Name: 异核技术的细胞类型特异性定位分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-11T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 学习异核技术进行细胞类型特异性蛋白质定位分析，利用荧光标记融合蛋白和聚乙二醇介导的细胞融合，结合活细胞成像追踪蛋白质核质穿梭动态。该方法为癌症生物学和细胞信号研究提供重要工具。

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我们感谢伍斯特理工学院化学与生物化学系提供的资金支持。

1. 细胞系转染
转染方法 1
（使用Lonza核转染技术提高原代细胞转染效率）
<ol>
	<li>转染前，细胞应为近期传代且处于对数生长期。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，并通过胰酶消化法收集细胞。</li>
	<li>以1500 × g离心5分钟收集细胞。</li>
	<li>将灭菌的盖玻片放入6孔板中。可根据需要对盖玻片进行包被以增强细胞贴附。每孔加入1.5 mL培养基（本实验中为含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基），并将培养板置于培养箱中平衡。</li>
	<li>通过胰酶消化法收集细胞，并用少量磷酸盐缓冲液（PBS）重悬。</li>
	<li>计数细胞，并离心适量的细胞悬液，使每份样品含有约5×105个细胞。</li>
	<li>每份样品用100 μL室温的Nucleofector溶液小心重悬细胞。</li>
	<li>将100 μL细胞悬液与5 μg质粒DNA混合，小心转移至Nucleofector比色杯中，避免产生气泡。</li>
	<li>选择合适的Nucleofector程序（可能需要预先测试以确定最佳转染效率并尽量减少细胞死亡率）。</li>
	<li>将含有细胞/DNA悬液的比色杯插入Nucleofector比色杯架中，并启动所选程序。</li>
	<li>程序完成后，取出比色杯，并向其中加入约500 μL预平衡的培养基（取自6孔板）。</li>
	<li>立即转移样品至6孔板中，每孔终体积为1.5 mL。细胞可按混合群体或单独接种，以设置对照。</li>
</ol>
转染方法 2
（Qiagen Effectene 细胞系转染）
<ol>
	<li>使用Qiagen Effectene试剂制备转染复合物：首先将0.8 μg的每种质粒DNA样品加入200 μL EC缓冲液中。</li>
	<li>向每个样品中加入6.4 μL增强剂试剂，通过轻弹管壁短暂混匀，并在室温下孵育2分钟。</li>
	<li>向每个样品中加入20 μL Effectene试剂，轻弹管壁混匀，并在室温下孵育15分钟。</li>
	<li>在孵育期间，准备两种目标细胞系用于转染。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤近期传代的细胞（<80%汇合度）一次，然后重新加入1.5 mL新鲜预热并平衡的生长培养基（本实验中为Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）含10%胎牛血清（FBS））。</li>
	<li>转染复合物孵育15分钟后，向每个样品转移1.2 mL培养基，用移液器吹打混匀，立即向6孔板中的两个孔各加入约700 μL复合物溶液，逐滴加入，并通过轻轻旋转培养板混匀。让细胞转染至少3小时（可根据细胞类型有所变化）。</li>
	<li>将灭菌的盖玻片放入新的6孔板中。可根据需要对盖玻片进行包被以增强细胞黏附。</li>
	<li>细胞转染完成后，用PBS洗涤细胞两次，并通过最小程度的胰酶消化收集细胞：向每个孔中加入约100 μL胰酶溶液，轻轻振荡培养板使溶液充分覆盖孔底，立即吸除胰酶。待细胞脱落后，加入1.5 mL新鲜培养基。</li>
	<li>此时，应将细胞以混合或分离的群体形式（对照组）接种至灭菌的盖玻片上。</li>
	<li>让细胞恢复培养12小时。</li>
</ol>
2. 细胞融合
<ol>
	<li>移除细胞的培养基，并用 PBS 洗涤两次。</li>
	<li>此时建议用环己酰亚胺（100 μg/mL）处理细胞，以抑制蛋白质合成。将细胞孵育 2 小时，然后用 PBS 洗涤两次。</li>
	<li>将细胞暴露于含 50% 聚乙二醇 1000（PEG 1000）的无血清 DMEM 溶液中，在室温下作用 125 秒，以诱导细胞融合。</li>
	<li>用 PBS 洗涤细胞以去除 PEG 1000 溶液，并加入 2 mL 新鲜预热并平衡过的培养基。</li>
	<li>让细胞孵育 18 – 24 小时。</li>
</ol>
荧光显微镜
<ol>
	<li>移除培养基，用 PBS 洗涤细胞两次。</li>
	<li>每孔加入 1 mL 4% 多聚甲醛溶液（溶于 PBS），固定细胞，轻轻振荡 15 分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤固定后的细胞两次。</li>
	<li>小心从培养板中取出盖玻片，吸去多余的 PBS，然后倒置贴附于载玻片上，载玻片上预先滴加一滴封片剂（含 DAPI 的封片液：90% 甘油，100 mM Tris pH 7.5，2% DABCO（1,4-二氮杂双环辛烷））。</li>
	<li>去除载玻片上多余的封片剂，用指甲油封固盖玻片。</li>
	<li>通过共聚焦显微镜或落射荧光显微镜观察细胞。</li>
</ol>
3. 代表性结果
图2展示了一个使用原代成纤维细胞和H1299非小细胞肺癌细胞的异核体实验示例。本实验中关注的蛋白质（鸡贫血病毒VP3）在原代细胞类型中主要定位于细胞质，而在转化细胞类型中则定位于细胞核，这一现象通过落射荧光显微镜观察得到证实。该蛋白在原代包皮成纤维细胞（PFF）中以与GFP融合的形式表达（pEGFP-N1载体，Clontech），在H1299细胞中则以与dsRed融合的形式表达（dsRed-N1载体，Clontech）。对照样本为同源融合（最上面两行），显示为多核细胞，且稳态定位模式未发生改变。此类改变可能因对融合条件敏感或合胞体形成而发生。异核体融合（最下面一行）表明，来源于原代细胞的GFP融合蛋白进入细胞核，并与来源于转化细胞的dsRed融合蛋白发生共定位，提示转化细胞成分的引入引发了定位变化。图中所示为一种相对罕见的由两种细胞各一个融合而成的异核体，其特征是同时存在两种荧光蛋白信号。除了检测此类定位转变外，还可通过观察单一荧光蛋白在两个细胞核中的存在来轻松检测核质穿梭活性。在分析1:1细胞融合时，这种判断尤为明确，且需依赖于蛋白质翻译的抑制。
<img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig1.jpg" alt="细胞融合示意图；GFP/dsRed 质粒转染；异核体形成 18-24 小时；成像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1. 使用原代成纤维细胞和 H1299 非小细胞肺癌细胞的异核体实验方法流程图。 将目的基因克隆至两种荧光蛋白基因之一，形成同框融合。随后将两种构建体分别瞬时转染至细胞系中，并给予恢复时间。通过短时间聚乙二醇（PEG）处理诱导异核体形成，再进行进一步孵育。最后，利用多种荧光显微镜技术观察目的蛋白的亚细胞定位。
<img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig2.jpg" alt="共聚焦显微镜、GFP/dsRed/DAPI染色、细胞融合及异核体形成分析示意图" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 通过异核体融合可视化鸡贫血病毒VP3蛋白的核质运输与穿梭活性。上排：表达dsRed-VP3的自融合H1299细胞的代表性图像。中排：经PEG融合后表达GFP-VP3的原代包皮成纤维细胞（PFF）的代表性落射荧光图像。下排：PFF细胞与H1299细胞的异核体融合。黄色表示GFP与dsRed信号的共定位。细胞使用Leica AF6000E荧光显微镜及Leica成像软件进行成像。

<ol><li>Belaya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIPing+heterokaryons+to+analyze+nucleo-cytoplasmic+shuttling+of+yeast+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">FLIPing heterokaryons to analyze nucleo-cytoplasmic shuttling of yeast proteins.</a> RNA. 12, 921-930 (2006).</li>
<li>Bhaumik, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+target+of+a+transcriptional+activator+revealed+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vivo target of a transcriptional activator revealed by fluorescence resonance energy transfer.</a> Genes Dev. 18, 333-343 (2004).</li>
<li>Cohen, H. R., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XIST+RNA+exhibits+nuclear+retention+and+exhibits+reduced+association+with+the+export+factor+TAP%2FNXF1%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">XIST RNA exhibits nuclear retention and exhibits reduced association with the export factor TAP/NXF1.</a> Chromosoma. 116, 373-383 (2007).</li>
<li>Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dapper1+is+a+nucleoplasmic+shuttling+protein+that+negatively+modulates+Wnt+signaling+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dapper1 is a nucleoplasmic shuttling protein that negatively modulates Wnt signaling in the nucleus.</a> J. Biol. Chem. 51, 35679-3588 (2008).</li>
<li>Grespin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+Hormone+Receptor+%CE%B11+Follows+a+Cooperative+CRM1%2FCalreticulin-mediated+Nuclear+Export+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Thyroid Hormone Receptor α1 Follows a Cooperative CRM1/Calreticulin-mediated Nuclear Export Pathway.</a> J. Biol. Chem. 283, 25576-25588 (2008).</li>
<li>Heilman, D. W., Teodoro, J. G., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptin+Nucleocytoplasmic+Shuttling+Is+Required+for+Cell+Type-Specific+Localization%2C+Apoptosis%2C+and+Recruitment+of+the+Anaphase-Promoting+Complex%2FCyclosome+to+PML+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virology%22%5BJournal%5D)">Apoptin Nucleocytoplasmic Shuttling Is Required for Cell Type-Specific Localization, Apoptosis, and Recruitment of the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome to PML Bodies.</a> J. Virology. 80, 7535-7545 (2006).</li>
<li>Jeffries, S., Capobianco, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoplastic+transformation+by+Notch+requires+nuclear+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neoplastic transformation by Notch requires nuclear localization.</a> Mol Cell Biol. 20, 3928-3941 (2000).</li>
<li>Keaton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocytoplasmic+trafficking+of+G2%2FM+regulators+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleocytoplasmic trafficking of G2/M regulators in yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 19, 4006-4018 (2008).</li>
<li>Ling, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear-Cytoplasmic+Shuttling+Is+Not+Required+for+the+Epstein-Barr+Virus+EBNA-LP+Transcriptional+Coactivation+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virology%22%5BJournal%5D)">Nuclear-Cytoplasmic Shuttling Is Not Required for the Epstein-Barr Virus EBNA-LP Transcriptional Coactivation Function.</a> J. Virology. 83, 7109-7116 (2009).</li>
<li>Lin, X. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RXR%CE%B1+acts+as+a+carrier+for+TR3+nuclear+export+in+a+9-cis+retinoic+acid-dependent+manner+in+gastric+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">RXRα acts as a carrier for TR3 nuclear export in a 9-cis retinoic acid-dependent manner in gastric cancer cells.</a> J. Cell Science. 117, 5609-5621 (2004).</li>
<li>Vissinga, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Export+of+NBN+Is+Required+for+Normal+Cellular+Responses+to+Radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear Export of NBN Is Required for Normal Cellular Responses to Radiation.</a> Mol Cell Biol. 29, 1000-1006 (2009).</li>
<li>Zimmerman, R. S., Rosenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+p19Arf+localization+accompany+apoptotic+crisis+during+pre-B-cell+transformation+by+Abelson+murine+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Changes in p19Arf localization accompany apoptotic crisis during pre-B-cell transformation by Abelson murine leukemia virus.</a> J. Virol. 82, 8383-8391 (2008).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文介绍的异核体实验方案提供了一种高效且易于解读的方法，用于表征细胞类型特异性的定位行为以及核质穿梭活性。该方法利用了荧光分析的高灵敏度，以及对活细胞进行成像并研究蛋白质动态过程的能力。该技术可轻松适用于多种不同类型的细胞，并可用于活细胞和固定细胞的成像。例如，可采用倒置荧光显微镜进行活细胞成像和时间序列视频采集。相比之下，贴附的细胞则可用于落射荧光显微镜分析稳态下的定位情况，或通过共聚焦显微镜对特定亚细胞定位进行更精细的成像。此外，还可结合光漂白后荧光恢复（FRAP）或光漂白过程中荧光丢失（FLIP）等技术，用于研究定位动力学1。在本方案中引入不同的荧光染料，可同时开展蛋白质相互作用实验，例如荧光共振能量转移（FRET）分析2。此外，还可使用多种细胞转运抑制剂，如Leptomycin B或显性失活型Ran GTP酶构建体，以确定特定核输入或核输出通路的依赖性5,6,9。
<ul>
	<li>在涉及穿梭活性的某些实验中，必须注意避免因新蛋白合成而导致的定位效应。在此类情况下，应使用翻译抑制剂或限定时间点。然而，翻译抑制可能带来的假象仍需警惕。对于穿梭和定位行为的清晰解读，最理想的是包含每种细胞类型各一个的细胞融合体。可能需要优化细胞数量和融合条件（时间与浓度），以促进此类理想的1:1融合事件。</li>
	<li>需要注意的是，根据所使用的特定细胞类型，实验方案中某些步骤的优化是必要的。实验过程中诸如融合效率、转染效率以及融合后细胞存活率等参数在不同细胞类型之间可能存在显著差异。特别是原代细胞，由于培养条件复杂且转染效率较低，操作难度较大。使用如Lonza Nucleofector等技术可实现细胞的快速处理，并显著提高转染效率。此外，电穿孔方法便于将悬浮状态的细胞直接转入后续的融合步骤。</li>
</ul>

<table><tbody><tr><td>Effectene 试剂</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3023602</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 修饰 Eagle&amp;rsquo;s 培养基（DMEM）</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30243FS</td><td>高葡萄糖</td></tr><tr><td>对甲醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 血清（胎牛）</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6 孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇 1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>528875-25GM</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-85</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2522-25G</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector HDF 试剂盒</td><td>Lonza Inc.</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr></tbody></table>

异核体技术用于细胞类型特异性定位分析

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

大量蛋白质受到细胞内区室转运或核质穿梭的调控。这些蛋白质具有多种多样的细胞功能，包括RNA和蛋白质的核输入/输出、转录调控以及细胞凋亡。值得注意的是，许多重要的细胞重组过程，如细胞分裂、分化和转化，通常涉及此类活动3,4,8,10。由于引发这些定位变化的刺激因素往往难以捕捉，且蛋白质本身的移动过程可能高度动态而难以追踪，因此对这些蛋白质及其调控机制的深入研究具有挑战性。例如，在细胞癌变相关研究中，持续揭示正常原代细胞与转化细胞之间不同的信号通路及蛋白质活性，有助于加深对该过程的理解6,7,11,12。由于许多蛋白质在细胞转化过程中或因转化而发生定位改变，因此开发高效表征这些蛋白质及其参与通路的方法，将有助于加深对癌变机制的认识，并为药物靶点的发现开辟新的方向。
本文介绍了一种用于分析原代和转化哺乳动物细胞间蛋白质转运与穿梭活性的方法。该方法结合异核体融合的生成与荧光显微镜技术，提供了一种灵活的实验方案，可用于检测蛋白质的稳态或动态定位。如图1所示，将两种不同的细胞类型分别瞬时转染含有目的基因与荧光蛋白基因连接的质粒构建体。转染后，利用聚乙二醇诱导细胞融合，随后可通过多种方法对蛋白质的定位进行成像观察。本文所述方案为基础性方法，可在此基础上添加特定技术进行拓展。

本文描述了一种灵活且高效的方法，用于表征特定细胞类型中蛋白质的定位及核质穿梭。该异核体方法利用荧光标记的融合蛋白，在细胞融合后对蛋白质定位进行成像。该方案适用于稳态下的定位分析，也可结合活细胞成像用于更动态的过程研究。

大量蛋白质受到细胞内区室化运输或核质穿梭的调控。这些蛋白质表现出多种多样的……

本实验的总体目标是通过在两种不同的细胞系中分别表达带有两种不同荧光蛋白标记的单一蛋白，并将这两种细胞系融合，从而追踪蛋白的移动。该目标首先通过将含有目的基因与两种不同荧光蛋白基因之一融合的质粒分别转染至两种不同的细胞类型中来实现。实验的第二步是将细胞混合，使每种细胞类型均能积累相应的蛋白。该实验步骤的第三步是抑制蛋白质合成，然后使用聚乙二醇融合细胞。实验的最后一步是通过荧光显微镜观察蛋白质的定位。最终，可通过荧光显微镜获得结果，显示蛋白质定位或运输行为的改变。该方法有助于解答癌症生物学领域中的关键问题，例如细胞发生转化时蛋白质功能和行为如何发生改变。尽管该方法可揭示转化细胞特异性变化，还可应用于其他研究领域，如细胞分化、发育生物学和细胞信号转导。通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为每种不同类型的细胞都需要优化转染条件以及融合条件。本方案中演示的第一种将质粒 DNA 导入细胞的方法是 NU 核转染法，该方法使用 lonza 核转染试剂，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤近期传代且处于对数生长期的细胞，并通过离心收集细胞。待细胞失去贴壁性后，加入含血清的培养基中和胰蛋白酶，并在 1500 ×g 离心 5 分钟以收集细胞。在组织培养超净台中，向六孔板中加入灭菌的盖玻片，然后每孔加入1.5毫升完全培养基，盖好盖子，将培养板转移至细胞培养箱中平衡。离心后，将离心管转移至生物安全柜中，吸除上清液，并用少量 PBS 重悬细胞沉淀。接着，计数细胞，并将细胞悬液分装至无菌微量离心管中，每管细胞数量约为 5 × 10⁵ 个。再次于 1500 × g 离心 5 分钟。离心完成后，将离心管置于细胞培养超净台中，吸除SNA，并小心重悬。每管中加入100 µL室温核效应溶液重悬细胞。然后向每个样品中加入5 µg质粒DNA，将样品转移至核效应Q小室并盖上盖子。注意避免产生气泡。将样品 qve 插入 Q vet 持架中。选择适当的核效应程序并启动运行。选择最合适的程序可能需要预先进行测试，以确定最佳转染效率并使细胞死亡率降至最低。然后将细胞接种到六孔板中，可混合接种或分别作为对照。将培养板放回培养箱，让细胞恢复培养12小时。演示的第二种瞬时表达质粒的方法是使用kagen转染试剂进行转染。首先，在无菌离心管中，将每种质粒DNA样品0.8微克加入200微升EC缓冲液中。然后向每个样品中加入6.4微升增强剂试剂。轻轻弹击管壁混匀，室温孵育2分钟。短暂孵育后，向每个样品中加入20 µL的反应试剂。轻轻弹击各管混匀，室温孵育15分钟。孵育期间，准备实验中要使用的两种细胞系。用于转染的细胞应为近期传代、处于对数生长期且融合度约为80%的细胞。用PBS洗涤细胞一次，并加入1.5毫升含10%FBS的新鲜DMEM培养基。现在DNA转染试剂已经孵育15分钟，向每个样品中加入1.2毫升含10% FBS的DMEM培养基，用移液器混匀，然后立即以约700微升的量逐滴加入到两个孔中。在六孔板中通过轻轻摇晃平板混匀。将细胞置于细胞培养罩内的孵育箱中转染至少3小时，如需要，可在六孔板的每个孔中放入一片无菌的盖玻片。可使用包被的盖玻片以增强细胞黏附。接着，用 PBS 将转染后的细胞洗涤两次，并用最小量的胰蛋白酶消化法收集细胞。具体操作为：向每孔加入 100 微升胰蛋白酶溶液，轻轻振荡培养板以确保溶液完全覆盖孔底表面。然后立即吸除残留的胰蛋白酶。用含有10%胎牛血清的1.5毫升新鲜DMEM重悬细胞，以中和残余的胰蛋白酶，并将细胞接种于六孔板中的盖玻片上，可混合培养或分别作为对照。将六孔板置于细胞培养箱中，使细胞恢复12小时。无论采用何种转染方法，生成异源携带输注物的步骤均相同。转染后，从孔中移除培养基，并用 PBS 洗涤细胞两次。接下来，建议用环己酰亚胺处理细胞，以抑制进一步的蛋白质合成。在培养基中加入环孢菌素，终浓度为 100 微克/毫升，以覆盖细胞，并在细胞培养箱中孵育 2 小时。孵育 2 小时后，从培养箱中取出细胞，用 PBS 洗涤细胞两次。为启动融合，用含 50% 聚乙二醇 1000 的无血清 DMEM 溶液覆盖细胞，孵育 125 秒。在室温下，移除 PEG 溶液，并用 PBS 洗涤细胞以去除残留的聚乙二醇。然后加入 2 毫升预热至 37°C 的含 10% FBS 的 DMEM 培养基。将细胞置于细胞培养箱中孵育 18 至 24 小时。孵育18至24小时后，从培养箱中取出培养板，用PBS洗涤细胞两次。随后，向每个孔中加入1毫升4%多聚甲醛PBS溶液，轻轻振荡固定15分钟。孵育期间，准备待用的显微镜载玻片，滴加含 dpi 的封片剂。随后用 PBS 洗涤固定后的细胞两次，并用小镊子小心取下每一张盖玻片。在将盖玻片细胞面朝下置于含封片剂和 tappi 的载玻片上之前，先用滤纸吸去残留的 PBS。用纸巾去除载玻片上多余的封片剂，并密封盖玻片边缘。使用指甲油封固后，可通过共聚焦或落射荧光显微镜观察细胞。在此流程图中，分析蛋白质在特定细胞类型中定位的杂交方法分为三个基本步骤。通过聚乙二醇1000将表达荧光标记蛋白的质粒转染至细胞并诱导细胞融合，随后进行荧光显微镜成像。如这些倒置荧光图像所示，在非小细胞肺癌细胞系H 1299中，表达GFP标记的鸡贫血病毒VP3蛋白的包皮成纤维细胞自融合对照组显示该蛋白主要定位于细胞质。而用DS.RED标记相同VP3蛋白的自融合对照组则显示蛋白主要定位于细胞核。将原代包皮成纤维细胞与H 1299细胞进行异细胞融合后，转化细胞的物质被导入原代包皮成纤维细胞，导致来源于原代细胞的GFP标记VP3蛋白的定位由细胞质转移至细胞核。在进行该实验操作时，需要牢记成功与否在很大程度上取决于所用特定细胞类型的转染效率，以及针对这些特定细胞优化融合条件。完成本实验步骤后，还可进一步采用如翻转（flip）和荧光漂白后恢复（frap）等其他方法，以回答涉及蛋白质定位动态实时分析的更多科学问题。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过引入荧光标记蛋白并构建细胞融合，来评估特定细胞类型的蛋白质定位特征。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

异核技术的细胞类型特异性定位分析

该视频展示了一种从小鼠海马齿状回（DG）的胶质细胞和干细胞中分离完整细胞核的方法。将DG组织在冰冷的匀浆缓冲液中进行机械解离，以释放细胞核。弃去组织碎片及其他释放出的细胞器，细胞核经DNA染料以及与神经元核抗原（NeuN）特异性结合的荧光素标记抗体染色。随后采用荧光激活细胞核分选技术，分离出NeuN阴性的非神经元细胞核。...

一种从海马齿状回非神经元细胞中分离细胞核的技术

基于亲和力的标记细胞核分离 果蝇 用于基因表达分析的组织样本

本实验方案的目的是利用荧光激活细胞分选（FACS）技术分选出特定类型的神经细胞，以便后续分析细胞类型特异性的基因表达、表观遗传标记和/或蛋白质表达。...

利用荧光激活细胞分选技术分析大鼠脑组织中特定细胞类型的基因表达

本文报道了在人类细胞中检测内源性和外源性着丝粒-动粒蛋白的实验方案，并通过间接免疫荧光染色方法（采用固定剂如多聚甲醛、丙酮或甲醇进行固定）对这些蛋白在着丝粒-动粒上的水平进行定量分析。...

内源性和外源性着丝粒-动粒蛋白的免疫荧光分析

本文介绍了一种在分离神经元细胞前对其进行分类，并对单细胞转录组进行后续表征的组合方法。该方案优化了样本制备流程，以确保RNA测序（RNA-Seq）的成功，并描述了一种专门用于深入理解细胞多样性的方法学。...

视网膜神经节细胞特定亚群的单细胞RNA测序

本实验方案介绍了一种简便、便捷的方法，利用组蛋白2B-GFP BacMam...

活细胞成像观察有丝分裂过程中的染色体分离

本文介绍了一种在活细胞细胞器中对单个膜蛋白进行多色定位的实验方案。通过使用自标记蛋白来连接荧光染料，可对同一细胞器不同膜区室中分布的蛋白质实现约18...

活体哺乳动物细胞器中单个膜蛋白的多色定位显微成像

批量基因表达检测会掩盖异质性细胞群体中单个细胞的差异。本文介绍了一种将单细胞基因表达分析与基于荧光激活细胞分选（FACS）的索引分选相结合的实验方案，可用于解析细胞异质性，并在分子水平上对免疫表型不同的细胞亚群进行特征鉴定。...

一种用于表征人类干细胞与祖细胞群体分子及免疫表型异质性的组合式单细胞方法

本实验方案的目的是融合两种不同的细胞类型以产生杂交细胞。通过荧光显微镜分析融合后的细胞，可追踪细胞器的来源细胞。该检测方法可用于研究细胞融合引起的扰动如何影响细胞结构与功能。...

基因组编辑细胞系的细胞间融合用于干扰细胞结构与功能

我们提出了一种三色染色质单分子定位显微镜（SMLM）染色与分析方案，可实现常染色质、异染色质和RNA聚合酶II（RNAP...

一种用于在致密核环境中研究染色质的多标记单分子定位显微镜实验方案

学习异核技术进行细胞类型特异性蛋白质定位分析，利用荧光标记融合蛋白和聚乙二醇介导的细胞融合，结合活细胞成像追踪蛋白质核质穿梭动态。该方法为癌症生物学和细胞信号研究提供重要工具。

异核体技术用于细胞类型特异性定位分析

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