在三维神经干细胞培养中定位蛋白质：一种混合可视化方法学

在悬浮培养条件下，从脑内神经发生区分离得到的神经前体细胞会增殖形成神经球。本文展示了如何分离出生后海马来源的悬浮神经球，并对其进行连续切片，以定位蛋白质在三维神经球结构中的表达分布。我们将以连接蛋白29（Conexion 29）为例，进行免疫染色，随后将二维显微图像进行整合与重构，生成神经球的三维重建图像。

在天然三维结构（如悬浮的神经球或组织）的背景下观察蛋白质，有助于更好地理解蛋白质功能与其在这些结构中所处位置之间的关系，同时也有助于推断那些定位已知但功能未知的蛋白质可能遵循的作用规律。大家好，我是来自渥太华大学神经再生实验室的Sophia Ambo。我是来自渥太华卡尔顿大学卡尔顿沉浸式媒体工作室的Nicholas Valenzuela。

今天我们将演示如何分离、扩增并连续切片海马来源的出生后神经前体细胞，即神经球。为了通过免疫染色定位蛋白质表达，随后我们将利用免疫染色后获得的神经球连续切片的二维图像，展示一种重建神经球三维结构中细胞及蛋白质位置的方法，从而评估蛋白质表达在神经球内的空间分布情况。现在让我们开始吧。

脑组织采集后，需制备一个平坦的表面，以便将其正确固定在样品台（chuck）上，此步骤称为修块。使用剃刀刀片和镊子对小脑进行修块。

接下来，在卡盘上滴一滴瞬间胶，将第一块脑组织固定于其上，腹侧朝上，背侧朝向操作者。其余脑组织依同样方式处理；对于最后一块脑组织，建议将背侧朝远离操作者的方向放置，因为在此方向切割有时可能不完全。若出现切割不完全的情况，可使用解剖刀进行切开并收集该切片。

粘附步骤的关键在于速度，因为脑组织不能长时间暴露在空气中。一旦所有脑组织都粘附完毕，即将样品台放入振动切片机中，并向切片机槽内加入冰冻的脑脊液（CSF）。

将振动切片机的频率设置为8.5，速度设置为3.5至4.5。使刀片接触A脑脊液（A CSF），并设置自动切片。现在我们将切割500微米厚的切片。

保留含有海马体的脑片，将其放入盛有冰冻人工脑脊液（aCSF）的培养皿中，其余脑片弃去。待所有脑片收集完毕后，进行海马体解剖。

使用体视显微镜，我们仅采集背侧海马体，位置大约在脑区坐标（bgma）-1.65 毫米至 -2.10 毫米之间。将海马体组织置于一个空的冰冷培养皿中。当所有海马体组织均从脑片中收集完毕后，即可将其转移至超净工作台进行机械解离。

使用手术刀时，先用70%乙醇喷洒刀片，然后过火灭菌。用手术刀切割组织，直至其呈现液态。接着使用已含有pepase DNAs和神经蛋白酶的解离培养基，通过移液收集组织，并转移至15毫升离心管中。

进行酶解消化时，将试管放入设定为37度的旋转烘箱中，消化反应持续45分钟至1小时。消化完成后，加入10毫升无菌组织培养用PBS以终止酶反应，然后在300 × g下离心5分钟。弃去上清液，重悬沉淀物。

在5 mL PBS中，使用巴氏吸管吹打样本以进一步解离组织。持续吹打直至组织块不再变小。此时，再次离心收集细胞沉淀。

移除 PBS，并将沉淀重悬于 3 毫升维持培养基中。充分吹打混匀样品后，取 15 微升等分试样，与等体积的台盼蓝混合。

取两份10微升样品，加载至血细胞计数板进行细胞计数。每份样品计数三个视野，共六个视野。取平均值以计算细胞密度。

需注意样本已被稀释。在六孔板中，将细胞接种于低黏附培养皿内，每皿细胞密度为2.5 × 10⁵ 个细胞，终体积为5 mL维持培养基。若无低黏附培养皿，可使用培养皿替代。

在此情况下，前六天每天上午和下午均需轻轻敲击培养皿，以防止神经球贴壁。将培养皿放入培养箱前，需添加EG、F和FGF。整个培养期间，这些生长因子需每两天补充一次。体外培养第14天时，直接向培养液中加入甲醛，使其终浓度达到约4%，于室温孵育20分钟，对神经球进行固定。

将细胞在300 × g条件下离心5分钟，轻轻摇动使细胞成团。用PBS洗涤细胞两次，然后重悬于15%至20%的蔗糖溶液中（溶于10 mmol/L磷酸盐缓冲液）。在切片前，于4°C下冷冻保护至少24小时。

从冰箱中取出经冷冻保护的神经球，放入60毫米培养皿中。对于需要连续切片且完整收集每一张切片至关重要的实验，我发现最好在体视显微镜下挑选大小和形态良好的神经球，然后用移液器将神经球转移至装有OCT包埋剂的冷冻模具中。在冷冻模具上标记神经球所在的位置。

此步骤将有助于在切片过程中定位神经球。将5到10个神经球迅速放入模具后，使用CO2将其冷冻。根据冷冻模具上的标记，直接在冻结的OTC包埋块上标出神经球的位置。

从模具中取出OCT包埋块，并将其放置在冷冻切片机的样品夹头上。使用CO2将模具固定在夹头上，然后放入冷冻切片机中。让样本至少平衡30分钟。

完成此操作后，迅速沿模具上的标记处进行切割，随后开始收集每一个切片。使用光学显微镜检查神经球切片的起始位置。切片完成后，将载玻片存放在冰箱中，直至准备进行免疫化学染色。在此步骤中，取出包含一系列连续切片神经球的载玻片，并同时取此前的五个切片和此后的五个切片一并进行后续处理。

这将确保您能够成像整个神经球的全部区域。使用细胞核复染剂对于定位神经球的所有切片至关重要，因此在规划免疫染色方案时请务必考虑这一点。在对切片进行操作时，先加入 PBS 并使其在室温下至少平衡五分钟。我们使用含有 0.3% Triton X-100 用于通透处理，并含有 3% 牛血清白蛋白用于封闭的抗体缓冲液。

将一抗用此缓冲液适当稀释后，于4°C在人源样本室中孵育过夜。用PBS漂浮神经球上的多聚甲醛，并用镊子小心移除。这是四次五分钟PBS洗涤中的第一次。

将二抗加入载玻片，并在室温下孵育一小时。与之前相同，用 PBS 漂洗去除载玻片上的多聚甲醛，并用镊子将其移除。同样，这是四次五分钟 PBS 洗涤中的第一次。

在第三次洗涤中，我们加入HOS 3 3 2, 5 8作为细胞核复染剂，其浓度稀释至0.5微克/毫升。在PBS中进行一次额外的五分钟洗涤，紧随HOS染色后的洗涤步骤。所有洗涤步骤完成后，在载玻片底部滴加足量封片介质，并用玻璃盖玻片覆盖。

用指甲油固定盖玻片的四个角。待所有载玻片加盖盖玻片后，固定其余的盖玻片边缘。应立即进行成像，或在 -20 °C 下保存，直至准备成像时使用。

在成像过程中，最难的部分是在载玻片上找到细胞；如果使用细胞核复染剂来寻找细胞，则很容易识别出属于神经球的细胞。一旦找到神经球的起始位置（可能仅由少数几个细胞组成），随后应对每个切片进行成像，拍摄细胞核染色图像、目标蛋白（或多个目标蛋白）的图像以及相差图像。

此相差图像在建模阶段将非常重要。将使用开放实验室3.56软件建立的带有10微米和50微米比例尺的图像导入Photoshop，采用3,300 × 2,550像素的标准画布尺寸。

所有连续切片图像均以 TIFF 文件格式保存，并保持标准画布尺寸。打开神经球连续切片的第一相和第二相对比图像。在图像选项卡下降低第二张切片的不透明度，打开图像旋转功能并选择任意角度。

旋转第二个切片，直到能够识别图像之间的几何和结构连续性。对所有连续切片重复此操作，将每个切片保存为单独的图层。确保对应于相位和蛋白质表达的每个图像图层均相互链接，以便对各通道的所有旋转操作同时进行。

在Maya中创建一个与Photoshop文件比例相同的平面，该比例可从Maya用户界面的状态栏获取。将菜单栏从默认的动画设置更改为曲面。选择一个基本的细分球体来创建细胞主体。

通过右键单击对象并在标记菜单中选择顶点，开始操纵其顶点。进一步，通过主菜单的细分曲面选项卡中的标记菜单更改显示级别，以细化球体表面。打开折叠层级选项框，并将层级数设置为2。

收拢球体。在选中球体的情况下，将菜单栏从“曲面”更改为“多边形”。在主菜单的网格选项卡中打开雕刻几何体工具。

使用工具设置选项卡中的雕刻几何体工具集，将细胞表面修整至最终形态。对您所构建的细胞类型中的每个细胞重复此过程，以模拟神经球中存在的多种前体细胞。

在此演示中，10 种不同的祖细胞将构成神经球的基础。选择细胞类型，并对属于该类型的细胞冻结其形态转化。将设计两种表面着色器，分别用于表示表达连接蛋白 29 的细胞和不表达该蛋白的细胞。

从主菜单的“窗口渲染编辑器”选项卡中打开超材质窗口。从表面材质选项卡中选择一个渐变着色器。打开属性编辑器，并设置着色器颜色、白炽环境颜色、凹凸贴图以及高光颜色属性。

将布朗运动3D纹理指定给环境颜色节点，并将2D分形纹理指定给凹凸贴图节点。选择生成的着色器输入和输出连接，并导出所选网络。选择细胞拓扑结构，然后打开导出选择选项框。

选择 Maya ASCII 文件类型，并取消勾选“包含以下输入”框中的导出选项。在 Adobe Photoshop 中打开对齐的连续切片文件。建立一套铅笔笔画图例，用于标记每个前体细胞在连续切片中的位置。

在本示例中，使用一个三划的标记：一个实心方块、一个带虚线的方块以及一个带交叉线的方块，分别用于表示某个细胞位于一个、两个或三个区域中。

该笔画关键图中，以红色表示表达Conexion 29的细胞，白色表示不表达Conexion 29的细胞。打开相位图层，使用白色铅笔标记每个前体细胞的中心位置。在章节文件夹内使用单独的图层来构建您的图谱。

在不同切片之间切换以确定细胞的位置，确保跨越多个切片的细胞被准确标注。开启 CX 29 层后，选择位于 CX 29 阳性表达区域内的细胞。

从 Photoshop 主菜单栏的“编辑”选项卡中选择填充命令，将完成地图中的白色描边更改为红色。将每个部分另存为单独的 JPEG 图像，保存至 Maya 项目中的源图像文件夹。为此，首先需要从 Maya 用户界面的状态栏创建一个新的 Maya 项目。

将菜单栏从默认的动画设置更改为多边形，导入平面。在平面选定后，从项目所见文件夹中导入 do ma 和 scale bar.ma 文件。

通过在对象上单击鼠标右键，并在属性编辑器中打开“指定新材质”选项卡，来分配一个Lambert着色器。在弹出菜单中，单击材质颜色属性右侧的棋盘格方块。在属性编辑器的文件属性部分下方的2D纹理区域中，选择“文件”。

单击图像名称属性右侧的文件图标。从源图像文件夹中选择第一部分。通过打开该面板的标签，将工作区窗口的摄像机从透视视图切换到默认的正交俯视图。

从主菜单的网格选项卡中选择创建多边形工具，并描出该区域的轮廓。从源图像文件夹中选择第一张地图，并将其分配给新创建的多边形平面。在已选定对象的情况下，按照创建多边形平面的步骤操作，通过在平面上单击鼠标右键打开标记菜单，选择UV选项。

选择所有平面的UV点，然后从主菜单的“窗口”选项卡中打开UV纹理编辑器，按比例缩放UV，使其适配当前剖面平面。对神经球的每个部分重复此过程，确保各部分之间的间距等于Maya用户界面状态栏中比例尺的高度。将菜单栏从默认的动画设置更改为动力学设置，并仅保留神经球的第一部分可见。

打开主菜单中显示选项卡下的CV曲线工具设置框，通过更改显示设置来隐藏所有其他部分，在CV曲线设置中选择一条线性曲线。从顶部视图摄像机观察场景，开始为细胞图分配点，分别为CX 29阴性细胞和CX 29阳性细胞创建一条曲线。从侧视图摄像机观察时，所得到的曲线呈平坦状。

通过沿 Y 轴移动曲线上各点来估算神经球各切片的厚度，以比例尺作为参考。对神经球的每个切片重复此过程。

从项目的 scenes 文件夹中导入细胞类型 ma 文件，并为 CX 29 阴性和 CX 29 阳性祖细胞分别复制该细胞类型。在主菜单的窗口渲染编辑器选项卡中打开超材质窗口。

从大纲窗口导入先前构建的着色器，并将其分配给类型学中的各个单元。删除导入对象名称开头的文件名。此步骤在建模过程的后续阶段将变得尤为重要。

从主菜单中选择“粒子”选项卡，并为第一条CV曲线创建一个粒子发射器。打开粒子形状选项卡，在发射属性下，将最大数量从负一更改为第一条曲线上的点数。在渲染属性选项卡中，将粒子渲染类型更改为“团状表面”。

单击下方当前的渲染类型框，将粒子的半径更改为 0.01。首先选择粒子，然后按住 Shift 键选择曲线，将粒子附加到曲线的顶点上。

在主菜单的“粒子”选项卡中打开目标选项，将目标权重设置为1。单击创建。在大纲窗口中按顺序选择编号从1到10的细胞，然后在主菜单的“粒子”选项卡中打开即时替换选项框。

在实例对象框中，应按顺序列出全部10个细胞。从“粒子对象以实例化”选项卡的下拉列表中选择正确的粒子形状名称。单击“创建”。默认情况下，仅有最初选中的第一个细胞会沿曲线替换粒子；为了使全部10个细胞均显示出来，并在粒子间随机循环，需要使用表达式。

第二个表达式将确保细胞每次发射时都以相同的方式随机发射。在选中发射器的情况下重新调整范围滑块。在粒子形状标签下的“添加动态属性”中打开属性编辑器。

单击长名称下方的通用框。在属性类型中输入 random_underscore_index，将标量切换为逐粒子数组，然后在逐粒子数组属性选项卡中点击添加。此时，random_underscore_index 框已被添加。

在空白区域单击鼠标右键，从下拉框中选择“创建表达式”。在表达式框中输入以下文本以完成表达式。打开属性编辑器中的即时搜索几何体替换选项卡，以及常规选项中的对象索引。

从下拉列表中选择随机下划线索引。将时间滑块移至第一帧并点击播放。此时，细胞类型已随机分布在各颗粒中。

对每个神经球切片重复此过程。确保在渲染的大纲窗口中，每个新的发射器实例和随机索引均通过名称加以区分并适当组织。在渲染设置窗口的部分中，将渲染器从 Maya 软件更改为 mental ray。

打开质量选项卡，在光线追踪中将反射设置更改为零。打开帧缓冲选项卡，将颜色裁剪从原始更改为 Alpha 并取消勾选预乘。

打开通道盒图层编辑器，将图层编辑器的设置从显示更改为渲染。选择导入的拓扑结构细胞，然后单击“创建新图层并分配所选对象”图标。将该图层重命名为环境光遮蔽。

在新创建的图层上单击鼠标右键，从渲染图层框右侧的菜单中选择属性。单击预设按钮，然后从下拉列表中选择环境遮蔽（occlusion）。选择 MIB_amb_occlusion 1 选项卡，并将采样数从 16 更改为 256。

重新打开通道盒图层编辑器，在选项选项卡下，打开渲染所有图层选项框，选择合成并保留环境闭塞图层处于选中状态。在图层列表上方的下拉框中，将混合模式从“正常”更改为“正片叠底”，对神经球进行两次渲染：第一次开启环境闭塞图层，第二次开启主图层。将图像保存为 IFF 文件，存储至项目图像文件夹中。

在 Adobe Photoshop 中打开两张图像。将环境光遮蔽图层置于主图层上方，并设置为“正片叠底”模式。创建背景并合并图像图层。

我们刚刚向您展示了如何培养源自海马体的神经前体细胞形成神经球，如何使用冷冻切片机对神经球培养物进行连续切片，以及如何对目标蛋白进行免疫染色。我们还向您演示了如何结合细胞培养物定位与三维建模软件，对目标蛋白表达的空间位置进行三维建模。

希望这能对您有所帮助，祝您的实验顺利成功。