Name: RNAi的干扰双链RNA注射到果蝇胚胎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-11T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学习利用双链RNA注射技术敲低果蝇胚胎内源基因表达，研究器官发育关键基因。该方法可快速分析气管分支融合缺陷，为发育生物学提供高效的反向遗传学工具。

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作者谨向 Stephen Crews 致谢，感谢其提供的 dysfusion cDNA、Dys 抗体和 w1118 果蝇。

1. 胚胎收集
<ol>
<li>在 25°C 条件下设置培养笼，使用 2-4 日龄的 w1118 果蝇。在收集卵前 1-2 天期间，每天每小时更换一次葡萄汁培养基平板，以同步卵的收集时间</li>
<li>在 25°C 条件下收集胚胎 1 小时</li>
<li>切取一块矩形的葡萄汁琼脂，用刀片在其表面中央轻轻划一道浅痕，在琼脂上留下一条线</li>
<li>使用金属探针将胚胎从葡萄汁平板转移至葡萄汁琼脂片上，将胚胎沿直线排列，使胚胎的长轴与琼脂中央的划线呈 45 度角。排列约 50 个胚胎形成一条直线。确保所有胚胎朝向一致，后端远离中央划线</li>
<li>裁剪一块矩形双面胶带，将其贴附于 18×18 mm 盖玻片上</li>
<li>用带有双面胶的盖玻片拾取胚胎</li>
<li>将盖玻片放置于载玻片上，在空气中干燥胚胎约 10 分钟</li>
<li>用一层薄的 700 号卤碳油覆盖胚胎，即可进行显微注射</li>
</ol>
2. 拉制针头
通过拉制玻璃毛细管来制备显微注射针。我们使用世界精密仪器公司（World Precision Instrument）的拉针仪（型号 PUL-1）。拉针仪的程序参数设置为：加热温度 1，延迟时间 4。
3. 填充针头
使用配备 Eppendorf Microloader 吸头的 Eppendorf p20 移液器反向装填针头，通常加载 1.5–2 μL 的 dsRNA
4. 折断针头
<ol>
<li>在折断针尖之前，先将盖玻片放置在载玻片上。</li>
<li>准备一张载玻片，在其中央滴加一滴油。</li>
<li>打开Picospritzer III微注射仪，调节气压。</li>
<li>将装有溶液的针头在盖玻片边缘轻轻折断，形成一个尖锐的针尖。</li>
<li>当针尖断裂后，踩下Picospritzer III微注射仪的脚踏开关，部分dsRNA将从针尖处渗出。</li>
<li>取出带有盖玻片的载玻片。</li>
<li>将针头插入此前准备好的载玻片中央油滴下方。</li>
<li>调节Picospritzer III微注射仪的设置，使踩下脚踏开关时释放出100–200 pl的dsRNA；此时dsRNA可见为微小液滴。</li>
</ol>
5. 注射
<ol>
<li>将针尖移至第一个胚盘胚胎的后部，使其处于同一焦平面，并在偏离中心约卵长度30-50%的位置注射胚胎。</li>
<li>踩下Picospritzer III微量注射泵的脚踏开关后，少量dsRNA将在注射部位呈现为一个小点。</li>
</ol>
6. 表型分析
<ol>
<li>注射后，将载玻片放入盛有湿润滤纸的密闭塑料培养皿中，在18°C条件下孵育，直至胚胎发育至所需阶段。</li>
<li>使用探针将胚胎从双面胶带上取下，并推至盖玻片边缘。 
用正庚烷将胚胎从载玻片上冲洗至底部带有尼龙滤网的收集管中，再用PBT洗涤3次。 
用50%次氯酸钠溶液脱膜5分钟，再用PBT洗涤3次。 
将胚胎从收集管转移至一片尼龙滤网上，然后将尼龙滤网浸入固定液（5ml 正庚烷、4.5ml PBS、0.5ml 37%甲醛）中以释放胚胎。在固定液中固定30分钟。 
用甲醇去卵黄膜，将胚胎转移至EP管中，并按照标准流程进行免疫染色。</li>
<li>胚胎也可继续发育至适当的幼虫阶段。</li>
<li>在载玻片中央滴加一滴Halocarbon 700油</li>
<li>将一条幼虫转移至载玻片上，盖上盖玻片</li>
<li>在明场显微镜下观察幼虫。</li>
</ol>
7. 代表性结果：
图1展示了在果蝇胚胎中通过dsRNA敲低dysfusion（dys）基因的一个示例。注射GFP-dsRNA的胚胎作为阴性对照。Dys是一种在气管融合细胞中表达的bHLH PAS转录因子。注射GFP-dsRNA的胚胎显示出正常的气管融合，且融合细胞中存在Dys蛋白（图1A）。另一方面，注射dys-dsRNA的胚胎表现出分支融合失败，且融合细胞中不存在Dys蛋白（图1B）。当注射dsRNA的胚胎发育至幼虫阶段时，与注射GFP-dsRNA的阴性对照（图1C）相比，注射dys-dsRNA的幼虫表现出分支融合失败（图1D）。这些结果表明，通过向Drosophila胚胎注射dsRNA可有效敲低内源性dys基因的表达。
 <img src="/files/ftp_upload/2477/2477fig1.jpg" alt="GFP 和 dys RNAi 结果示意图；神经组织中 RNA 干扰对表达模式的比较" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 通过 dys-RNAi 去除 dys 功能揭示了气管融合缺陷。将囊胚期胚胎（w1118）分别注射 GFP-dsRNA（阴性对照）或 dys-dsRNA，并检测其气管发育缺陷。（A）注射 GFP-dsRNA 的 16 期胚胎，经 α-Dys 和标记气管管腔的单克隆抗体 MAb 2A12 染色。图中显著显示的是已融合的侧支气管。箭头指示侧支气管中 Dys 阳性的融合细胞。（B）注射 dys-dsRNA 的 16 期胚胎，经 α-Dys 和 MAb 2A12 染色。该胚胎显示侧支气管未能融合（星号表示在对照胚胎中侧支气管融合的正常位置）。未观察到 Dys 阳性细胞，表明 dys-RNAi 有效消除了 Dys 蛋白。（C 至 D）通过明场显微镜观察注射 GFP-dsRNA 或 dys-dsRNA 的二龄幼虫，以评估气管缺陷。（C）在注射 GFP-dsRNA 的对照幼虫中，融合位点由星号标示。（D）在注射 dys-RNAi 的幼虫中，侧支气管未能融合，星号（*）表示侧支气管正常应融合的位置。

<ol><li>St Johnston, D., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+pattern+and+polarity+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo.</a> Cell. 68, 201-219 (1992).</li>
<li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+technologies+for+gene+manipulation+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Emerging technologies for gene manipulation in Drosophila melanogaster.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 167-178 (2005).</li>
<li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+dsRNA-mediated+genetic+interference+to+demonstrate+that+frizzled+and+frizzled+2+act+in+the+wingless+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway.</a> Cell. 95, 1017-1026 (1998).</li>
<li>Misquitta, L., Paterson, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+gene+function+in+Drosophila+by+RNA+interference+%28RNA-i%29%3A+a+role+for+nautilus+in+embryonic+somatic+muscle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of gene function in Drosophila by RNA interference (RNA-i): a role for nautilus in embryonic somatic muscle formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 1451-1456 (1999).</li>
<li>Horowitz, A., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Branching morphogenesis.</a> Circ. Res. 103, 784-795 (2008).</li>
<li>Hogan, B. L., Kolodziej, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis%3A+molecular+mechanisms+of+tubulogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Organogenesis: molecular mechanisms of tubulogenesis.</a> Nat. Rev. Genet. 3, 513-523 (2002).</li>
<li>Ghabrial, A., Luschnig, S., Metzstein, M. M., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+morphogenesis+of+the+Drosophila+tracheal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Branching morphogenesis of the Drosophila tracheal system.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 19, 623-647 (2003).</li>
<li>Jiang, L., Crews, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfusion+transcriptional+control+of+Drosophila+tracheal+migration%2C+adhesion%2C+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dysfusion transcriptional control of Drosophila tracheal migration, adhesion, and fusion.</a> Mol. Cell. Biol. 26, 6547-6556 (2006).</li>
<li>Jiang, L., Crews, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+dysfusion+basic+helix-loop-helix+%28bHLH%29-PAS+gene+controls+tracheal+fusion+and+levels+of+the+trachealess+bHLH-PAS+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila dysfusion basic helix-loop-helix (bHLH)-PAS gene controls tracheal fusion and levels of the trachealess bHLH-PAS protein.</a> Mol. Cell. Biol. 23, 5625-5637 (2003).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文所介绍的dsRNA注射方法能够实现对基因功能的高度敏感且快速的分析 果蝇 气管发育。该方法有望用于分析其他组织和器官发育过程中的基因功能。

<table><tbody><tr><td>卤代烃油 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III 微量泵</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td>051-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>Fisher Scientific</td><td>21170M</td><td></td></tr><tr><td>微量加样头</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr></tbody></table>

通过向drosophila胚胎注射dsrna进行rnai干扰

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

基因筛选是研究复杂生物过程最强大的方法之一 1多年来，可用于遗传操作的多种改进技术和工具相继出现 果蝇 2在弗雷和梅洛最初发现后的不久 3 双链RNA可用于敲低单个基因的活性 秀丽隐杆线虫，RNA干扰（RNAi）被证明是一种强大的反向遗传学方法，可用于分析基因功能 果蝇 器官发育 4, 5.
许多器官，包括肺、肾、肝和血管系统，均由分支状管状网络构成，用于运输重要的液体或气体6, 7。Drosophila气管形成的分析为研究其他管状器官的形态发生提供了一个极佳的模型系统8。伯克利Drosophila基因组计划已发现数百个在气管系统中表达的基因。为了研究管腔形成的分子与细胞机制，关键挑战在于理解这些基因在气管发育中的作用。本文中，我们描述了一种将dsRNA注射到Drosophila胚胎中的详细方法，以敲低特定基因的表达。我们通过dsRNA注射成功敲低了内源性dysfusion（dys）基因的表达。Dys是一种在气管融合细胞中表达的bHLH-PAS蛋白，对气管分支的融合至关重要9, 10。dys-RNAi完全消除了dys的表达，并导致气管融合缺陷。这一相对简单的方法为鉴定Drosophila组织和器官发育所必需的基因提供了有力工具。

RNA干扰技术已被证明在分析Drosophila气管发育中基因功能方面非常有效。本文展示了姜实验室用于将dsRNA注射到果蝇胚胎中以敲低基因表达的详细实验方案。该技术有望用于筛选Drosophila组织和器官发育所必需的基因。

通过向Drosophila胚胎注射dsRNA进行RNAi干扰

基因筛选是研究复杂生物学过程最强大的方法之一1。多年来，该技术已取得诸多改进……

本实验的总体目标是通过向果蝇胚胎注射双链RNA，以敲低内源基因表达，从而鉴定器官发育所必需的基因。该目标首先通过收集胚胎并将其排列成一条直线来实现。接下来，制备显微注射针，并用于向胚胎中注射双链RNA。最后，将胚胎放入湿润的培养室中使其发育。最终，可通过对抗体染色的晚期胚胎进行观察，或在明场显微镜下检查幼虫，获得显示果蝇气管分支融合缺陷的结果。与现有的正向遗传筛选等用于鉴定器官发育所需基因的方法相比，该技术的主要优势在于，这是一种相对简单且快速的反向遗传学方法，可在目标基因的突变体尚未获得之前分析其基因功能。该方法有助于回答发育生物学领域的一些关键问题，例如鉴定气管系统发育所必需的关键基因。该模型是研究哺乳动物器官形态发生过程的优秀体系，如脊椎动物的呼吸道、循环系统、肾小管以及探索性上皮组织。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为掌握胚胎排列、针头断裂以及将链状RNA注射入胚胎等操作需要较长时间的学习。该方法的可视化演示至关重要，因为向不同胚胎注射双链RNA的量存在差异，而通过文字描述来说明合胞体期和成囊胚层胚胎的形态特征较为困难。这些步骤难以掌握，是因为向合胞体期的囊胚注射适量的双链RNA，是有效敲低内源基因表达的关键环节。首先，在25摄氏度条件下，使用2至4日龄的W 1118果蝇设置培养笼，每天每隔一小时更换一次葡萄汁培养板，持续一至两天，以同步化卵的收集。收集前，在25摄氏度条件下，收集同步化的时间点或blaster derm胚胎一小时，取一块矩形葡萄汁琼脂，然后用刀片在琼脂中部轻轻划一条线。使用金属探针将胚胎从葡萄汁培养基转移到葡萄汁琼脂块上。在琼脂中央，将约50个胚胎排成一条直线，使胚胎的长轴与该直线呈45度角排列。确保所有胚胎朝向一致，其后端均背离该直线方向。裁剪一块矩形双面胶带，将其粘贴在18 mm × 18 mm的盖玻片上。用盖玻片上的胶带拾取胚胎。将盖玻片放置在载玻片上。将胚胎轻轻按压到双面胶带上，让胚胎在空气中干燥约10分钟。用一层薄的700卤代碳油覆盖胚胎。等待约10分钟，直至在显微镜下观察胚胎变得清晰。通过拉制玻璃毛细管来制备显微注射用针头。我们使用世界精密仪器公司（World Precision Instruments）的拉针仪，并采用以下程序设置：加热一，延迟四，向后。使用 Einor P 20 移液器和 einor 微量加样吸头，将两微升双链 RNA 加载到针头中。准备一张载玻片，并在其上方放置一块干净的盖玻片，用胶带将两者固定在一起。将装有液体的针头紧贴盖玻片边缘，形成一个尖锐的尖端。双链RNA会从针尖泄漏出来。当踩下皮升注射泵的脚踏板时，准备一张载玻片，在中央滴一滴油，将针头插入油滴中。调节皮升泵的设置，使在踩下脚踏板时可排出 100 至 200 皮升的双链 RNA。双链 RNA 可见为一个小液滴状位置。第一个胚胎后

rnai-interference-by-dsrna-injection-into-drosophila-embryos

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

RNAi的干扰双链RNA注射到果蝇胚胎

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