一种用于出生后大脑神经元迁移高分辨率延时成像的器官型脑片实验方法

我是Troy Gasai。我们将讨论一种在我们实验室过去几年中不断完善优化的器官型脑片实验方法。我实验室的Ben jacket将向您演示该实验的具体操作步骤。

出生后脑组织的器官型脑片实验是研究多种因素及其在出生后脑部及TRO迁移流中对神经元迁移作用的有力方法。大家好，我是Ben Jakay，北卡罗来纳州立大学兽医学院Troy Gge实验室的博士后研究员。今天我将向大家展示如何在小鼠器官型脑片之间进行组织交叉移植，以观察出生后脑内神经前体细胞的迁移过程。

本视频中描述的所有技术操作均应在无菌环境中进行，最好使用灭菌工具在层流罩内操作。用配备23号针头的一次性注射器，将150微升切片培养基滴加到培养皿玻璃底面的中央。在圆形玻璃底盖玻片外周放置数个胶点，但需留出一侧不涂胶，以便进行液体交换。然后用显微镊子轻轻将核孔膜放置于培养基上方，注意确保膜下不残留气泡。

然后使用弯头镊子压平胶点，固定膜的位置。在膜上加入1毫升切片培养基，最后将培养皿放入培养箱中，直至使用。当从出生后幼鼠（P1至P10）制备切片时，可获得最佳结果。首先，用显微镊子夹住鼻部以稳定头部。

从颈部到吻部纵向切取皮肤。剥离头皮以暴露颅骨，从胸骨开始，沿中线向前纵向切割颅骨，并在两侧各做一条侧向切口，共三条切口。操作时应尽量减少对下方皮质组织的接触。

在移除颅骨瓣以增强组织稳定性后，使用剃刀片切除脑组织最外侧和尾侧部分。随后小心地将两个脑半球从颅骨中取出，并使内侧面朝下置于包埋模具中。

立即将其覆盖含有3% DNA级AGA roses凝胶的组织制备缓冲液，该缓冲液保持在37摄氏度。在平坦的水平面上稳定两分钟后，为确保AGA roses均匀凝固，将模具置于冰上以完成凝固过程。

凝胶包埋半球成型后，将其从模具中取出，并修剪掉脑组织周围的凝胶。随后将包埋在凝胶中的组织置于振动切片机的样品盘上，使组织的内侧面朝上，并用氰基丙烯酸酯胶水固定。将样品盘安装到盛有冰浴组织制备液的振动切片机样品槽中，将脑组织切成150微米厚度的切片。

当含有 RMS 的脑片从刀片上释放后，需使用小型平头刮铲小心地将其舀出，并平整地放置于培养皿的中央。由于组织非常脆弱，操作脑片时应尽量减少触碰。培养皿中的培养基量应调整至足以覆盖脑切片并防止其移动的液面高度。

将培养皿标记后放入培养箱。供体脑组织的制备方法与受体脑组织类似，不同之处在于切片厚度为 250 µm，并将切片收集于冰上。

低温组织制备。将缓冲切片立即置于具有落射荧光功能的解剖显微镜下。迁移神经母细胞流（RMS）呈现为一条从室管膜下区延伸至嗅球的灰色U形结构。

使用显微镊子轻柔地对 RMS 进行显微解剖。一只手用镊子固定脑片，另一只手用镊子在 RMS 周围进行小切口，直至将其从脑片上分离。切除的 RMS 随后被切成直径约 200 至 500 微米的小块。

在此示例中，从表达红色荧光蛋白TD Tomato的转基因小鼠中获取脑片。将含有宿主脑片的下层培养皿从培养箱中取出，并置于解剖显微镜下，使用可见光观察。在嗅束迁移路径（RMS）起始段做一小切口，然后使用装有20微升吸头的移液器，将单个供体RMS脑片转移至宿主RMS的切口处。

将外植块轻轻推入切口，以建立两种组织之间的接触。为确保接触稳定，将外植块略微推入切片与核贫乏膜之间。随后将培养皿放回培养箱中，至少孵育一小时，使组织切片在膜上稳定贴附。

神经母细胞大约在1到2小时后开始从外植体迁移到宿主的脑室下区迁移流（RMS）中。使用工作距离较长的20倍物镜可最佳地观察细胞迁移。将组织培养的样本从培养箱转移至显微镜上的保温培养腔中。

可根据所需的分析类型，以从零到10分钟不等的时间间隔对荧光神经母细胞进行成像。近年来，我们对有机型脑片培养方案进行了充分测试和优化，以确保在纹状体-嗅球迁移路径（RMS）中细胞迁移模式和方向的一致性。在此示例中，对来自在nestin启动子驱动下表达TD番茄蛋白的小鼠所获取的外植体中迁出的细胞进行分析，结果显示细胞向宿主RMS高度定向且快速迁移。

高倍放大。延时分析显示，在20分钟的成像过程中，迁移中的成神经细胞全长均呈现出优异的分辨率。成像完成后，可立即用预冷的新鲜4%多聚甲醛固定脑片，并对迁移流中的不同组分进行免疫染色。

在此情况下，通过荧光免疫组织化学方法可观察到呈蓝色的 GFAP 阳性星形胶质细胞和呈绿色的 CD31 阳性血管。对细胞骨架蛋白肌动蛋白（蓝色）和微管蛋白（绿色）染色的切片进行高倍镜分析，揭示了细胞在迁移过程中对这些组分的表达具有非均一性。本实验方案存在一些挑战，需要在结果的制备与分析过程中投入耐心、练习和充足的时间。

以下是一些有助于您获得最佳实验结果的实用建议。根据我们的经验，使用出生后1至10天（P1–P10）的小鼠可获得最佳结果。供体与受体脑组织之间的年龄匹配也有助于提高实验的可重复性。

由于大多数试剂和培养皿都必须新鲜配制，我们的脑片实验需要在一天内连续进行数小时的准备和成像操作。一旦取出脑组织，后续步骤应尽快完成。从断头到脑片制备的整个过程中，所有操作均需使用冰和低温试剂，并尽量减少对组织的机械操作，以避免造成解剖结构的破坏。

用于这些解剖操作的工具应保持无菌，并且仅限用于活体组织操作。切勿使用曾接触过甲醛等固定剂的工具。切片通常在24至36小时内保持活性，但24小时后迁移能力、速度和方向性会出现明显下降，最长可维持36小时。

在规划实验和分析时，请注意这一局限性。