Name: 从整个成年果蝇大脑细胞记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 学习成年果蝇全脑单细胞全细胞膜片钳记录技术，包括脑组织分离、GFP标记神经元可视化及电生理记录方法。该技术为神经环路功能研究提供可靠的实验方案。

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本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 NS27501（授予 DKOD）的支持。此外，霍华德·休斯医学研究所（HHMI）教授项目基金（授予 DKOD）也为本研究提供了额外支持。

一、成年果蝇脑组织的解剖
<ol>
<li>在35 mm培养皿中央加入一小滴解剖液（约100 µl）。</li>
<li>使用吸管捕获成年雌蝇。在解剖显微镜下，用两根注射针将果蝇头部切断。</li>
<li>将头部放入培养皿中的一小滴含有木瓜蛋白酶的解剖盐溶液中。</li>
<li>将头部放置为喙部朝向培养皿底部。</li>
<li>用针1固定覆盖左复眼的表皮，用针2在针1稍内侧处从背侧向腹侧做一斜向切口。</li>
<li>用针1固定口器，用针2在喙基水平位置从左眼腹侧表面横向切割至右眼。</li>
<li>用针1固定覆盖右复眼的表皮，用针2在针1稍内侧处从背侧向腹侧做一斜向切口。</li>
<li>旋转头部，使吻侧朝下贴附于培养皿表面。将针1插入吻侧表皮与脑之间，再用针2沿针1路径推进。理想情况下，脑囊应连同两侧视叶一起被剥离出来，因为视叶对于稳定脑组织以进行记录至关重要。</li>
<li>使用两把尖头镊子小心去除气管、气囊及其他结缔组织。</li>
<li>整个解剖过程应耗时3–10分钟。</li>
</ol>
二、中枢神经系统的固定
<ol>
<li>使用黄色枪头移液器将脑组织转移至记录室。</li>
<li>在记录室中，通过放置铂金框架使两根细小的十字丝接触视叶与中央脑区交界处的组织，从而固定脑组织。</li>
<li>每个脑组织在记录室中静置至少10分钟，期间持续用含氧盐溶液（95% 氧气和 5% 二氧化碳）灌流。整个记录期间持续灌注含氧盐溶液。使用直立显微镜（Axioskop 2FS；Zeiss，Oberkochen，德国），配备固定载物台、40倍水浸物镜（Achroplan；数值孔径，0.8；Zeiss）和微分干涉（Nomarski）光学系统观察样本。GFP 通过 BP 505-530 荧光滤光片观察。</li>
</ol>
三、电生理学
<ol>
<li>使用 8-14 MΩ 的移液管进行全细胞记录</li>
<li>采用 List EPC7 或 Axopatch 200B 放大器、Digidata 1322A 数模转换器（Molecular Devices，Foster City，CA）、Dell Dimension 8200 计算机（Dell Computer，Round Rock，TX）以及 pClamp 9 软件（Molecular Devices）进行电流钳和电压钳记录</li>
</ol>

<ol><li>Gu, H., O Dowd, D. K., K, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+synaptic+transmission+in+Adult+Drosophila+Kenyon+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cholinergic synaptic transmission in Adult Drosophila Kenyon cells in situ.</a> Journal of Neuroscience. 26, 265-272 (2006).</li>
<li>Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+olfactory+representations+in+the+Drosophila+antennal+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe.</a> Science. 303, 366-370 (2004).</li>
</ol>

本视频中展示的分离完整脑制备方法可用于评估成年黑腹果蝇（Drosophila）脑内特定神经元（包括嗅觉处理通路中的神经元）兴奋性及突触传递的细胞机制（Gu 和 O'Dowd，2006）。该方法可作为研究完整成年黑腹果蝇脑内神经元活动的补充手段（Wilson 等，2004），其关系类似于哺乳动物脑切片中神经元记录与清醒行为哺乳动物体内记录之间的互补关系。与哺乳动物脑切片相比，果蝇脑原位制备具有两个主要优势。首先，整个果蝇脑可轻松放入记录室中，因此无需像制备哺乳动物脑切片那样从较大的神经环路中切除一小块组织，从而使得分离的黑腹果蝇脑内的神经环路在很大程度上保持完整。其次，大多数神经元的胞体位于脑表面附近，易于进行全细胞记录，并且在持续灌注含氧生理盐水数小时后仍能保持功能活性。

使用玻璃底记录室还可以根据神经元的位置和/或GFP表达来鉴定特定神经元。在此制备过程中，灌流期间的记录需要对脑组织进行稳定。由于整个脑组织体积较小（约1 mm），传统的固定方法（如 strategically placed gold wire 或 nylon mesh）虽适用于海马切片等组织，但在此并不适用...

<table><tbody><tr><td>#5 镊子</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>No. 11251-10</td><td>小心操作，切勿损坏镊子的精细尖端</td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>试剂</td><td>沃辛顿生物化学</td><td>3126</td><td>20 U/ml，由1 mM L-半胱氨酸激活</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>SMZ-2B 型号：C-PS</td><td>尼康仪器公司</td><td></td><td>配备低角度鹅颈式光纤灯</td></tr><tr><td>针 &amp;和注射器 </td><td></td><td>PrecisionGlide&amp;#174;，Becton Dickinson 公司</td><td>305175 &amp;& 309602</td><td>廉价且耐用</td></tr><tr><td>直立显微镜</td><td>Axioskop2 FS plus</td><td>卡尔·蔡司股份公司</td><td></td><td>配备固定载物台、40倍水浸物镜、诺马尔斯基光学系统及荧光灯</td></tr><tr><td>膜片钳放大器</td><td>200 B</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata D-A转换器 </td><td>1322A</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

成年果蝇脑组织的全细胞记录

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

在本视频中，我们演示了从成年果蝇中完整分离脑组织的实验步骤，为进行单个神经元的记录做准备。首先介绍本研究所用的解剖液以及成年雌性果蝇的收集方法。随后展示了完整取出包括双侧视叶在内的整个脑组织的操作过程，并说明了覆盖在脑组织表面的气管的剥离方法。分离出的脑组织不仅体积微小，且在此阶段需特别小心操作，以避免损伤神经元，因为许多神经元靠近组织的外表面。我们展示了如何使用自行设计的特殊固定装置，将脑组织稳定在记录室中。采用标准的电生理记录系统，对单个或成对的神经元进行记录。通过记录显微镜观察来自驱动GFP表达的GAL4品系（GH146）的荧光图像，说明了如何在活体脑组织中识别投射神经元（PNs）。高倍诺马尔斯基微分干涉相差（Nomarski）图像展示了一个正被靶向进行全细胞记录的单个神经元。当脑组织被成功无损地取出后，大多数神经元会自发活动，产生动作电位和/或表现出自发的突触输入。这种原位制备方法，可将全脑中已鉴定神经元的全细胞记录与遗传学及药理学干预手段相结合，是研究成年中枢神经系统（CNS）细胞生理学与可塑性的一个有效模型。

关键词：果蝇，成年脑分离，全细胞记录，投射神经元，电生理学，中枢神经系统，GH146，GFP，解剖液，神经元活性

本视频演示了从成年果蝇中分离完整大脑的实验步骤，为使用标准全细胞记录技术对单个神经元进行电生理记录做准备。内容包括记录过程中观察到的GFP标记细胞和神经元的图像。

在本视频中，我们演示了从成年果蝇中分离完整大脑以进行单个神经元记录的实验步骤。我们首先……

我的名字是，我是加州大学尔湾分校解剖学与神经生物学系的一名助理专家。今天我将向您讲解如何对PHA脑组织进行全脑记录的实验步骤，该制备过程中的关键步骤包括如何脱颈处死动物、如何取出脑组织，以及如何去除脑表面的血管系统和软脑膜。今天我将向您介绍如何配制用于成年小鼠脑组织全细胞记录的灌注解剖溶液。第一步是配制溶液，第二种溶液非常关键，是制备成年脑组织样本的重要前提。首先，我将五毫升的灌注溶液加入到这个离心管中。然后，这里我还有另一个小管。我将在此试管中加入一毫升的记录溶液，加入一些胰蛋白酶，然后制备这种胰蛋白酶溶液。我将上下吹打以充分混匀，制成良好的胰蛋白酶溶液。然后，我将从此瓶中取出100单位的胰蛋白酶。然后将此 pepane 加入到该 Centro 离心管中。此时可观察到溶液呈浑浊状态，接着再加入 100 µL 的 cy，充分混匀。10 分钟后，溶液将变得澄清，所有晶体均会消失。因此，该溶液将可直接用于解剖。使用此溶液的最佳时间是在将细胞松弛素（cytochalasin）与戊二醛（pepandialdehyde）混合后30分钟。接下来我将演示如何从该试管中收集一只雌性果蝇，因为此处有数百只果蝇。但我将使用这个吸管从这里捕捉雄性和雌性果蝇。不过实际上，在实验中我们只使用雌性进行记录。我们更倾向于使用雌性果蝇进行全脑记录。雌蝇的腹部较大且带有白色胶带，而雄蝇的腹部较小，并具有抱握器和 duct tape。在解剖雌蝇后，我将切除蝇的头部并取出脑组织。使用两根27号针头。获得雌性果蝇后，我将使用一根针插入其CX神经节，从而通过该运动系统使果蝇瘫痪。随后，我将用另一根针将果蝇固定。接着，我将果蝇头部置于培养皿的中央位置。现在我需要在每只手中各加入一份消化溶液。我手持一支1毫升的注射器，装有27号针头。现在你可以看到腹侧朝向我，背侧朝向北侧。这一步，我将用右侧的针在右眼处切开一个切口。现在，我用右侧的针切断 ssis，并在左眼处制作另一个前-后向切口（SL），该切口从腹侧延伸至背侧表面。此时，脑部已有三个切口，然后我将头部翻转，使触角朝下，置于培养皿上。然后，我将左侧的针插入角质层与脑组织之间的空隙，并用右侧的针轻轻取出脑组织。脑组织应完整取出，同时保留两侧的视叶及带色素的眼组织。现在，我已将头部离体，并移除了脑组织。现在是使用酶溶液处理脑组织的合适时机，该溶液含有木瓜蛋白酶，并可去除TRICARE系统。接下来，我想将脑组织放入含有木瓜蛋白酶的解剖溶液中孵育五分钟。你可以看到，在脑组织灌注后，解剖溶液在桌面上静置30分钟已变得澄清，此时解剖溶液中的TRICARE系统以及GL组织均已软化，因此我更容易使用两把尖锐的5号镊子去除所有血管和结缔组织。这一点非常重要，因为如果你无法清除气管和周围组织，这些组织会堵塞你的电极。当你接近目标神经元准备记录时，我会将脑组织从这种解剖液转

whole-cell-recordings-from-brain-of-adult-drosophila

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

从整个成年果蝇大脑细胞记录

对黑腹果蝇（Drosophila）胚胎进行电生理记录，可分析发育中肌肉和神经元的电学特性，并表征谷氨酸能神经肌肉接头以及中枢胆碱能和GABA能突触的功能性突触形成过程。...

电生理记录在 果蝇 胚胎

同时记录黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中已鉴定神经元的钙信号与摄食行为

本视频介绍了如何解剖和分离成年 Drosophila 大脑——这一操作是可视化该器官所必需的步骤，因为大脑通常被外骨骼、眼睛和气管组织遮挡。示例方案详细展示了获得高质量样本的完整过程，这些样本可用于 Drosophila...

Drosophila 成虫脑解剖：果蝇神经生物学中的一种方法

该视频展示了从黑腹果蝇幼虫中枢神经系统（CNS）进行神经元活动的细胞外记录。将切断的中枢神经系统置于记录室中，记录下行神经的电活动，以确定其基础放电频率。随后引入测试剂，记录放电频率的变化，以判断该试剂的兴奋性或抑制性作用。...

细胞外记录神经元电活动 果蝇 中枢神经系统

尖锐的微电极能够准确表征活体果蝇（Drosophila）中感光细胞和视觉中间神经元的电生理输出。本文介绍了如何利用该方法记录单个细胞在可控光照刺激下高质量的电压反应。该方法非常适合研究昆虫复眼中神经信息的处理过程。...

记录细胞内电压反应的电生理学方法 果蝇 光感受器与中间神经元对光刺激的反应 在体 内

Drosophila melanogaster 光感受器的全细胞记录可用于测量在不同条件下产生的自发性暗脉冲、量子脉冲、对光的宏观反应以及电流-电压关系。结合 D. melanogaster 的遗传操作工具，该方法可用于研究普遍存在的肌醇脂质信号通路及其靶标——TRP...

全细胞电压钳记录的电生理学方法 果蝇 光感受器

本文介绍了一种利用河豚毒素和河豚毒素抗性钠通道NaChBac来检测神经元之间单突触连接的方法。...

检测单突触连接 果蝇 利用河豚毒素抗性钠通道

本方案描述了一种记录黑腹果蝇（Drosophila...

Drosophila Melanogaster 三龄幼虫中枢神经系统活动的电生理记录

我们介绍一种专门用于在成年黑腹果蝇（Drosophila）行为过程中及其对刺激响应时对其全脑进行成像的方法。该方法通过固定果蝇头部，使其大脑获得完整的光学通路，同时果蝇仍可活动其足部，其触角、喙端以及眼睛能够接收感觉刺激。...

准备成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）以进行行为和刺激响应期间的全脑成像

在此，我们介绍一种实验方案 离体 在表达GCaMP6的成年个体中进行钙成像 果蝇 以监测癫痫样活动。该方案为研究成人中的发作事件提供了一种有价值的工具 果蝇 通过 离体...

Ex Vivo 钙成像用于癫痫的Drosophila模型

研究学习和记忆等认知过程中细胞活动的一个重要障碍是使用麻醉剂 体内 成像前准备。麻醉在多种模型中会损害短期记忆和认知功能，包括 果蝇 本研究介绍了一种制备成年 果蝇 用于 体内 无麻醉成像...

在活体成像未麻醉的果蝇成虫中的神经活动

学习成年果蝇全脑单细胞全细胞膜片钳记录技术，包括脑组织分离、GFP标记神经元可视化及电生理记录方法。该技术为神经环路功能研究提供可靠的实验方案。

成年果蝇脑组织的全细胞记录

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