Name: 从蛾的嗅觉系统的电生理测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: 学习使用玻璃微电极记录蛾类触角电位反应的电生理技术。该方法通过固定活体蛾虫并植入电极，可检测气味诱导的剂量依赖性神经信号，适用于神经科学与昆虫嗅觉系统研究。

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由美国农业部-国家食品与农业研究所（USDA-NIFA/AFRI 2010-65105-20582）、美国国家科学基金会（NSF 0918177）和贝杜基安研究公司（Bedoukian Research Incorporation）资助。

1. 昆虫
<ol>
<li>实验室中的脐橙螟（Amyelois transitella (Walker)（鳞翅目：麦蛾科）种群源自美国加利福尼亚州弗雷斯诺市杏仁树上采集的成虫。昆虫种群在环境培养箱（Percival Inc, IA）中维持培养，条件为28 ± 2°C、相对湿度75 ± 10%，光照周期为16小时光照:8小时黑暗。</li>
<li>每日收集新羽化的成虫，进行性别鉴定后转移至塑料盒（669 mL 午餐盒，13 x 13 cm，高4.5 cm，Rubbermaid）中，盒内放置最多10层吸水纸巾（Thirsty Ultra Absorbent，27.9 x 27.9 cm；Safeway），盒盖打孔以保证空气流通。此设置可提供约100%的相对湿度。</li>
<li>进行电生理测量时，使用羽化后2–4天的成虫，并在高湿度条件下保存。</li>
</ol>
2. 电生理学准备
<ol>
<li>将蛾类（雄性或雌性）轻轻推入一个移液器吸头（200 μL，USA Scientific Inc）中，该吸头从顶部被剪开，使其尖端直径较大（约 2 mm）。用湿润的纸巾残段从另一端轻轻推动蛾体，直至触角和部分头部从吸头尖端伸出。</li>
<li>用不干性黏土（Claytoon，Van Aken International，CA）覆盖头部以固定暴露的头部区域，仅留出单眼的一小部分和两条触角暴露。将此准备好的样本置于EAG显微操作仪MP-12（Syntech，德国）平台上的两个电极支架之间。</li>
<li>我们使用含丝的1.0 mm硼硅酸盐毛细管（WPI Inc，FL）在P-97型微电极拉制仪（Sutter Instruments，CA）上拉制而成的玻璃电极，获得尖端直径小于1微米的微电极。电极通过反向填充感器淋巴任氏液（Kaissling和Thorson 1980）。在显微镜（Leica MZ75）下，将一根电极插入暴露的眼部区域作为参考电极，而记录电极则容纳两条触角。为便于接触，在插入记录电极前需剪除远端1-2个触角节段。对于单个感器的记录，我们对此装置稍作修改：在显微镜（Olympus BX51WI；800倍放大）下将记录电极刺入感器。通过将玻璃电极插入感器基部来记录动作电位。信号由高阻抗前置放大器（Syntech，德国）放大后，输入UB-IDAC，再通过AUTOSPIKE软件（Syntech，德国）进行离线分析。交流信号经100–10,000 Hz带通滤波，动作电位通过AUTOSPIKE算法由计算机提取，该算法根据峰-谷振幅将信号与噪声区分开。单个神经元的反应以动作电位频率（每秒脉冲数）相对于自发频率的增加（或减少）来计算。</li>
</ol>
3. 化学刺激物与刺激方案
<ol>
<li>使用最高纯度的化学试剂。来自脐橙螟虫雌性信息素混合物的主要成分 (Z,Z)-11,13-十六碳二烯醛购自康涅狄格州的Bedoukian Research Inc公司。化学物质以玻璃蒸馏的正己烷按重量/体积（w/v）稀释，配制成10 μg/μL的储备液，并进一步进行十倍系列稀释。取10 μL溶于正己烷中的刺激物溶液，滴加至一张Whatman滤纸条（8×40 mm）上，在通风橱中轻轻振荡10秒以挥发溶剂，随后将滤纸条放入一支5 mL聚丙烯注射器（BD Syringes, NJ）中，从中可喷出不同体积的刺激物。单独使用正己烷及空注射器作为对照。</li>
<li>实验准备置于由Syntech刺激控制器（CS-55型号；Syntech, 德国）提供的加湿气流中，主气流流速为20 mL/sec，叠加一个4 mL/sec、持续500 ms的刺激脉冲。记录信号共10秒，从刺激脉冲开始前2秒起始。在500 ms的刺激过程中，将含有刺激物的5 mL聚丙烯注射器中的约2 mL净化空气注入主气流以刺激触角准备。在产生较强反应后，两次刺激之间至少间隔1分钟或更长时间。</li>
</ol>
4. 代表性结果
用雌性信息素组分 (Z,Z)-11,13-十六碳二烯醛刺激固定后的蛾类触角（图1），可产生显著的剂量依赖性反应（图2）。该主要信息素组分也能从长毛形感器中诱发出剂量依赖性的兴奋反应（图3A），单神经元记录轨迹图中清晰显示了这一现象（图3B）。
<img src="/files/ftp_upload/2489/2489fig1.jpg" alt="在受控环境中观察昆虫；标本置于透明管中；聚焦研究装置。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 被固定且触角暴露的活体脐橙螟蛾
<img src="/files/ftp_upload/2489/2489fig2.jpg" alt="EAG 振幅图显示对不同浓度（0.1、1、10 µg）正己烷的反应。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 对 (Z,Z)-11,13-十六碳二烯醛（一种主要的雌性信息素组分）引发的剂量依赖性 EAG 反应。
<img src="/files/ftp_upload/2489/2489fig3.jpg" alt="内耳毛细胞的扫描电镜图像；电生理数据；听觉反应分析；微伏刻度。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 雄性脐橙螟蛾的毛形感器以剂量依赖的方式响应(Z,Z)-11,13-十六碳二烯醛。(A) 雄性脐橙螟蛾的触角为多节结构，每一节均密布大量毛发状结构，即感器。扫描电子显微照片显示了插图中的细节（比例尺分别为200和50 μM）。(B) 来自毛形感器的细胞外单神经元记录。

<ol><li>Sattelle, D. B., Hall, L. M., Hildebrand, J. G. Insect olfactory sensilla: structural, chemical and electrical aspects of the functional organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaissling%2C+K-E+%22Receptors+for+Neurotransmitters.+Hormones+and+Pheromones+in+Insects%22">Receptors for Neurotransmitters. Hormones and Pheromones in Insects</a>. , Elsevier North-Holland. Amsterdam. 261-282 (1980).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

这种用于固定活体脐橙螟蛾以测量嗅觉信号的新方法已被证明具有高度的稳健性和可靠性。我们常规采用该方法从杏仁和开心果等天然寄主基质中分离并鉴定新型引诱物质。

<table><tbody><tr><td>显微镜 </td><td>Olympus Corporation</td><td>BX51WI 型号</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ75</td><td></td></tr><tr><td>1.0 mm 带纤维的硼硅酸盐毛细管 </td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-3</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>刺激控制器 </td><td>Syntech</td><td>CS-55 型号</td><td></td></tr><tr><td>高阻抗前置放大器（通用单端探针）</td><td>Syntech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>放大器/数据采集系统（USB-IDAC）</td><td>Syntech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EAG 显微操作器 MP-12 </td><td>Syntech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Z,Z)-11,13-十六碳二烯醛</td><td>Bedoukian Research Inc, CT.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman 滤纸</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1001070</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 聚丙烯注射器 </td><td>BD Biosciences</td><td>309633</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头（200 &amp;mu;L）</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-0806</td><td></td></tr><tr><td>669 mL 便当盒，13 × 13 cm；高 4.5 cm</td><td>Rubbermaid</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thirsty 超吸水垫，27.9 × 27.9 cm</td><td>Safeway</td><td></td><td></td></tr><tr><td>不干型黏土 </td><td>Claytoon , Van Aken International, CA</td><td>18150</td><td></td></tr><tr><td>环境控制室</td><td></td><td>I-30BLL 型号</td><td></td></tr></tbody></table>

来自蛾类嗅觉系统的电生理学测量

Electrophysiological Measurements from a Moth Olfactory System

昆虫的嗅觉系统为记录气味物质诱导的反应提供了独特的机会，这些反应可表现为触角电位图（EAG）和单个嗅觉毛记录（SSR），分别代表位于触角上所有气味受体神经元（ORNs）的总和反应以及单个嗅觉毛内所含神经元的反应。这些方法已被广泛应用于深入理解昆虫化学通讯机制。所鉴定出的刺激物随后可在害虫管理策略中用作引诱剂或驱避剂。

昆虫的嗅觉系统为记录气味物质诱导的反应提供了独特的机会，这些反应形式包括触角电位图（EAG）和单个嗅觉毛记录（SSR），它们分别来自位于触角上所有气味受体神经元（ORNs）的总和反应以及来自单个嗅觉毛内神经元的反应。

昆虫嗅觉系统为记录气味物质诱导的反应提供了独特的机会，这些反应形式包括触角电位图（EAG）和单个……

以下实验的总体目标是展示记录昆虫神经系统嗅觉反应的简便性。该方法通过固定活体蛾类，并将电极连接至其触角或单个神经元，以记录气味分子引发的反应。第一步，将一根充满生理盐水的玻璃电极插入蛾眼作为接地电极；第二步，将固定好的蛾类个体插入另一根充满生理盐水的玻璃电极中，从而记录触角电位图（antenna gram）形式的电生理反应，或从嗅觉感受神经元中记录单个神经元单位的反应。将记录电极插入阳光的基部。随后，天线信号被放大并输入模数转换器，以记录和保存信号。根据记录到的电信号（表现为EAG信号或峰电位），获得显示剂量依赖性气味物质诱导反应的结果。我们开发了一种从受束缚的加州脐橙粉蝶活体中记录肠电图的新方法。该技术的主要优势在于制备样本可长期保存，同一只粉蝶可多次用于记录多种反应，还可用于记录来自触角单个感受器的单细胞反应。我们之所以关注加州脐橙粉蝶，是因为它在加利福尼亚州是一种重要的农业害虫。然而，该方法也可用于其他刺吸式昆虫，不仅可用于解决关于基因功能的基础科学问题，还可用于开发新型引诱剂。本项对蛾类嗅觉系统的研究采用了橘小实蝇（Ullo Ella）。昆虫种群在环境培养箱中维持培养，培养条件为约28摄氏度、相对湿度约75%，并采用16小时光照与8小时黑暗的光周期。通过在塑料盒中放置多达10层浸湿的纸巾来为新羽化的蛾子制作容器。每天收集并鉴定羽化出的蛾子性别，然后将其转移至塑料盒中。用带孔的盖子盖住盒子，以保证空气流通，为电生理记录做好准备。首先，通过剪切一个200微升移液器吸头，使其尖端直径约为2毫米，从而制作一个用于固定蛾子的 holder。对于EAG或SSR实验，选择羽化后2至4天的蛾子。使用湿润的纸巾小段从吸头远离尖端的一端将蛾子插入移液器中，并轻轻推动蛾子使其朝向吸头尖端。继续推动蛾子，直到触角和部分头部从尖端伸出，用非干燥性黏土覆盖暴露的头部以固定头部，仅留出一只眼睛的一小部分和两条触角。将蛾子标本置于电生理记录显微操作仪的平台上，位于两个电极支架之间，使用尖端直径小于一微米的玻璃电极。用百肢林格液反向填充电极。通过显微镜观察，用一根电极刺入暴露的眼部区域，作为参考电极。下一步是在触角上放置记录电极。雄性海军橙色蛾的触角为多节结构，每一节都分布着大量毛发状结构。插图显示的是扫描电子显微照片，详细展示了端部小节的结构，以便于从触角进行记录。剪除远端一到两个触角节段。接下来，将两根触角均插入记录电极中。或者，对于单个嗅觉感器的记录，可将记录电极插入某个感器的基部。感器产生的动作电位通过高阻抗前置放大器放大后，输入USB智能数字模拟转换器，随后使用Autospike软件进行离线分析。下一步是使用ZZ 1113 HEXA deca Now（这是橘小实蝇雌性信息素混合物中的主要组分）配制化学刺激物，用正己烷将该化学物质稀释至所需浓度。取10 µL刺激溶液，加样至沃特曼滤纸条上，然后轻轻振荡10秒，使溶剂挥发。在通风橱下，将试纸条放入一个5毫升的聚丙烯注射器中，仅加入己烷，并使用空注射器作为空白对照来控制制备过程。EAG或SSR信号在由刺激控制器输送的加湿气流中记录，气流速度为每秒20毫升。将含有化学刺激物的注射器连接至气流控制器。记录两秒的基线电信号。然后向气流中施加持续500毫秒、流速为每秒4毫升的刺激脉冲。继续记录八秒的电信号。每次刺激之间至少间隔一分钟。该图显示了被固定雄性蛾触角对雌性信息素组分 CZ 1113 hexaco 刺激产生的强烈剂量依赖性反应。对正己烷的反应。蓝色线条依次显示溶剂对照。信息素剂量越大，电生理图记录的反应依次增强。该图显示了感器在受到雌性信息素组分刺激时的细胞外单神经元记录结果。这些记录结果表明存在剂量依赖性的兴奋性反应。一旦掌握，该技术可在数小时内完成，前提是操作得当。使用此方法时，务必避免污染，并尽可能使用高纯度的化学试剂。

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科研

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从蛾的嗅觉系统的电生理测量

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