异核体技术用于细胞类型特异性定位分析

本实验的总体目标是通过在两种不同的细胞系中分别表达带有两种不同荧光蛋白标记的单一蛋白，并将这两种细胞系融合，从而追踪蛋白的移动。该目标首先通过将含有目的基因与两种不同荧光蛋白基因之一融合的质粒分别转染至两种不同的细胞类型中来实现。实验的第二步是将细胞混合，使每种细胞类型均能积累相应的蛋白。

该实验步骤的第三步是抑制蛋白质合成，然后使用聚乙二醇融合细胞。实验的最后一步是通过荧光显微镜观察蛋白质的定位。最终，可通过荧光显微镜获得结果，显示蛋白质定位或运输行为的改变。

该方法有助于解答癌症生物学领域中的关键问题，例如细胞发生转化时蛋白质功能和行为如何发生改变。尽管该方法可揭示转化细胞特异性变化，还可应用于其他研究领域，如细胞分化、发育生物学和细胞信号转导。

通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为每种不同类型的细胞都需要优化转染条件以及融合条件。本方案中演示的第一种将质粒 DNA 导入细胞的方法是 NU 核转染法，该方法使用 lonza 核转染试剂，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤近期传代且处于对数生长期的细胞，并通过离心收集细胞。待细胞失去贴壁性后，加入含血清的培养基中和胰蛋白酶，并在 1500 ×g 离心 5 分钟以收集细胞。

在组织培养超净台中，向六孔板中加入灭菌的盖玻片，然后每孔加入1.5毫升完全培养基，盖好盖子，将培养板转移至细胞培养箱中平衡。

离心后，将离心管转移至生物安全柜中，吸除上清液，并用少量 PBS 重悬细胞沉淀。接着，计数细胞，并将细胞悬液分装至无菌微量离心管中，每管细胞数量约为 5 × 10⁵ 个。再次于 1500 × g 离心 5 分钟。

离心完成后，将离心管置于细胞培养超净台中，吸除SNA，并小心重悬。每管中加入100 µL室温核效应溶液重悬细胞。然后向每个样品中加入5 µg质粒DNA，将样品转移至核效应Q小室并盖上盖子。

注意避免产生气泡。将样品 qve 插入 Q vet 持架中。选择适当的核效应程序并启动运行。

选择最合适的程序可能需要预先进行测试，以确定最佳转染效率并使细胞死亡率降至最低。然后将细胞接种到六孔板中，可混合接种或分别作为对照。将培养板放回培养箱，让细胞恢复培养12小时。

演示的第二种瞬时表达质粒的方法是使用kagen转染试剂进行转染。首先，在无菌离心管中，将每种质粒DNA样品0.8微克加入200微升EC缓冲液中。然后向每个样品中加入6.4微升增强剂试剂。

轻轻弹击管壁混匀，室温孵育2分钟。短暂孵育后，向每个样品中加入20 µL的反应试剂。轻轻弹击各管混匀，室温孵育15分钟。

孵育期间，准备实验中要使用的两种细胞系。用于转染的细胞应为近期传代、处于对数生长期且融合度约为80%的细胞。用PBS洗涤细胞一次，并加入1.5毫升含10%FBS的新鲜DMEM培养基。

现在DNA转染试剂已经孵育15分钟，向每个样品中加入1.2毫升含10% FBS的DMEM培养基，用移液器混匀，然后立即以约700微升的量逐滴加入到两个孔中。在六孔板中通过轻轻摇晃平板混匀。将细胞置于细胞培养罩内的孵育箱中转染至少3小时，如需要，可在六孔板的每个孔中放入一片无菌的盖玻片。

可使用包被的盖玻片以增强细胞黏附。接着，用 PBS 将转染后的细胞洗涤两次，并用最小量的胰蛋白酶消化法收集细胞。具体操作为：向每孔加入 100 微升胰蛋白酶溶液，轻轻振荡培养板以确保溶液完全覆盖孔底表面。

然后立即吸除残留的胰蛋白酶。用含有10%胎牛血清的1.5毫升新鲜DMEM重悬细胞，以中和残余的胰蛋白酶，并将细胞接种于六孔板中的盖玻片上，可混合培养或分别作为对照。将六孔板置于细胞培养箱中，使细胞恢复12小时。

无论采用何种转染方法，生成异源携带输注物的步骤均相同。转染后，从孔中移除培养基，并用 PBS 洗涤细胞两次。接下来，建议用环己酰亚胺处理细胞，以抑制进一步的蛋白质合成。

在培养基中加入环孢菌素，终浓度为 100 微克/毫升，以覆盖细胞，并在细胞培养箱中孵育 2 小时。孵育 2 小时后，从培养箱中取出细胞，用 PBS 洗涤细胞两次。为启动融合，用含 50% 聚乙二醇 1000 的无血清 DMEM 溶液覆盖细胞，孵育 125 秒。

在室温下，移除 PEG 溶液，并用 PBS 洗涤细胞以去除残留的聚乙二醇。然后加入 2 毫升预热至 37°C 的含 10% FBS 的 DMEM 培养基。将细胞置于细胞培养箱中孵育 18 至 24 小时。

孵育18至24小时后，从培养箱中取出培养板，用PBS洗涤细胞两次。随后，向每个孔中加入1毫升4%多聚甲醛PBS溶液，轻轻振荡固定15分钟。

孵育期间，准备待用的显微镜载玻片，滴加含 dpi 的封片剂。随后用 PBS 洗涤固定后的细胞两次，并用小镊子小心取下每一张盖玻片。在将盖玻片细胞面朝下置于含封片剂和 tappi 的载玻片上之前，先用滤纸吸去残留的 PBS。

用纸巾去除载玻片上多余的封片剂，并密封盖玻片边缘。使用指甲油封固后，可通过共聚焦或落射荧光显微镜观察细胞。在此流程图中，分析蛋白质在特定细胞类型中定位的杂交方法分为三个基本步骤。

通过聚乙二醇1000将表达荧光标记蛋白的质粒转染至细胞并诱导细胞融合，随后进行荧光显微镜成像。如这些倒置荧光图像所示，在非小细胞肺癌细胞系H 1299中，表达GFP标记的鸡贫血病毒VP3蛋白的包皮成纤维细胞自融合对照组显示该蛋白主要定位于细胞质。而用DS.RED标记相同VP3蛋白的自融合对照组则显示蛋白主要定位于细胞核。将原代包皮成纤维细胞与H 1299细胞进行异细胞融合后，转化细胞的物质被导入原代包皮成纤维细胞，导致来源于原代细胞的GFP标记VP3蛋白的定位由细胞质转移至细胞核。

在进行该实验操作时，需要牢记成功与否在很大程度上取决于所用特定细胞类型的转染效率，以及针对这些特定细胞优化融合条件。完成本实验步骤后，还可进一步采用如翻转（flip）和荧光漂白后恢复（frap）等其他方法，以回答涉及蛋白质定位动态实时分析的更多科学问题。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过引入荧光标记蛋白并构建细胞融合，来评估特定细胞类型的蛋白质定位特征。