Name: 纯化的骨骼肌的先觉者 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 学习从骨骼肌中分离成肌和脂肪前体细胞的方法，通过酶解消化和流式细胞术纯化细胞群体。该技术有助于研究组织再生过程中的细胞相互作用及再生医学应用。

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1. 组织采集：
<ol>
<li>使用 7 至 12 周龄的小鼠。通常至少需要两只动物：其中一只用于建立流式细胞术（FACS）单色对照，以进行补偿调节，以及设置荧光减一（fluorescence-minus-one）同型对照样本；另一只为实际待分选的样本。</li>
<li>通过吸入 CO2 或根据所选伦理协议安乐死小鼠。将小鼠仰面放置于纸巾上，并用 70% 乙醇充分喷洒，以防止小鼠毛发造成污染。</li>
<li>用镊子提起腹部区域的皮肤，然后用锋利的剪刀做一个小的纵向切口。</li>
<li>将两侧皮瓣分别向上和向下剥离，完全暴露下方的后肢肌肉。</li>
<li>将剪刀插入胫骨两侧并展开，以切除肌肉组织。</li>
<li>对股骨重复相同操作，以提取肌肉组织。</li>
<li>将所有切除的肌肉组织置于 60 mm 培养皿中，每只小鼠使用一个独立的培养皿。</li>
<li>对所有小鼠重复上述步骤。</li>
</ol>
2. 通过酶消化将组织解离为单个细胞：
在本方案的整个部分中，均应使用无菌试剂和工具，并在无菌条件下操作。
<ol start="9">
<li>向每个培养皿中加入 2 mL 胶原酶 II（Sigma，货号#6885，500 U/mL）和 20 μL 的 250 mM CaCl2 储存液。</li>
<li>使用两把镊子（一把带齿，一把双齿，来自 Fine Science Tools，货号#11051-10，11154-10）将肌肉组织撕成小块（约 1 mm3），注意尽可能去除并丢弃受污染的非肌肉组织。</li>
<li>盖上培养皿，于 37 摄氏度孵育 30 分钟。</li>
<li>取出培养皿，使用 3 mL 注射器活塞充分研磨组织块。每个样品使用单独的活塞，以避免交叉污染。</li>
<li>向每个培养皿中加入约 5 mL 无菌冷 PBS，并将组织悬液转移至 50 mL Falcon 管中（必要时冲洗培养皿以回收全部组织）。</li>
<li>剧烈震荡 Falcon 管，加满 PBS，以 800 rpm 离心 5 分钟（Eppendorf 台式离心机型号：5810R），吸除上清液（重复 3 次）。</li>
<li>向每管中加入 1 mL 胶原酶 D（Roche，货号#11088882001，1.5 U/mL）与 Dispase II（Roche，货号#04942078001，2.4 U/mL）的混合液，以及 10 μL 的 CaCl2（250 mM），于 37 摄氏度旋转孵育 1 小时。</li>
<li>加入 5–10 mL 冷的无菌 PBS，涡旋并用移液器充分吹打以均质化组织。</li>
<li>用 PBS 加满各管并充分混匀。</li>
<li>将液体转移至置于 50 mL Falcon 管上方的 40 μm 细胞滤器中，以滤除残留的大块组织。将每个样品平均分至三个 50 mL Falcon 管中，每管加满 PBS 后于 8 摄氏度以 1600 rpm 离心 5 分钟。</li>
<li>弃去上清液，收集细胞用于染色。</li>
</ol>
3. 抗体染色与分选：
在本实验方案的此部分中，使用无菌的流式细胞术（FACS）缓冲液和收集缓冲液，并在无菌条件下操作。商业化的抗体若经过适当处理，通常被视为无菌。
<ol start="20">
<li>对于单色和同型对照样本，将样本重悬于1 mL FACS缓冲液中，并将悬浮细胞分装至9个预先标记的1.5 mL离心管中（100 μL 每管）
<ol>
<li>根据下表设置单色染色混合液： 
注意：同型对照抗体在染色中的终浓度应与其对应的初级抗体浓度一致。例如，如果使用了抗-Sca-1抗体，则相应的同型对照抗体 1 μg/106 细胞，其相应的同型对照必须以相同浓度使用。 
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>管编号 #</td>
 <td>试管名称</td>
 <td>公司</td>
 <td>货号#</td>
 <td>克隆</td> 
 <td>同型型</td>
 <td>稀释</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>非染色</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2</td>
 <td>Hoechst33342</td>
 <td>sigma</td>
 <td>B2261</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>2-5 μg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3</td>
 <td>PI</td>
 <td>sigma</td>
 <td>P4864</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>1 μg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="2">4</td> 
 <td rowspan="2">CD31-FITC CD45-FITC</td> 
 <td>ebioscience</td>
 <td>11-0311-85</td>
 <td>390</td>
 <td>大鼠 IgG2a</td>
 <td>500</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>自制</td>
 <td> </td>
 <td>I3/2</td>
 <td>大鼠 IgG2b</td>
 <td>500</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5</td>
 <td>Sca1-PECY7</td>
 <td>ebioscience</td>
 <td>25-5981-82</td>
 <td>D7</td>
 <td>大鼠 IgG2a</td>
 <td>5000</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6</td>
 <td>α-7 APC</td>
 <td>自制</td>
 <td> </td>
 <td>R2F2</td>
 <td>大鼠 IgG2b</td>
 <td>1000</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
</li>
<li>使用下表设置同型对照染色混合液： 
 <table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>管 #</td>
 <td>名称 管的</td>
 <td>Hoechst</td>
 <td>PI</td>
 <td>CD31- FITC</td>
 <td>CD45- FITC</td>
 <td>Scal- PE-CY7</td>
 <td>a-7- APC</td>
 <td>大鼠- IgG2b- APC</td>
 <td>大鼠- IgG2a- pecy7</td>
 <td>大鼠- IgG2a- FITC</td>
 <td>大鼠- IgG2b- FITC</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>7</td>
 <td>同- CD31 /CD45</td>
 <td>+</td>
 <td>+</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>+</td>
 <td>+</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>+</td>
 <td>+</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>8</td>
 <td>Iso- Scal- pecy7</td>
 <td>+</td>
 <td>+</td>
 <td>+</td>
 <td>+</td>
 <td>-</td>
 <td>+</td>
 <td>-</td>
 <td>+</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>9</td>
 <td>Iso- α-7-APC</td>
 <td>+</td>
 <td>+</td>
 <td>+</td>
 <td>+</td>
 <td>+</td>
 <td>-</td>
 <td>+</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
</li>
<li>移液单色和同位素对照染色混合物（我们通常调整抗体浓度，使其在5至 10 μL 将染色混合液（每份样本加入适量）从第20步加入相应的Eppendorf管中，充分混匀，冰上孵育1小时。</li></ol></li>
<li>对中国台湾样本小鼠的细胞进行染色 800μL 抗体混合物（如下）用于FACS细胞分选。充分混匀，冰上孵育1小时。 
抗体混合物： Hoechst、PI、CD31-FITC、CD45-FITC、Sca1-PECY7、α-7 APC 
注意：抗体与细胞的最佳比例必须通过 individually 滴定每种抗体来确定，因为不同批次之间可能存在显著差异。应以 μgs 每10个抗体6 靶细胞数量在使用同一批抗体时应保持恒定。显然，如果不同实验之间的靶细胞数量没有显著变化，或者染色体积随细胞数量按比例调整，则也可使用每种抗体的固定稀释比例。</li>
<li>洗涤：向9个对照管中每管加入约1 mL FACS缓冲液；向样本管中加入约20 mL FACS缓冲液。</li>
<li>将Eppendorf管在3000 rpm下离心5分钟（Eppendorf台式离心机，型号：5417C）。将样品管在1600 rpm下离心5分钟（Eppendorf台式离心机，型号：5810R）。</li>
<li>吸出并弃去所有试管中的上清液。</li>
<li>用FACS缓冲液重悬细胞（每个对照样本1 mL，分选样本4 mL），通过细胞滤器帽（BD Falcon货号# 352235）将细胞移入“FACS管”中， 40μm 孔径）以去除可能影响流式细胞仪的残留团块。</li>
<li>使用单色对照和同型对照设置流式细胞分选仪。</li>
<li>根据下表，将分选后的细胞分别收集至含有3.5 mL收集缓冲液（95% DMEM，5% FBS）的容器中。通常情况下，取自一只野生型小鼠的双侧后肢组织，可获得约150,000个成肌前体细胞或100,000个成脂前体细胞，细胞活力高于95%，该结果通过分选结束后采用FACS对细胞进行重新分析确认（图1）。 
基于表面染色定义成肌细胞和成脂细胞前体细胞 
 <table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>抗体/染色 </td>
 <td>成肌祖细胞（MP）</td>
 <td>脂肪生成祖细胞（AP）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hoechst</td>
 <td>+</td>
 <td>+</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PI</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CD31-FITC</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CD45-FITC</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sca1-PECY7</td>
 <td>-</td>
 <td>+</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>α-7 APC</td>
 <td>+</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
</li>
</ol>
4. 移植：
<ol start="28">
<li>将分选后的细胞以1500 rpm离心5分钟，弃上清，将细胞转移至已灭菌的Eppendorf管（1.5 mL）中，用500 μL无菌PBS（无血清！）洗涤细胞，随后以3000 rpm离心5分钟。所有试剂均需保持无菌条件，并在组织培养超净台中操作，将成肌前体细胞重悬于PBS中，或将成脂前体细胞重悬于Matrigel（BD货号# 354234）中，浓度约为106 细胞/mL。</li>
<li>将成肌前体细胞或成脂前体细胞移植至受体小鼠。
<ol>
<li>根据所在机构的规定，使用异氟烷对小鼠进行麻醉。</li>
<li>剃除注射区域周围的毛发，然后用70%乙醇擦拭消毒皮肤。</li>
<li>使用3/10 CC胰岛素注射器（BD货号# 309300）注射20 μL的成肌前体细胞或成脂前体细胞（= 20,000个细胞）。</li></ol></li>
<li>在适当时间后（三周效果良好，但通常移植后一周内即可观察到表达供体来源转基因标记的肌纤维），通过腹腔注射400 μL Avertin（Sigma货号# T04840-2，25 mg/mL）麻醉第29步中的受体小鼠，随后先经心脏灌注50 mL PBS（含10 μM EDTA），再灌注15 mL 4% PFA。取目标组织，如需则在4% PFA中后固定过夜，然后转移至20%蔗糖溶液中过夜。用OCT包埋，冷冻并进行冰冻切片。</li>
</ol>
5. 典型结果：
当移植肌源性前体细胞至小鼠骨骼肌时，它们会迅速与已存在的肌纤维融合。因此，供体细胞中存在的任何遗传标记均可在接收这些细胞的肌纤维中轻松检测到。图2展示了一个示例，其中移植的细胞表达人源性碱性磷酸酶，并通过组织化学方法显示。
 当脂肪前体细胞被移植时，其结果高度依赖于移植部位的微环境：当皮下移植时，这些细胞会分化为脂肪细胞和肌成纤维细胞（见图2）。在包括肌肉在内的许多其他部位，除非已诱导产生脂肪变性，否则这些细胞无法存活3。
 
 <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig1.jpg" alt="流式细胞术分析图；FL8-A：APC 对 FL6-A：PECγ；细胞群设门。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
 图1. 从骨骼肌中分离祖细胞群的分选策略。 （A）分选策略：根据前向散射光和侧向散射光确定活细胞。利用Hoechst染色排除无核碎片，并通过碘化丙啶（PI）染色排除死细胞。在分选门控中排除造血细胞（CD45）和内皮细胞（CD31）。α7+ Hoechst+ PI- CD45- CD31- Scal- 亚群包含所有肌源性祖细胞（MP）。Scal+ Hoechst+ PI- CD45- CD31- α7- 群体包含脂肪源性祖细胞（AP）。（B）荧光减一（FMO）同型对照验证染色特异性。（C）分选后MP和AP亚群的纯度检测。
 <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig2.jpg" alt="用于细胞结构鉴定的组织学切片染色；显微镜实验结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
 图 2. MP 和 AP 移植后的代表性结果。 AP 被移植至皮下（上图），MP 被移植至肌肉内（下图）。在这两种情况下，供体细胞均来自表达转基因人源碱性磷酸酶的小鼠，该酶通过棕色染色进行识别。

<ol><li>Buckingham, M., Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle stem cells.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 330-336 (2008).</li>
<li>Relaix, F., Marcelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 21, 748-753 (2009).</li>
<li>Joe, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).</li>
<li>Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibro%2Fadipogenic+progenitors%3A+A+double-edged+sword+in+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Fibro/adipogenic progenitors: A double-edged sword in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Cycle. 9, (2010).</li>
<li>Sherwood, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+mouse+myogenic+progenitors%3A+functional+heterogeneity+of+cells+within+and+engrafting+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle.</a> Cell. 119, 543-554 (2004).</li>
<li>Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+and+expansion+of+single+transplanted+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells.</a> Nature. , (2008).</li>
<li>Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309, 2064-2067 (2005).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本方案的目标是在获得高细胞产量与高细胞活性之间实现合理平衡。可以预见，确保获得健康细胞最关键的一步是起始组织的酶解离过程。组织操作应特别轻柔，这一点即使在音视频格式中也难以展示或体会。另一个关键因素是操作时长：从供体到受体动物的时间越长，细胞活性越低，因而移植效率也越低。如果在分选后通过观察纯化细胞样本中PI阳性事件的频率仍无法立即判断细胞活性，建议进行有限稀释实验以测定克隆形成能力3。通常情况下，从未受损肌肉组织中分离得到的细胞，约每15-20个细胞中就有1个能够在体外启动成肌或成纤维/成脂克隆的形成。in vitro。虽然由肌肉前体细胞（MPs）形成的克隆中几乎100%含有已分化的肌管，而由纤维/脂肪前体细胞（FAPs）形成的克隆中，仅有约三分之一同时含有脂肪细胞和表达平滑肌肌动蛋白的肌成纤维细胞。

<table><tbody><tr><td>胶原酶 II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-6885,</td><td>500 u/ml</td></tr><tr><td>胶原酶 D</td><td>Roche Group</td><td>11088882001</td><td>1.5 u/ml</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche Group</td><td>04942078001</td><td>2.4 u/ml</td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td>40 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>带细胞筛的离心管</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>40 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>2-5 ug/ml</td></tr><tr><td>CD31-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0311-85</td><td>克隆 390</td></tr><tr><td>CD45-FITC</td><td>自制</td><td></td><td>克隆 I3/2</td></tr><tr><td>Sca1-PECY7</td><td>eBioscience</td><td>25-5981-82</td><td>克隆 D7</td></tr><tr><td>&amp;#945;-7 整合素 APC</td><td>自制</td><td>请联系 Rossi 实验室</td><td>R2F2</td></tr></tbody></table>

从骨骼肌中纯化前体细胞

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

骨骼肌包含多种具有不同胚胎起源和发育潜能的前体细胞群体。肌源性前体细胞通常位于肌纤维质膜与包裹肌纤维的富含层粘连蛋白的基底膜之间的“卫星细胞位置”，是一类能够自我更新且仅向肌源性谱系分化的细胞。1,2我们最近描述了第二类与血管相关的前体细胞，这类细胞能够生成肌成纤维细胞和白色脂肪细胞，在组织损伤时可迅速进入增殖状态，并在组织再生过程中为成肌细胞提供营养支持3,4确定特定细胞群发育潜能和再生能力最可靠的检测方法之一是基于细胞的分离与移植5-7为此，我们优化了通过流式细胞术从酶解分离的肌肉组织中纯化这些细胞的实验方案，本文将对此进行详细阐述。采用该方法获得的细胞群体将包含成肌性或成纤维/成脂性集落形成细胞：无其他细胞类型能够扩增 体外 或存活 体内 递送。然而，当这些细胞群体在分选后立即用于分子分析（例如 qRT-PCR）时，必须注意，新近分选的亚群可能含有其他无法形成克隆或在受体中植入的污染细胞。

从小鼠骨骼肌中通过酶解分离、表面标记及流式细胞术纯化纤维/脂肪生成和肌源性前体细胞的方法。

骨骼肌包含多种具有不同胚胎来源和发育潜能的前体细胞群体。肌源性前体细胞通常驻留于……

以下实验的总体目标是从对应的骨骼肌中分离出具有活性的成肌和成脂祖细胞。首先，从安乐死的小鼠中获取肌肉组织。第二步，通过酶消化法将样品处理，使组织解离为单个细胞。接下来使用荧光激活细胞分选（FACS）来分离祖细胞。通过将分离的细胞移植到受体小鼠体内，并基于对遗传标记（在此示例中为人类碱性磷酸酶）的组织化学染色，获得显示细胞活力和分化能力的结果。该技术相较于预先存在的技术（如PrePL）的主要优势在于，可以在不同时间点直接从动物体内分离细胞。例如，在诱导组织损伤后，由于此时细胞群体不受选择压力影响，因此可以在分子水平上分析细胞群体，观察细胞在体内再生过程中经历的不同阶段。该技术有助于回答组织再生领域中的一个关键科学问题，特别是：在体内再生过程中，每种细胞类型分别发挥什么作用？这些细胞类型之间如何相互作用以重建健康的组织？该技术的应用前景可延伸至杜氏肌营养不良等疾病的治疗研究。对这些前体细胞的研究最终可能为这类疾病带来再生治疗策略。此外，该技术的影响还延伸到从心脏到脂肪组织的多种其他组织，因为至少纤维脂肪生成前体细胞已在我们迄今检测的每一种组织中被发现。通常，刚接触该技术的研究人员会遇到困难，因为剧烈的解离技术会降低细胞活力，并产生过多碎片，从而在后续细胞分离过程中造成干扰。我们最初萌生这一方法的想法，是在决定将通常用于APOE细胞的流式细胞术应用于实体组织中干细胞研究的时候。该技术的可视化演示非常重要，因为组织解离步骤难以学习， Properly描述这些步骤非常困难。今天将由林凯（Linky）演示该技术，他是我实验室的研究助理，最早开发并优化了该技术。进行此操作至少需要两只小鼠。一只小鼠用于获取细胞，以提供必要的单色和抗体同型对照，另一只则提供待分选的样本。首先，在无菌的实验室生物安全柜中获取已实施安乐死的、年龄在7至12周之间的小鼠。将已安乐死的小鼠仰面放置在无菌纸巾上，并用70%乙醇充分喷洒毛发，以防止后续操作中使用镊子和锋利剪刀时发生污染。提起腹部区域的皮肤，做一个小的纵向切口。抓住切口两侧的皮肤，向后剥离皮肤，完全暴露后肢肌肉。接下来，将闭合的剪刀插入肌肉下方和胫骨上方，然后打开剪刀，以切除肌肉组织。刀片的后缘将轻柔地使肌肉与胫骨分离。对胫骨两侧重复此操作，并将组织置于60毫米的培养皿中。现在以相同方式从股骨上切除肌肉组织，并将组织加入培养皿中。每只小鼠使用一个培养皿，依次重复上述操作。接下来，将组织解离为单个细胞。向每份肌肉组织培养皿中加入2毫升（即1000单位）胶原酶以及20微升250毫摩尔/升氯化钙储备液。然后迅速而小心地操作。使用两把灰色镊子，一把带齿，一把双齿，将组织撕成1立方毫米大小的组织块。尽可能去除并丢弃非肌肉组织。盖上培养皿，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。孵育结束后，取出培养皿并放回无菌实验台。取下 3 毫升注射器的活塞，用其研磨组织。每个培养皿使用一个移液器活塞，以避免交叉污染。向每个培养皿中加入约 5 mL 冷的无菌 PBS，并将培养皿中的内容物转移至 50 mL 锥形管中。再用额外的 5 mL PBS 冲洗，以回收全部组织，并将其加入锥形管中。按照方案将样品洗涤并离心三次。随后，向每根试管中加入1 mL含有胶原酶D、Dys Space 2和氯化钙的溶液，在37°C条件下旋转孵育1小时。孵育结束后，向试管中加入5 mL冷的无菌PBS，短暂涡旋混匀，并反复吹打数次以分散团块。用 PBS 充分混匀并置于冰上。为去除任何残留的较大组织碎片，将 40 微米细胞筛置于冰上的 50 毫升锥形管上，过滤细胞悬液。将滤过的流穿液等分至三个装有冷的无菌 PBS 的 50 毫升锥形管中，在 8°C 下以 1600 转/分钟离心 5 分钟。离心后，小心弃去上清液（S），并将细胞置于冰上，用于成肌和成脂祖细胞的染色与分选。首先，根据随附的书面实验方案设置六个单色染色混合对照。这些对照包括未染色对照、碘化丙啶、CD31 和 CD45 FSE 标记抗体、SC1P7 标记抗体以及 α7A PC 标记抗体。接下来，根据书面实验方案设置三种抗体同型对照染色混合物。染色混合液配制完成后，标记9个1.5毫升离心管，用于单色和同型对照样品。用总体积为1毫升的FACS缓冲液重悬并混合来自三个锥形管的细胞。随后，将100微升细胞悬液分别加入各标记好的离心对照管中，并根据抗体浓度，用移液器向相应的对照管中加入5至10微升的染色混合液。将样本小鼠的细胞重悬于 200 微升 fax 缓冲液中，并转移至一个 50 毫升的锥形管中。然后加入 800 微升抗体混合液。充分混匀每个对照管和样本管。将各孔在冰上孵育一小时。孵育结束后，向九个对照管中各加入一毫升 Fax 缓冲液，向样品管中加入约 20 毫升 Fax 缓冲液以洗涤细胞。将对照管在 3000 RPM 条件下离心五分钟。将样品锥形管在1600 RPM下离心五分钟。离心后，吸去并弃去上清液。用一毫升fax缓冲液重悬每个eend orph管中的对照细胞，用四毫升fax缓冲液重悬样品细胞。向样本细胞、同型对照以及单色对照管中加入碘化丙啶。通过细胞滤网帽将细胞移入流式管中，以去除可能影响流式细胞仪检测的残余细胞团块。使用单色和同型对照设置传真仪。根据随附的书面方案分选样品细胞，并分别收集每个细胞群。使用3.5毫升收集管收集存活的肌源性前体细胞，该细胞群为hulk阳性、α7整合素（alpha seven integrin）阳性、PI阴性、CD31阴性、CD45阴性且ska阳性。一个PE七号阴性、有活力的脂肪生成祖细胞群体为强阳性，且对PE七号阳性、pi CD31 FE CD45 FE以及alpha七a PC呈阴性。一只野生型小鼠可获得约1×10⁵个脂肪生成祖细胞，以及1.5至2×10⁵个肌源性祖细胞，活力高于95%。为将细胞移植到宿主小鼠体内，需对细胞进行制备和洗涤。首先以1500 RPM离心5分钟，收集细胞。弃去上清液，将细胞重悬于500 µL PBS中，并转移至einor管中。将离心管在3000 RPM条件下离心五分钟，并移除上清液。然后将成肌祖细胞重悬于PBS中，或将成脂祖细胞重悬于Matrigel中，浓度约为每毫升10的6次方个细胞。根据书面实验方案，准备每种供体细胞类型对应的麻醉宿主小鼠后，使用0.3立方厘米的胰岛素注射器注射20微升（约20,000个细胞）的成肌或成脂祖细胞。让移植的细胞有足够的时间进行分化，通常约为三周。然后按照本图所示方案分离目标组织并制备用于冷冻切片。该图展示了分选策略，用于分离成脂和成肌祖细胞：根据前向散射和侧向散射确定活细胞，通过Hoechst染色排除核碎片，通过碘化丙啶（PI）染色排除死细胞，分别通过CD45和CD31标记排除造血细胞和内皮细胞。最后，筛选出α7阳性的细胞亚群。SKA1阴性群体包含所有成肌祖细胞以及α7阴性细胞群。SKA1阳性群体包含所有成脂祖细胞。荧光减一的同型对照验证了染色的特异性。此外，还对成脂和成肌亚群进行了纯度检测。在此代表性示例中，经分选后，表达转基因人碱性磷酸酶的脂肪源性前体供体细胞经皮下注射后，可通过组织化学方法在宿主组织中识别，表现为棕色染色。表达转基因人碱性磷酸酶的肌源性前体供体细胞经肌内注射后，在该组织切片中亦可见棕色显色予以识别。掌握组织化学技术后，若操作得当，可在五小时内完成。若处理的样本量增加，所需时间也将相应延长。进行该操作时，务必注意动作迅速且轻柔。因此，避免同时处理过多样本。延长处理时间会显著降低细胞在此操作后的变异性。也可采用其他方法，如通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）进行结肠类器官基因表达分析，以回答其他问题，例如：这些前体细胞在体内发育完成后对损伤的响应如何？该技术为组织再生领域的其他研究人员探索受损组织中前体细胞间的相互作用铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在不造成损伤的情况下将这些组织解离。通过细胞表面标志物鉴定前体细胞，并在体内分析其发育潜能。感谢观看。祝您的实验顺利。

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生物学

纯化的骨骼肌的先觉者

分离和培养静息状态的卫星细胞（一种肌肉干细胞群体）的纯细胞群体，对于理解肌肉干细胞生物学与再生机制，以及用于杜氏肌营养不良症和其他退行性疾病的干细胞移植治疗至关重要。...

肌肉卫星细胞的分离、培养与移植

人类骨骼肌中的血管含有多种多能前体细胞群体，非常适合用于再生医学应用。该分离方法可同时从血管的三个结构层中分别纯化出三种多能前体细胞群体：来自内膜的肌源性内皮细胞、来自中膜的周细胞以及来自外膜的外膜细胞。...

从人骨骼肌中分离血管来源的多能前体细胞

本文介绍一种基于表观遗传重编程的实验方案，可将人类胚胎干细胞（hESCs）定向诱导为均一的骨骼肌前体细胞群体；在允许性培养条件下，这些前体细胞可形成具有收缩功能的三维肌纤维簇（肌球体），从而重现人类骨骼肌的生物学特征。...

通过表观遗传重编程由人胚胎干细胞生成肌球体

体外培养系统已证明对我们理解脊椎动物肌发生过程至关重要。然而，关于非哺乳类脊椎动物骨骼肌的发育与生长，尤其是在基部分类群中，仍有许多未知之处。建立一种高效且稳定的原代培养方案，用于分离该组织中的成肌前体细胞（MPCs）——即具有自我更新能力的成肌祖细胞，并维持其自我更新、增殖和分化能力，有助于揭示脊椎动物各谱系中保守与分化的调控机制。...

从基础脊椎动物谱系制备原代成肌前体细胞/成肌细胞培养物

从人类肌肉中获得的主要贴壁细胞类型为成肌细胞和成纤维细胞。本实验通过基于CD56抗原的磁性激活细胞分选技术对细胞群体进行富集。随后使用特异性抗体进行免疫标记，并结合图像分析技术，实现对单个细胞胞质和细胞核特征的定量分析。...

人骨骼肌中初级成肌细胞和成纤维细胞的分离与定量免疫细胞化学表征

本方案描述了一种从成年及老年个体的骨骼肌中分离和培养成肌细胞前体细胞的可靠、可重复且简便的方法。所使用的肌肉包括足部和腿部肌肉。该方法能够分离获得富集的原代成肌细胞群体，用于功能研究。...

成人及老年人大骨骼肌中肌源性前体细胞/原代成肌细胞的分离与培养

在此，我们介绍一种从成人肌肉组织中获取纯化人成肌细胞群体的方法。这些细胞可用于研究 体外 骨骼肌分化，特别是研究参与钙离子（Ca）相关过程的蛋白质2+...

人原代成肌细胞的分离、成肌分化评估及牵张激活钙内流检测

我们介绍了从骨骼肌活检组织中分离、培养、鉴定和诱导人原代肌前体细胞（hMPCs）的技术。...

从骨骼肌活检手术中分离、培养、鉴定及诱导人肌肉前体细胞分化

准确鉴定纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）和肌肉干细胞（MuSCs）对于研究其在生理和病理条件下的生物学功能至关重要。本方案提供了从成年小鼠肌肉中分离、纯化和培养FAPs与MuSCs的操作指南。...

FACS分离与培养未受干扰及损伤后小鼠骨骼肌中的纤维脂肪生成祖细胞和肌肉干细胞

本方案描述了从小鼠单个骨骼肌中分离肌肉干细胞和纤维脂肪形成祖细胞的方法。该方案包括单块肌肉解剖、通过荧光激活细胞分选法分离干细胞、免疫荧光染色评估纯度，以及通过5-乙炔基-2′-脱氧尿苷掺入实验定量检测S期进入情况。...

从单个骨骼肌中分离静息态干细胞群体

本方案通过组织解离、连续过滤、预贴壁及特定培养条件，提供了一种从成年和新生小鼠骨骼肌中分离和富集原代成肌细胞的标准化方法，可用于建立和维持由卫星细胞衍生的成肌细胞培养体系，以支持后续实验应用。...

分离骨骼肌卫星细胞以 体外 肌生成研究

学习从骨骼肌中分离成肌和脂肪前体细胞的方法，通过酶解消化和流式细胞术纯化细胞群体。该技术有助于研究组织再生过程中的细胞相互作用及再生医学应用。

从骨骼肌中纯化前体细胞

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