶液擦拭尾部，为手术做好准备。

从尾部末端的体毛开始计数，找到尾部两个骨性隆起之间的第五、第六或第七椎间隙。使用止血钳和20号5G针头，在两个椎骨之间穿刺进入椎间隙，制备一个引导孔。拔出针头后，插入一根钢丝缝线。

通过孔洞切割至10厘米长度。缝线应从尾部两侧各伸出5厘米。将拇指尖放在尾部，用另一只手将钢制缝线缠绕在拇指上。

将末端拧转形成一个大环。缠绕或环状部分的长度应为正负三毫米。用止血钳夹住缝线的一股，弯成一个较小的环，使其末端尽可能贴近原始大环上的拧转处。

剪去多余的导线，并将绞合的导线向后弯折。使用硝酸银棒止住任何额外出血。术后让动物恢复5至7天，再进行后肢悬吊（hind limb unloading）或hu处理。

将每个吝啬屋单独放置，以防止尾环相互缠绕。在笼子顶部铺设一层一英寸宽、由八分之三英寸厚的带孔镀层钢条制成的网，并用胶带固定。再添加一个垫圈和一个翼形螺母，但不要完全拧紧，以便后续进行调整。

将机用螺钉穿过线轴的中心孔，以防止线轴脱落。在线轴螺钉的末端拧上一个尼龙锁紧螺母。线轴应能自由旋转。

将鱼线转环的扣环插入 bobin 的下部。使用钳子将一个回形针弯成 S 形钩状。将 S 形钩的一端穿过鱼线转环的孔洞，并用钳子将其夹紧闭合。

将U形金属丝平行于笼内螺钉放置，并将两端弯向侧面。为支撑整瓶水，将水瓶插入U形金属丝中，使出水口朝下但不接触底部。使用胶带将水瓶固定在笼子上。

将一个两英寸的文件夹夹子掰开，保持足够的张力，使其能够在后肢减负操作前夹住几块食物而不压碎颗粒饲料。记录小鼠的体重，用于后续比较。随后，将S形钩的开口端穿过尾部突出的较小金属环。

通过拧紧或松开机器上的下部翼形螺母来调节小鼠的高度。小鼠的下肢不应承重。达到最佳高度后，拧紧上部翼形螺母，并将水瓶重新定位至一根新形状的金属丝上，确保小鼠无法用后肢攀爬到出水口。

为测量研究期间的食物消耗量，将饲料颗粒在放入文件夹夹子前进行称重。每只小鼠提供约8至10克饲料，以满足其每天约5至6克的摄食量。每个小鼠笼位，将带有饲料的文件夹夹子置于笼底，防止小鼠攀爬其上，并使用 duct tape 将其固定。

使用两英寸乘两英寸的羽毛束，松散缠绕。将尾羽缠绕在旋转环上。取一小束尾羽缠绕在羽毛束上，将羽毛束固定于尾部。

此步骤至关重要，可防止尾巴下垂，导致血液积聚于尾尖并引发尾部坏死。在笼子的另一侧，对另一只动物重复相同的操作。每笼饲养两只动物时，应将它们放置在彼此几乎可以接触的位置。

将动物放置在笼子中央。向笼内加入少量玉米芯垫料，确保垫料不足以让小鼠堆积成堆。在后肢去负荷操作结束后，将动物从装置中取出，并取下尾部固定环。

使用剪线钳记录体重，并将动物放回其饲养笼中恢复。经过一段恢复期后，再次等待动物稳定，然后测量比目鱼肌和肾上腺质量。尾部切除手术前的体重与手术后五天及人源化处理前的体重相比无显著差异。

尽管后肢悬吊14天和28天导致小鼠体重出现轻微但无统计学意义的下降，但小鼠在恢复3天后体重已完全恢复至悬吊前水平。此处显示了自主活动对照组小鼠和后肢悬吊小鼠的食物摄入量。

在28天内，悬吊小鼠的平均每日食物摄入量与对照组相比无显著差异。悬吊14天和28天后均观察到明显的比目鱼肌萎缩，表明该模型在恢复3天后仍具有有效性。术后组比目鱼肌质量显著高于两个悬吊组，但仍显著低于自由活动的对照组动物。

切除双侧左、右肾上腺并称重，以作为动物应激状态的指标。如图所示，对照组小鼠与 HU 小鼠的平均肾上腺重量相近。掌握该定制手术后，每只小鼠的操作可在 5 至 10 分钟内完成，手术后的笼具设置可在 15 分钟内完成。在完成该操作后，还可采用其他方法，如小鼠、Hein、肢体重新负荷以及废用性萎缩后的恢复实验，以回答更多科学问题，例如肌肉与骨骼系统在经历长期废用后如何恢复并对此类状态作出响应。

现在您已经观看了本视频，应该对如何在小鼠中实施后肢去负荷有了充分的理解。该技术可用于研究多种组织和系统，例如在负荷与重新负荷条件下的心血管、肌肉骨骼和内脏系统，并可结合多种小鼠模型（如基因敲除或基因敲入模型）进行应用。