对于高分辨率延时成像神经细胞迁移的一个器官型产后脑切片检测
December 11th, 2010
本协议描述了一个器官的切片检测，产后脑和延髓迁徙流时间推移高分辨率成像成神经细胞迁移的优化。
我是 Troy Gasai。我们将讨论一种器官型切片检测，它在过去几年中在我的实验室中得到了完善。我实验室的 Ben jacket 将向您展示如何进行这种检测。
出生后大脑的器官型切片测定是测试各种因素及其对出生后大脑和 TRO 迁移流中神经元迁移的作用的强大方法。大家好，我是 Ben Jakay。我是北卡罗来纳州立大学兽医学院 Dr.Troy gge 实验室的博士后研究员，今天我在这里向您展示我们如何在器官型小鼠脑切片之间进行组织交叉移植，以便可视化出生后大脑中迁移的神经母细胞。
本视频中描述的所有技术都应在无菌环境中进行，最好使用消毒工具的层流罩。将 150 微升切片培养基滴放在玻璃杯的中心，培养皿的底部，用配备 23 号针头的一次性注射器。在圆形玻璃底盖玻片外放置几个胶点，同时让一侧未胶合以进行流体交换，然后使用微镊子将 A.A 核孔膜轻轻放置在培养基顶部，同时确保气泡不会滞留在膜下方。
然后使用弯曲的镊子压平胶点并将膜固定到位。在膜顶部加入 1 毫升切片培养基，最后，将培养皿放入培养箱中直至准备使用。当从年轻的出生后小鼠中制备切片时获得最佳结果，首先是 P 1 到 P 10，通过用微型镊子握住鼻子来稳定头部。
从颈部到鼻子纵向切除皮肤。剥去头皮以露出骨骼，从胸骨大开始纵向和前部切割颅骨，进行一次内侧和两次外侧切割，每侧一次。应注意尽量减少与皮质组织的接触。
由于颅皮瓣从大脑中移除以提高组织的稳定性。在振动切片过程中，用剃须刀片去除大脑的最外侧和尾侧。小心地将两个半球从颅骨中舀出，并将内侧表面向下放入包埋模具中。
它们立即被溶于组织制备缓冲液中的熔化 3% DNA 级 AGA 玫瑰凝胶覆盖，该凝胶保持在 37 摄氏度。在平坦的水平表面上稳定两分钟后。为了确保 aga 玫瑰均匀硬化，将模具放置在冰上以完成凝固。
一旦含有半球的凝胶凝固，它就会从模具中取出并在脑组织周围修剪。然后将凝胶包埋的组织安装在振动音的标本盘上，内侧表面朝上，并用氰基丙烯酸酯粘合剂固定。然后将圆盘安装在装满冰冷组织制备培养基的振动标本盘中，并以 150 微米的厚度对大脑进行切片。
一旦含有 RMS 的切片从刀片中释放出来，就用小平头刮刀小心地将它们舀出，并平放在培养皿的中心。由于组织非常脆弱，因此将切片的处理保持在最低限度至关重要。将培养皿中的培养基量调整到足以覆盖大脑切片的水平，同时防止它们四处移动。
将培养皿贴上标签并转移到培养箱中。供体大脑的制备方式与受体大脑相似，不同之处在于切片在 250 处切割。微米厚度和切片收集在冰中。
冷组织制备。立即将缓冲液切片置于具有落射荧光功能的解剖显微镜下。RMS 表现为从室管膜下区延伸到嗅球的灰色 U 形结构。
使用微镊子轻轻地对 RMS 进行显微解剖。一个镊子用于稳定切片，而另一个用于在 RMS 周围进行小切割，直到它从切片中释放出来。然后将切除的 RMS 切成直径约为 200 至 500 微米的小 x 外表。
在这个例子中，茄子是由表达红色荧光蛋白 TD 番茄玻璃的小鼠制备的。从培养箱中取出含有宿主切片的底部培养皿，并使用可见光置于解剖显微镜下。在 RMS 的初始段做一个小切口，并使用配备 20 微升吸头的移液器，将单个供体 RMS Explan 转移到宿主 RMS 中的切口部位。
将解释物轻轻推入切口，以建立两个组织之间的接触。为了确保这种接触是稳定的，将解释物略微推入切片和细胞核贫膜之间。然后将培养皿放回培养箱中至少一小时，以使切片沉淀在膜上。
大约 1 到 2 小时后，神经母细胞应开始从说明书迁移到宿主 RMS 中。使用超长工作距离 20 倍目标可以最好地可视化细胞迁移。组织培养问题从培养箱转移到显微镜上的培养室中。
荧光神经母细胞可以以 0 到 10 分钟的间隔进行成像，具体取决于所需的分析类型。我们的有机典型切片培养方案在过去几年中已经过全面测试和优化，以确保 RMS 中迁移模式和方向的一致性。在这个例子中，对从小鼠获得从解释中迁移的细胞的分析，其中 TD 番茄在启动子中的巢下表达，揭示了高度定向和快速迁移到宿主 RMS 中。
高放大倍率。延时分析显示，在 20 分钟的成像过程中，迁移的神经母细胞的整个长度具有出色的分辨率。成像完成后，用冰、冷和新鲜制备的冰、4% 多聚形式、醛和迁移流不同成分的免疫染色固定切片皮肤。
在这种情况下，使用荧光免疫组织化学显示蓝色的 GFAP 阳性星形胶质细胞和绿色的 CD 31 阳性血管，蓝色对细胞骨架蛋白肌动蛋白染色的切片进行高放大倍率分析，绿色微管蛋白显示细胞这些成分的不均匀表达。在移民中。我们的实验方案提出了一些挑战，需要耐心、实践和投入时间来准备和分析您的结果。
因此，这里有一些有用的建议，可以帮助您从实验中获得最佳结果。根据我们的经验，P 1 到 P 10 年龄范围内的小鼠提供最佳结果。供体和受体大脑之间的年龄匹配也提高了实验的可重复性。
由于大多数试剂和培养皿必须是新鲜制备的，因此我们的切片分析需要在一天内不间断地进行数小时的制备和成像。一旦大脑被收获，就必须尽快完成后果步骤。在斩首和制备切片之间，所有步骤都应使用冰、冷试剂进行，并且组织作应保持在最低限度，以避免解剖结构中断。
用于这些解剖的工具应该是无菌的，仅用于活组织作。切勿使用与甲醛等固定剂接触过的工具。切片通常可存活长达 36 小时，在 24 到 36 小时之间迁移、速度和方向明显下降。
在规划实验和分析时，请注意此限制。
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概述
本协议描述了一种针对出生后大脑和高分辨率时间序列成像优化的器官型切片分析方法，用于观察神经母细胞迁移在前移行流中的过程。该方法通过器官型小鼠大脑切片之间的组织交叉移植，使得可以在出生后大脑中观察到迁移中的神经母细胞。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 神经生物学
- 细胞迁移
背景
- 器官型切片分析是研究神经元迁移的强大工具。
- 前移行流对于理解出生后大脑中的神经发生至关重要。
- 高分辨率成像技术增强了对神经母细胞行为的观察。
- 本研究集中在对出生后大脑的研究，这相较于胚胎阶段探索较少。
研究目的
- 优化针对出生后大脑的器官型切片分析。
- 调查影响前移行流中神经元迁移的因素。
- 利用先进的成像技术可视化神经母细胞的迁移。
使用的方法
- 从出生后小鼠大脑中制备器官型切片。
- 大脑切片之间的组织交叉移植。
- 高分辨率时间序列成像。
- 分析神经母细胞迁移模式。
主要结果
- 成功地在出生后大脑中可视化神经母细胞的迁移。
- 展示了器官型切片分析的有效性。
- 提供了神经元迁移动力学的见解。
- 对理解神经发育过程的潜在影响。
结论
- 器官型切片分析是研究神经母细胞迁移的有价值的方法。
- 这种方法可以导致对出生后大脑发育的更好理解。
- 未来的研究可以在这些发现的基础上探索治疗途径。
常见问题
Executive Industry Relevance
This organotypic slice assay enables high-resolution time-lapse imaging of neuronal migration in the postnatal brain, providing a physiologically relevant system to evaluate cell-autonomous and non-autonomous regulation of neuroblast movement. By supporting cross-transplantation approaches from different genetic backgrounds, the assay facilitates target validation and mechanistic de-risking in early discovery. It offers predictive confidence for prioritizing therapeutic candidates affecting neuronal migration pathways in neurodevelopmental disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing oriented and rapid neuroblast migration in the rostral migratory stream under near-physiological extracellular conditions.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantitative assessment of migration speed, orientation, and pattern in response to genetic or pharmacological perturbations.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing measurable, reproducible readouts that correlate with biological activity in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by maintaining uniform extracellular conditions that mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible preparations with minimal handling, reducing variability in time-lapse imaging outcomes.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple experimental conditions, enabling consistent comparison of migration phenotypes.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models postnatal neurogenesis domains—subependymal zone, rostral migratory stream, and olfactory bulb—to study mechanisms directly applicable to neurodevelopmental disorder mechanisms.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by providing a disease-relevant system where migration dynamics can be monitored longitudinally.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing non-uniform cytoskeletal protein expression during migration, highlighting potential off-target effects on cellular machinery.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for modifiers of neuronal migration in postnatal brain development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct observation of neuroblast migration in response to experimental variables.
- Screening: Provides assay readiness through standardized slice preparation and transplantation, yielding quantitative outputs on migration trajectory and velocity.
- Analytics: Generates high-resolution time-lapse data and immunohistochemical readouts that allow teams to compare conditions based on migration integrity and cytoskeletal dynamics.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling a disease-relevant system where neuronal migration is a key pathophysiological process.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across projects, reducing redundant model development and enabling cross-study comparison of migration phenotypes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in neuronal migration assays through direct, high-resolution visualization.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via optimized slice culture protocols and minimal tissue handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets affecting migration, reducing late-stage failure due to unanticipated biological effects.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering quantitative, imaging-based endpoints that inform advancement decisions in neurodevelopmental pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in postnatal brain dissection, vibratory sectioning, and sterile tissue handling to maintain slice viability.
- Depends on fluorescence microscopy with extra long working distance objectives and environmental control for time-lapse imaging.
- Necessitates cross-team standardization of slice preparation, transplantation, and imaging timing to ensure reproducible migration readouts.
- Involves adaptation considerations when applying the assay to different genetic backgrounds or disease models, particularly regarding age-matched donor-recipient pairing.
- Limited by slice viability of up to 36 hours, with declining migration speed and orientation after 24 hours, requiring same-day experimental completion.
