Name: 对于高分辨率延时成像神经细胞迁移的一个器官型产后脑切片检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-11T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 学习用于产后大脑的高分辨率延时成像器官型脑切片检测技术，通过小鼠脑切片组织交叉移植可视化神经母细胞迁移。该方法为研究神经发育过程提供了重要的实验手段。

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感谢 Dan McWhorter 为视频中的实验方案提供解说。本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 5R01NS062182、美国衰老研究联合会资助项目以及授予 HTG 的机构资金支持。

一、实验步骤
以下操作应在无菌条件下，在层流罩中使用灭菌工具进行。
用于器官型切片的玻璃底培养皿的制备
<ol>
<li>必须在无菌环境中使用灭菌工具制备培养皿。</li>
<li>小心地将150μL切片培养基（见配方）滴加至培养皿玻璃底面的中央，注意避免培养基中产生气泡。</li>
<li>使用配有23号针头的一次性注射器，将多点胶水（橡胶胶水 - Elmer's，货号# E904）涂布于方形边缘的四周，该边缘紧邻位于培养皿中央的圆形盖玻片，但需留出一侧不涂胶，以便后续液体交换（图1）。本方案中所列胶水类型在使用条件下对脑片或细胞无毒性。需特别注意避免将任何胶水沾到玻璃盖玻片上，否则会影响后续对脑片的成像观察。随后，使用微镊子将一张核孔膜（直径25mm，孔径8.0μm - Whatman，货号# 110614）放置在玻璃盖玻片上方，并利用胶点固定其位置。操作时应确保玻璃盖玻片与核孔膜之间无气泡残留。</li>
<li>在膜上加入1 mL切片培养基。将培养皿置于培养箱中孵育30分钟，随后置于冰上，待用。</li>
</ol>
提取出生后早期的大脑组织
当使用出生后幼鼠（P1-P10）制备脑片时，可获得最佳结果。
<ol>
<li>使用异氟烷或其他经批准的方法对幼鼠实施终末麻醉（过量麻醉）。可用70%乙醇喷洒头部以提高无菌性，随后使用锋利的剪刀迅速断头。</li>
<li>用显微镊夹住下颌以固定头部。沿颈部至吻部纵向切开并去除皮肤。从枕大池开始，沿中线做1条正中切口和2条侧切口（每侧1条），纵向并向前切开颅骨（图2A）。移除颅骨瓣时应尽量减少与下方皮层组织的接触。</li>
<li>为提高振动切片过程中组织的稳定性，通过两次矢状切口去除脑组织最外侧部分。同时在小脑喙部基底处做一切口，去除脑的尾侧部分（图2B）。</li>
<li>沿中线裂进行平滑切割，分离两个半球，并小心将两半球取出，内侧面朝下放置于包埋模具中（图2C-D）。</li>
</ol>
宿主大脑的切片
<ol>
<li>将两个半脑立即浸入盛有融化态3%低熔点DNA级琼脂糖凝胶（Fisher，货号# BP1360-100）的包埋模具中，该琼脂糖溶于组织制备缓冲液，并维持在37°C（见配方）。将模具置于平坦的水平面上稳定2分钟，以确保琼脂糖均匀凝固，随后将模具置于冰上完成凝固过程。</li>
<li>当含半脑的凝胶完全凝固后，将其从模具中取出并修整，使脑组织周围保留2–3 mm的凝胶。</li>
<li>将包埋在凝胶中的组织固定于振动切片机的样品盘上，内侧朝上，并用氰基丙烯酸酯胶水（Krazy胶或等效产品）固定。需注意仅使用极少量胶水，因过量胶水会对切片及迁移细胞产生毒性作用。若胶水过多附着于组织块侧面，亦会阻碍切片过程，可能导致组织损伤。</li>
<li>将样品盘安装至已盛有冰冻组织制备培养基的振动切片机样品槽中。</li>
<li>以150 μm厚度进行切片，振动切片机速度设定为慢至中等范围（具体数值取决于所用设备，需根据实际情况独立优化）。在本实验室条件下，振动频率设定为最大值时效果最佳。最初的数张切片可弃去。</li>
<li>一旦含有脑室下区-嗅球迁移流（RMS）的切片从刀片上释放（RMS肉眼可见，呈灰白色U形结构，自脑室下区延伸至嗅球），即小心将其从凝胶中分离，并用小型平头刮铲捞出。将切片转移至含切片培养基的玻璃底培养皿中的核孔膜上（图3A–B）。以150 μm厚度切片时，典型新生早期小鼠脑每侧半脑可获得约2–3张RMS切片。操作切片时应尽量减少触碰，因其极为脆弱。随后将载有切片的培养皿转移至培养箱中。</li>
</ol>
供体脑组织切片与RMS移植
<ol>
<li>将供体脑组织（表达荧光报告基因的迁移性成神经细胞的脑组织）切成250μm厚度的切片，并将切片收集于冰上预冷的组织制备缓冲液中。</li>
<li>立即将切片置于具备落射荧光功能的解剖显微镜下，使用显微镊子轻柔地显微解剖喙侧迁移流（RMS）。用一把镊子固定切片，另一把镊子在RMS周围进行微小切割，直至将其从切片中分离。随后将切除的RMS切成小块外植体（直径约200–500 μm），以备移植使用。</li>
<li>从培养箱中取出含有宿主脑切片并置于核孔滤膜上的玻璃底培养皿，放置于解剖显微镜下。在明场光照下清晰识别RMS，并在其起始段做一小切口。</li>
<li>使用配备20 μL吸头的移液器，将一个供体RMS外植体转移至宿主RMS的切口处。轻柔地将外植体推入切口，使供体与宿主组织之间建立接触。为确保接触稳定，需将外植体略微推入切片与核孔膜之间的间隙中。</li>
<li>完成所有含RMS的宿主切片移植后，将培养皿放回培养箱中至少1小时，使切片充分贴附于膜上。约1–2小时后，成神经细胞应开始从外植体迁移进入宿主RMS。</li>
</ol>
神经元迁移的延时成像
<ol>
<li>将玻璃底培养皿从培养箱转移至显微镜的孵育腔内（图3C）。可根据所需的分析类型，以0至10分钟的时间间隔对荧光标记的成神经细胞进行成像。例如，为观察单个成神经细胞迁移周期中的细胞骨架动态变化，我们将成像时间间隔设置为小于或等于2.5分钟。然而，对于细胞群体的迁移方向和速度等群体动态行为，则更适合采用5至10分钟的时间间隔进行捕捉。物镜的选择因显微镜品牌而异。在尼康C1共聚焦显微镜上，我们发现20倍干镜（Nikon Pan Fluor，数值孔径0.75，工作距离0.35 mm）最适用于我们的分析。为在此共聚焦系统上获得最佳成像效果，应将针孔调整至中等大小（直径60 μm）。为获得最接近生理状态的迁移行为，成像应局限于位于纹状体-嗅球迁移路径（RMS）组织切片深层的细胞，即距离切片任一表面至少20 μm的区域。激光功率应优化至最低水平，同时确保单个成神经细胞的细节仍清晰可见。</li>
<li>成像完成后，可将脑片用预冷的新鲜配制的4%多聚甲醛固定，进行免疫染色并封片，以供进一步成像分析。由于我们未在膜上涂布任何黏附基质（如层粘连蛋白），脑片在浸入染色缓冲液后通常会从膜上脱落。成像时应保持脑片原有的150 μm厚度。也可选择将脑片冷冻保存，并使用冷冻切片机对原始脑片进行更薄的切片。但这种方法可能增加染色伪影的发生率，并破坏组织的完整性。</li>
</ol>
二、 材料/设备
用于器官型切片的玻璃底培养皿的制备
<ul>
<li>小型注射器（1 mL）</li>
<li>23 号针头</li>
<li>Nucleopore 聚碳酸酯膜 - 直径 25 mm，孔径 8.0 μm - Whatman，货号# 110614</li>
<li>玻璃底培养皿 - 35 mm 培养皿，14 mm 微孔，No. 1.5 盖玻片 - MatTech，货号# P35G-1.5-14-C</li>
<li>橡胶胶水 - Elmer's，货号# E904</li>
<li>基础伊格尔培养基（Basal Medium Eagle）- Gibco，货号# 21010</li>
<li>1 M Hepes（pH 7.4）</li>
<li>1 M D-葡萄糖</li>
<li>100 mM CaCl2</li>
<li>100 mM MgSO4</li>
<li>1 M NaHCO3</li>
<li>dH2O</li>
<li>200 mM L-谷氨酰胺</li>
<li>青霉素-链霉素（Penicillin-streptomycin）</li>
</ul>
脑组织提取与包埋
<ul>
<li>麻醉剂（异氟烷等）</li>
<li>微波炉</li>
<li>低熔点琼脂糖 - Fisher，货号# BP1360-100</li>
<li>瞬干胶（Krazy glue）- 货号#KG585</li>
<li>一次性剥离包埋模具（Peel-A-Way Disposable Embedding Molds，R-40）- 22 mm × 40 mm 矩形，深 20 mm - Polysciences，货号# 18646C</li>
</ul>
脑切片与RMS移植
<ul>
<li>振动切片机 - Leica VT1000S 及切片制备所需的所有附件组件</li>
<li>10 倍汉克平衡盐溶液 - Gibco，货号# 14185</li>
<li>显微解剖镊子 #5 - Roboz，货号# RS-4976</li>
<li>微型刮匙 - Fisher，货号# 21-401-15</li>
<li>体视显微镜</li>
</ul>
器官型脑片的延时成像
<ul>
<li>加湿培养箱，5% CO2</li>
<li>配备培养箱腔室和长工作距离物镜（数值孔径 0.6 或更高）的倒置显微镜</li>
</ul>
三、配方
用于组织解剖和切片制备的缓冲液（组织制备缓冲液）
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>储存液</td>
 <td>体积</td>
 <td>终浓度</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X HBSS</td>
 <td>50 mL</td>
 <td>1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1M Hepes (pH 7.4)</td>
 <td>1.25 mL</td>
 <td>2.5mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1M D-Glucose</td>
 <td>15 mL</td>
 <td>30mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1M CaCl2</td>
 <td>0.5 mL</td>
 <td>1mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1M MgSO4</td>
 <td>0.5 mL</td>
 <td>1mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1M NaHCO3</td>
 <td>2 mL</td>
 <td>4mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dH2O</td>
 <td>430.75 mL</td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
使用0.2 μm滤器过滤除菌，并在4°C下保存。

用于器官型切片、组织移植和成像的培养基（切片培养基）
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>储存液</td>
 <td>体积</td>
 <td>终浓度</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Basal Medium Eagle</td>
 <td>35 mL</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>组织制备缓冲液</td>
 <td>12.9 mL</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1M D-Glucose</td>
 <td>1.35 mL</td>
 <td>20mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200mM L-glutamine</td>
 <td>0.25 mL</td>
 <td>1mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>青霉素-链霉素</td>
 <td>0.5 mL</td>
 <td>100单位/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

使用0.2 μm滤器过滤除菌，并在4°C下保存。

低熔点琼脂糖凝胶的制备
低熔点琼脂糖在组织制备缓冲液中稀释至0.3 g/mL，置于50 mL锥形管中（参见配方）。将锥形管在高功率下每次微波加热5-10秒，分次进行。加热次数取决于总体积；对于10 mL溶液，进行三次加热（分别为10秒、8秒和5秒）即可。每次加热间隔需小心拧开管盖，以释放管内气压，防止管体爆裂。操作时需格外小心，因为管内物质温度极高。琼脂糖完全溶解后，将锥形管置于37°C水浴中至少5分钟，使其温度稳定后再使用。长时间暴露于室温会导致凝胶硬化。尽管应尽可能避免凝胶硬化，但在初次配制后的24小时内，硬化凝胶可重新加热熔化并立即使用。
类器官切片免疫组织化学
在共聚焦显微镜成像后，切片可在含4%多聚甲醛的PBS中于4°C固定过夜。随后将切片在含10%山羊血清和1% Triton X（Sigma，货号：S26-36-23）的PBS中于4°C封闭过夜，接着于4°C与一抗孵育过夜。使用荧光标记的山羊来源二抗进行检测（所有抗体均按1:1000稀释，室温孵育1小时）。标记后的切片在封片前需用冰预冷的PBS彻底洗涤5–6次，然后置于载玻片上并加盖盖玻片。
四、代表性结果
近年来，我们的器官型脑片培养方案经过充分验证和优化，可确保细胞迁移模式和方向的一致性。对来自在Nestin启动子驱动下诱导表达红色荧光蛋白Td-tomato（Nestin-Td tomato）小鼠的外植体中迁移出的细胞进行分析，结果显示tdTomato+神经母细胞向宿主喙侧迁移流（RMS）的迁移具有高度定向性和快速性（图4A）。高倍时间推移成像分析显示，在20分钟的成像过程中，单个迁移神经母细胞的全长均能被清晰分辨（图4B）。
含有供体 Td-tomato+ 细胞的脑片经过固定，并对纹状体迁移路径（RMS）内的不同细胞组分进行免疫染色。通过荧光免疫组织化学方法显示了 GFAP+ 星形胶质细胞和 CD31+ 血管（图 5A）。对细胞骨架蛋白肌动蛋白和微管蛋白染色的脑片进行高倍镜分析，揭示了处于迁移过程中的细胞对这些组分的表达呈不均匀分布（图 5B）。
本实验所用抗体：兔抗 RFP（Abcam，1:250）、兔抗 GFAP（Dako，1:1000）、大鼠抗 CD31（BD Pharmigen，1:100）、小鼠抗肌动蛋白（Santa Cruz，1:500）、兔抗微管蛋白（Sigma，1:1000）、Cy3 标记的山羊抗小鼠 IgG（Chemicon，1:1000）、AlexaFluor 647 标记的山羊抗兔 IgG（Invitrogen，1:1000）、AlexaFluor 488 标记的山羊抗大鼠 IgG（Invitrogen，1:1000）、AlexaFluor 488 标记的山羊抗兔 IgG（Invitrogen，1:1000）。
<img src="/files/ftp_upload/2486/2486fig1.jpg" alt="切片培养示意图；俯视图/横截面；核孔膜；胶点；培养基设置。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 器官型脑片用玻璃底培养皿的制备。 在培养皿的圆形玻璃底部组件（红色）周围放置多个胶点，留出一侧开口，以便从滤膜下方更换培养基。在玻璃盖玻片中央加入150μL的脑片培养基。然后将核孔膜（蓝色）有光泽的一面朝下贴附，确保玻璃盖玻片与膜之间无气泡残留。在膜上方加入1 mL脑片培养基（灰色），并将培养皿在使用前置于37°C孵育。
<img src="/files/ftp_upload/2486/2486fig2.jpg" alt="用于显微镜分析的脑切片示意图，显示切割平面及在琼脂糖中包埋。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 脑组织的取出及切片前准备。(A) 通过从颈部至吻部沿中线切开头皮（中线上的虚线）暴露颅骨。然后从延髓池开始，沿颅骨进行纵向及向前的切割，包括1条中线切口和2条侧方切口（每侧各一条；2A）。(B) 切除大脑皮层最外侧部分以及中枢神经系统（CNS）的尾端部分，以提高振动切片过程中组织的稳定性。(C-D) 随后将两个半脑分离，并以内侧面朝下放置于包埋模具中，随后加入溶解于组织制备缓冲液中的3%琼脂糖凝胶。
<img src="/files/ftp_upload/2486/2486fig3.jpg" alt="啮齿类动物脑切片免疫染色示意图；颜色编码流程，荧光显微镜结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 脑切片与交叉移植。（A） 将宿主组织切成150 μm厚的切片，并将包含喙侧迁移流（RMS）的切片小心地平铺在低温玻璃底培养皿的核孔膜上。（B） 供体脑（其RMS中表达荧光报告基因的脑组织）被切成250 μm厚的切片，并将切片收集于冰上预冷的组织制备缓冲液中。显微解剖分离出供体RMS，并将其切割成小块组织块。使用配备20 μL吸头的移液器，将单个RMS组织块转移至宿主RMS的切口部位。（C） 经过1–2小时孵育后，将培养皿转移至共聚焦显微镜的加热载物台上，通过延时成像记录细胞迁移过程。该显微照片为典型脑切片（灰色）在移植后1小时的代表性低倍图像（红色组织块来自表达tdTomato的供体小鼠RMS；红色虚线标示宿主切片中RMS的边界）。
<img src="/files/ftp_upload/2486/2486fig4.jpg" alt="神经示踪；从SEZ到OB的迁移在显微镜下的荧光追踪、细胞迁移动态。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. 神经母细胞从外植体迁移进入宿主RMS。(A) 移植后1小时，nestin-tdTomato+神经母细胞（红色）从外植体迁移进入宿主RMS（绿色虚线）。侵入宿主脑片RMS的tdTomato+细胞以高度定向且快速的方式从SEZ向OB移动。(B) 在约20分钟的时间内，可通过高倍时差成像观察到单个神经母细胞的迁移周期。比例尺 = 10 μm。
<img src="/files/ftp_upload/2486/2486fig5.jpg" alt="神经元-胶质网络的免疫荧光显微镜图像；GFAP、CD31标记物，肌动蛋白-微管蛋白叠加。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
图5. 器官型脑片的免疫组织化学评估。 移植后12小时，在迁移过程中固定外植的神经母细胞（红色）。(A) 脑片的荧光免疫组织化学染色显示，在宿主脑片的吻侧迁移流（RMS）内存在大量GFAP阳性星形胶质细胞（蓝色）以及散在分布的CD31阳性血管（绿色）。(B) 通过使用抗肌动蛋白（蓝色）和抗微管蛋白（绿色）抗体进行共免疫染色，揭示了宿主RMS中一个孤立的tdTomato阳性迁移细胞（红色）的细胞骨架结构。

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<li>Suzuki, S. O. &amp, Goldman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cell+populations+in+the+early+postnatal+subventricular+zone+take+distinct+migratory+pathways%3A+a+dynamic+study+of+glial+and+neuronal+progenitor+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multiple cell populations in the early postnatal subventricular zone take distinct migratory pathways: a dynamic study of glial and neuronal progenitor migration.</a> J. Neurosci. 23, 4240-4250 (2003).</li>
<li>Ghashghaei, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neuregulin-ErbB4+interactions+on+the+proliferation+and+organization+of+cells+in+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">The role of neuregulin-ErbB4 interactions on the proliferation and organization of cells in the subventricular zone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 1930-1935 (2006).</li>
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<li>Jacquet, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+neuronal+proliferation%2C+migration+and+differentiation+in+the+postnatal+brain+using+equine+infectious+anemia+virus-based+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Analysis of neuronal proliferation, migration and differentiation in the postnatal brain using equine infectious anemia virus-based lentiviral vectors.</a> Gene Ther. 16, 1021-1033 (2009).</li>
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动物实验严格按照北卡罗来纳州立大学及其兽医学院制定的指南和规定进行。 
未声明利益冲突。

在嗅球中，神经元沿纹状体-嗅球束（RMS）迁移是出生后神经发生的关键组成部分1。RMS中的迁移沿脑表面切线方向进行。切向迁移的成神经细胞与放射状迁移细胞不同，其差异体现在前体细胞来源的位置以及最终神经元产物的命运上1,2,3。出生后RMS中相对纯净的切向迁移细胞群体，使这一解剖学上明确的区域成为研究切向迁移机制的理想平台。解析神经元迁移的细胞与分子机制，对于理解多种神经发育性疾病至关重要（例如，参考文献4）。这些知识还可能有助于揭示脑肿瘤形成与扩散背后的机制（例如，参考文献5），并在未来的神经元替代治疗策略中，为引导重编程的成神经细胞定向迁移至损伤或神经退行性病变部位提供必要基础。

尽管近年来取得了巨大进展，但目前对神经元迁移背后的遗传和分子机制及其与特定亚细胞事件关联的理解仍然支离破碎。在这一研究领域中取得突破的主要困难在于，大多数迁移研究依赖于组织固定和免疫组织化学技术，这些技术被用于间接推断胚胎脑中纹状体迁移路径（RMS）及其他迁移流中细胞迁移的机制。这种“固定”方法并不理想，因为它...

一种用于出生后大脑神经元迁移高分辨率延时成像的器官型脑片实验方法

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

出生后大脑中的神经发生依赖于三个生物学事件的维持：前体细胞的增殖、成神经细胞的迁移，以及新神经元向现有神经环路的分化与整合。在嗅球的出生后神经发生过程中，这些事件发生在三个解剖学上分离的区域：增殖主要发生在侧脑室的室下区（SEZ），成神经细胞通过吻侧迁移流（RMS）迁移，而新生成的神经元则在嗅球（OB）内完成分化与整合。这三个区域为分别研究调控各生物学事件的细胞、分子及生理机制提供了理想的平台。本文介绍了一种针对出生后脑组织优化的器官型脑片实验方法，该方法中的细胞外环境可高度模拟成神经细胞迁移的体内条件。我们证明，该实验体系可支持成神经细胞在吻侧迁移流中进行均匀、定向且快速的移动。通过利用不同遗传背景小鼠之间的交叉移植策略，该方法将非常适用于研究神经元迁移的细胞自主性与非自主性调控机制。

本方案描述了一种针对出生后大脑优化的器官型脑片实验方法，可用于对嗅束迁移流中神经母细胞迁移进行高分辨率的时间推移成像。

出生后大脑中的神经发生依赖于三个生物学事件的维持：前体细胞的增殖、成神经细胞的迁移，以及……

我是Troy Gasai。我们将讨论一种在我们实验室过去几年中不断完善优化的器官型脑片实验方法。我实验室的Ben jacket将向您演示该实验的具体操作步骤。出生后脑组织的器官型脑片实验是研究多种因素及其在出生后脑部及TRO迁移流中对神经元迁移作用的有力方法。大家好，我是Ben Jakay，北卡罗来纳州立大学兽医学院Troy Gge实验室的博士后研究员。今天我将向大家展示如何在小鼠器官型脑片之间进行组织交叉移植，以观察出生后脑内神经前体细胞的迁移过程。本视频中描述的所有技术操作均应在无菌环境中进行，最好使用灭菌工具在层流罩内操作。用配备23号针头的一次性注射器，将150微升切片培养基滴加到培养皿玻璃底面的中央。在圆形玻璃底盖玻片外周放置数个胶点，但需留出一侧不涂胶，以便进行液体交换。然后用显微镊子轻轻将核孔膜放置于培养基上方，注意确保膜下不残留气泡。然后使用弯头镊子压平胶点，固定膜的位置。在膜上加入1毫升切片培养基，最后将培养皿放入培养箱中，直至使用。当从出生后幼鼠（P1至P10）制备切片时，可获得最佳结果。首先，用显微镊子夹住鼻部以稳定头部。从颈部到吻部纵向切取皮肤。剥离头皮以暴露颅骨，从胸骨开始，沿中线向前纵向切割颅骨，并在两侧各做一条侧向切口，共三条切口。操作时应尽量减少对下方皮质组织的接触。在移除颅骨瓣以增强组织稳定性后，使用剃刀片切除脑组织最外侧和尾侧部分。随后小心地将两个脑半球从颅骨中取出，并使内侧面朝下置于包埋模具中。立即将其覆盖含有3% DNA级AGA roses凝胶的组织制备缓冲液，该缓冲液保持在37摄氏度。在平坦的水平面上稳定两分钟后，为确保AGA roses均匀凝固，将模具置于冰上以完成凝固过程。凝胶包埋半球成型后，将其从模具中取出，并修剪掉脑组织周围的凝胶。随后将包埋在凝胶中的组织置于振动切片机的样品盘上，使组织的内侧面朝上，并用氰基丙烯酸酯胶水固定。将样品盘安装到盛有冰浴组织制备液的振动切片机样品槽中，将脑组织切成150微米厚度的切片。当含有 RMS 的脑片从刀片上释放后，需使用小型平头刮铲小心地将其舀出，并平整地放置于培养皿的中央。由于组织非常脆弱，操作脑片时应尽量减少触碰。培养皿中的培养基量应调整至足以覆盖脑切片并防止其移动的液面高度。将培养皿标记后放入培养箱。供体脑组织的制备方法与受体脑组织类似，不同之处在于切片厚度为 250 µm，并将切片收集于冰上。低温组织制备。将缓冲切片立即置于具有落射荧光功能的解剖显微镜下。迁移神经母细胞流（RMS）呈现为一条从室管膜下区延伸至嗅球的灰色U形结构。使用显微镊子轻柔地对 RMS 进行显微解剖。一只手用镊子固定脑片，另一只手用镊子在 RMS 周围进行小切口，直至将其从脑片上分离。切除的 RMS 随后被切成直径约 200 至 500 微米的小块。在此示例中，从表达红色荧光蛋白TD Tomato的转基因小鼠中获取脑片。将含有宿主脑片的下层培养皿从培养箱中取出，并置于解剖显微镜下，使用可见光观察。在嗅束迁移路径（RMS）起始段做一小切口，然后使用装有20微升吸头的移液器，将单个供体RMS脑片转移至宿主RMS的切口处。将外植块轻轻推入切口，以建立两种组织之间的接触。为确保接触稳定，将外植块略微推入切片与核贫乏膜之间。随后将培养皿放回培养箱中，至少孵育一小时，使组织切片在膜上稳定贴附。神经母细胞大约在1到2小时后开始从外植体迁移到宿主的脑室下区迁移流（RMS）中。使用工作距离较长的20倍物镜可最佳地观察细胞迁移。将组织培养的样本从培养箱转移至显微镜上的保温培养腔中。可根据所需的分析类型，以从零到10分钟不等的时间间隔对荧光神经母细胞进行成像。近年来，我们对有机型脑片培养方案进行了充分测试和优化，以确保在纹状体-嗅球迁移路径（RMS）中细胞迁移模式和方向的一致性。在此示例中，对来自在nestin启动子驱动下表达TD番茄蛋白的小鼠所获取的外植体中迁出的细胞进行分析，结果显示细胞向宿主RMS高度定向且快速迁移。高倍放大。延时分析显示，在20分钟的成像过程中，迁移中的成神经细胞全长均呈现出优异的分辨率。成像完成后，可立即用预冷的新鲜4%多聚甲醛固定脑片，并对迁移流中的不同组分进行免疫染色。在此情况下，通过荧光免疫组织化学方法可观察到呈蓝色的 GFAP 阳性星形胶质细胞和呈绿色的 CD31 阳性血管。对细胞骨架蛋白肌动蛋白（蓝色）和微管蛋白（绿色）染色的切片进行高倍镜分析，揭示了细胞在迁移过程中对这些组分的表达具有非均一性。本实验方案存在一些挑战，需要在结果的制备与分析过程中投入耐心、练习和充足的时间。以下是一些有助于您获得最佳实验结果的实用建议。根据我们的经验，使用出生后1至10天（P1–P10）的小鼠可获得最佳结果。供体与受体脑组织之间的年龄匹配也有助于提高实验的可重复性。由于大多数试剂和培养皿都必须新鲜配制，我们的脑片实验需要在一天内连续进行数小时的准备和成像操作。一旦取出脑组织，后续步骤应尽快完成。从断头到脑片制备的整个过程中，所有操作均需使用冰和低温试剂，并尽量减少对组织的机械操作，以避免造成解剖结构的破坏。用于这些解剖操作的工具应保持无菌，并且仅限用于活体组织操作。切勿使用曾接触过甲醛等固定剂的工具。切片通常在24至36小时内保持活性，但24小时后迁移能力、速度和方向性会出现明显下降，最长可维持36小时。在规划实验和分析时，请注意这一局限性。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

对于高分辨率延时成像神经细胞迁移的一个器官型产后脑切片检测

我们介绍一种制备中期妊娠小鼠胚胎的器官型切片的方法，用于外周神经突起的培养和延时成像。...

表达GFP的小鼠胚胎器官型切片培养用于外周神经突起实时成像

介绍了一种从E12.5小鼠胚胎中脑制备器官型脑片的方法。这些器官型脑片培养物可用于观察多巴胺能神经元或其他腹侧中脑神经元的行为。...

胚胎腹侧中脑组织切片培养：一种体外研究多巴胺能神经元发育的体系 in vitro

长时间实时成像胚胎组织具有挑战性。本文介绍一种可在较长时间内以高空间和时间分辨率监测鸡胚脊髓中细胞及亚细胞水平变化的检测方法。该技术可适用于神经系统及其他胚胎发育区域的研究。...

发育中的神经上皮内细胞行为的高分辨率活体成像

我们描述了一种在小鼠前脑中进行神经元迁移实时视频成像的实验方案。通过在急性活体脑片中利用宽场荧光成像技术，并以相对较短的时间间隔快速采集图像，记录经病毒标记或移植的神经前体细胞的迁移过程，以研究细胞迁移的不同阶段，包括静止期和迁移期的持续时间以及迁移速度。...

成年小鼠前脑急性脑片中神经母细胞迁移的延时成像

来源： Wiegreffe, C., 等  利用胚胎小鼠脑组织切片培养进行迁移神经元的延时共聚焦成像 子宫内 电穿孔 J. Vis. Exp. (2017)...

转导小鼠胚胎脑切片中皮层神经元径向迁移的延时成像

神经母细胞迁移是出生后神经发生过程中的基本事件。我们描述了一种通过高效标记神经母细胞的方案 体内...

体内 新生期电穿孔与小鼠急性脑切片中神经母细胞迁移的实时成像

本方案提供了直接观察径向迁移皮层神经元的操作指南。In utero...

In Utero 电穿孔法结合脑片培养对小鼠胚胎脑中迁移神经元进行延时共聚焦成像

本文提供了一种低成本且可靠的方法，可从小鼠胚胎制备适用于共聚焦显微镜和活体成像技术的电穿孔脑组织切片培养物。...

Ex Utero 电穿孔及胚胎小鼠脑组织切片培养用于迁移性GABA能中间神经元的活体成像

本方案展示了一种简单且可靠的用于研究的方法 原位 轴突生长与生长锥动态。该方法描述了如何制备 离体...

在体 可视化急性离体胚胎脑切片培养中轴突生长与生长锥动态

在大脑皮层发育过程中，神经元和胶质细胞起源于衬于脑室壁的室管膜区，并向脑表面迁移。许多基因参与了这一过程。本方案介绍了对迁移中的神经元和胶质前体细胞进行活细胞延时成像的技术。...

胚胎小鼠脑切片中迁移神经元和胶质前体细胞的延时成像

学习用于产后大脑的高分辨率延时成像器官型脑切片检测技术，通过小鼠脑切片组织交叉移植可视化神经母细胞迁移。该方法为研究神经发育过程提供了重要的实验手段。

一种用于出生后大脑神经元迁移高分辨率延时成像的器官型脑片实验方法

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