通过向Drosophila胚胎注射dsRNA进行RNAi干扰

本实验的总体目标是通过向果蝇胚胎注射双链RNA，以敲低内源基因表达，从而鉴定器官发育所必需的基因。该目标首先通过收集胚胎并将其排列成一条直线来实现。接下来，制备显微注射针，并用于向胚胎中注射双链RNA。

最后，将胚胎放入湿润的培养室中使其发育。最终，可通过对抗体染色的晚期胚胎进行观察，或在明场显微镜下检查幼虫，获得显示果蝇气管分支融合缺陷的结果。与现有的正向遗传筛选等用于鉴定器官发育所需基因的方法相比，该技术的主要优势在于，这是一种相对简单且快速的反向遗传学方法，可在目标基因的突变体尚未获得之前分析其基因功能。

该方法有助于回答发育生物学领域的一些关键问题，例如鉴定气管系统发育所必需的关键基因。该模型是研究哺乳动物器官形态发生过程的优秀体系，如脊椎动物的呼吸道、循环系统、肾小管以及探索性上皮组织。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为掌握胚胎排列、针头断裂以及将链状RNA注射入胚胎等操作需要较长时间的学习。

该方法的可视化演示至关重要，因为向不同胚胎注射双链RNA的量存在差异，而通过文字描述来说明合胞体期和成囊胚层胚胎的形态特征较为困难。这些步骤难以掌握，是因为向合胞体期的囊胚注射适量的双链RNA，是有效敲低内源基因表达的关键环节。

首先，在25摄氏度条件下，使用2至4日龄的W 1118果蝇设置培养笼，每天每隔一小时更换一次葡萄汁培养板，持续一至两天，以同步化卵的收集。收集前，在25摄氏度条件下，收集同步化的时间点或blaster derm胚胎一小时，取一块矩形葡萄汁琼脂，然后用刀片在琼脂中部轻轻划一条线。

使用金属探针将胚胎从葡萄汁培养基转移到葡萄汁琼脂块上。在琼脂中央，将约50个胚胎排成一条直线，使胚胎的长轴与该直线呈45度角排列。确保所有胚胎朝向一致，其后端均背离该直线方向。

裁剪一块矩形双面胶带，将其粘贴在18 mm × 18 mm的盖玻片上。用盖玻片上的胶带拾取胚胎。将盖玻片放置在载玻片上。

将胚胎轻轻按压到双面胶带上，让胚胎在空气中干燥约10分钟。用一层薄的700卤代碳油覆盖胚胎。等待约10分钟，直至在显微镜下观察胚胎变得清晰。

通过拉制玻璃毛细管来制备显微注射用针头。我们使用世界精密仪器公司（World Precision Instruments）的拉针仪，并采用以下程序设置：加热一，延迟四，向后。

使用 Einor P 20 移液器和 einor 微量加样吸头，将两微升双链 RNA 加载到针头中。准备一张载玻片，并在其上方放置一块干净的盖玻片，用胶带将两者固定在一起。将装有液体的针头紧贴盖玻片边缘，形成一个尖锐的尖端。

双链RNA会从针尖泄漏出来。当踩下皮升注射泵的脚踏板时，准备一张载玻片，在中央滴一滴油，将针头插入油滴中。

调节皮升泵的设置，使在踩下脚踏板时可排出 100 至 200 皮升的双链 RNA。双链 RNA 可见为一个小液滴状位置。

第一个胚胎后部的针尖按压皮升注射泵的脚踏板。双链RNA将作为一小滴出现在注射部位。

完成向载玻片上胚胎注射双链RNA。杀死所有非爆皮幼虫表皮的胚胎。将盖玻片放入湿润的密闭培养室（例如塑料培养皿）中，在18摄氏度下孵育，直至胚胎发育至所需的胚胎期或幼虫期。

对于已发育至目标胚胎阶段的胚胎，使用探针将胚胎从双面胶带上取下，并推至盖玻片边缘。用庚烷将胚胎冲洗至底部带有尼龙网的收集管中。用含50%次氯酸钠的PB溶液洗涤胚胎三次，每次五分钟，随后再用PBT溶液将胚胎洗涤三次。

用移液管将胚胎从收集管转移到尼龙网膜上，将尼龙网膜浸入固定液中，固定胚胎30分钟。去除下层固定液。

然后用甲醇固定胚胎，将胚胎转移至一个离心管中，并利用标准的胚胎抗体染色方案，使用A 12和diffusion抗体对已发育至目标幼虫阶段的胚胎进行免疫染色。准备一张载玻片，在中央滴加一滴卤代碳700油，在油滴两侧各放置一小块盖玻片。将一条幼虫转移至载玻片上，然后在油滴上方加盖一片盖玻片。

在明场显微镜下观察幼虫。此处展示了扩散性双链RNA和GFP双链RNA注射的代表性结果。

注射了GFP双链RNA的胚胎显示出正常的气管融合，且融合细胞中存在扩散蛋白。箭头指向侧纵干扩散阳性融合细胞，星号指示正常融合的位置。

然而，注射双链RNA的胚胎表现出分支融合失败，且融合细胞中不存在扩散蛋白。当注射双链RNA的胚胎发育至幼虫阶段时，三角形指示了分支融合失败的位置。G-F-P-R-N AI幼虫表现出正常的气管分支融合，由星号标示。

另一方面，扩散 RN AI 幼虫表现出分支融合失败，由三角形指示。这些结果表明，通过向果蝇胚胎注射双链 RNA，可敲低内源性扩散基因表达，从而产生相应表型。在进行该操作时，重要的是要记住，在胚胎发育完成后，必须清除所有 enseal blaster 胚胎。

该技术为发育生物学领域的研究人员探索新基因在果蝇器官发育中的功能铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过向果蝇胚胎注射双链RNA来敲低内源基因。