测量线虫寿命在96孔板

该程序的总体目标是测量用目标药物治疗的 sea Elgan 蠕虫的寿命。这是通过首先制备 OP 50 来实现的，OP 50 是一种用于喂养蠕虫的细菌菌株。然后生成年龄同步的蠕虫种群，并与饲养细菌 OP 50 一起接种到 96 孔板中。

在接下来的两天里，蠕虫长到 L 4 幼虫阶段，并添加药物 FUDR 以防止繁殖。第二天，蠕虫长大成人，并将感兴趣的药物添加到各个孔中。从这时起，每两到三天确定一次活蠕虫和死蠕虫的数量，直到所有蠕虫都死亡。

使用倒置显微镜进行观察，并记录每个会话中死虫和活虫的数量。大家好，我是 Greg Solis。我在斯克里普斯研究所化学生理学系的 Petro 实验室。

今天，我将向您展示如何同步蠕虫并将其分布在 96 壁微量滴定板中。您现有方法的这种技术的主要优点是可以快速识别可延长寿命和 C 修饰的分子。那么让我们开始吧。

为了准备 C 优雅的喂养细菌，从第 7 天开始，接种 5 毫升含有 100 微克/毫升的 TB 和 persin，以及 0.1 微克/毫升和带有单个 OP 50 菌落的 terin B，在 37 摄氏度下在细菌振荡器中孵育过夜第二天清晨，在 2000 年稀释 OP 51 的过夜培养物在 300 毫升含有 50 微克/毫升氨苄青霉素的 TB 中。将培养物在 37 摄氏度下在细菌摇床中孵育 8 至 12 小时，直至达到饱和。不要让培养物生长超过 14 小时。

将 OP 50 转移至无菌预装离心管中 在台式离心机中以 3， 500 RPM 或 2， 200 倍 G 离心 10 分钟，使 OP 50 沉淀。弃去 S 上清液，重悬 OP 50 沉淀，并在水中加星，并通过离心沉淀。重复此作，第二次后洗涤两次。

仔细清洗并彻底去除所有剩余的水。称量含有沉淀的离心管，减去空离心管的重量，以确定沉淀的重量。接下来，将沉淀在 S Complete 中彻底重悬至浓度为 100 毫克/毫升。

不应留下任何结块。100 毫克/毫升 OP 50 的浓度应对应于每毫升 10 个细菌的两倍 10 到每毫升 10 个细菌。如果光密度与每毫升细菌数之间的关系已知，则使用光光谱仪确定每毫升的细菌数。

如有必要，将 OP 50 补料溶液的浓度调整为每毫升 10 至 10 个细菌的两倍。最后，将 OP 50 溶液储存在 4 摄氏度，直到它用于蠕虫培养以产生蠕虫的年龄同步种群。从下午 6 点开始，用 5 到 10 天大的 NGM 板开始，其上的蠕虫种群主要由饥饿的 L 1 幼虫组成。

通过在本生灯上短暂加热金属刮刀来消毒金属刮刀。让它冷却。然后用凉爽的刮刀从装有饥饿蠕虫的盘子中切出琼脂块。

将几个这些块转移到用 OP 50 接种的新鲜 10 厘米 NGM 板上。将蠕虫在 20 摄氏度下孵育约 65 小时，直到大多数蠕虫种群由严重的成虫组成。饥饿的 L one 动物长成严重成年动物所需的时间可能因菌株而异。

孵育后，用 5 到 10 毫升无菌水从 10 厘米板中清洗蠕虫，从 10 厘米板中收集蠕虫。将蠕虫水溶液转移到 15 毫升锥形管中。在台式离心机中以 1、200 RPM 或 280 次 G 离心 2 分钟洗涤蠕虫，丢弃蚯蚓并加入 10 毫升水。

重复洗涤步骤，去除 SUP natant 并加入 5 毫升新鲜制备的漂白剂。氢氧化钠溶液在 RT 下孵育 5 分钟，直到蠕虫破裂。确保每分钟轻轻涡旋一次。

一旦所有成虫溶解，在解剖显微镜下监测反应的进度。加入 5 毫升 M 9 缓冲液以中和反应。用 10 毫升 M 9 缓冲液洗涤鸡蛋 3 次，以 2， 500 RPM 或 1， 100 倍 G 离心 2 分钟，然后用 10 毫升 S 洗涤鸡蛋一次，以 2， 500 RPM 或 1， 100 倍 G 离心 2 分钟。

加入 10 mL S complete，将溶液转移至新的 50 mL 锥形管中。加入 30 mLS Complete，最终体积为 40 mL。在室温下在 mutator 或类似设备上轻轻摇动试管过夜，以便在第二天中午左右接种动物板。

在解剖镜下，检查蠕虫是否在夜间孵化。通过计数 10 微升液滴中的蠕虫数量，确定 S 完整溶液中蠕虫的浓度。使用解剖镜，每个样品至少计数 10 滴。复苏。

以每毫升 80 至 100 条蠕虫的浓度悬浮蠕虫。在 S 完全培养基中，加入羧苄青霉素至终浓度为 50 μg/mL，加入两性霉素 B 至终浓度为 0.1 μg/mL。在 mutator 上摇晃。

如果制备大量蠕虫，请使用带过滤盖的 600 毫升非克隆瓶 下午 2：30 加入第一部分中制备的 OP 50，至终浓度为 6 毫克/毫升。将 OP 50 返回到 4 摄氏度。将 120 微升蠕虫 OP 50 溶液转移到底部透明的 96 孔板的每个孔中。

确保在使用胶带密封器进行移液密封板时保留蠕虫和悬浮液，以避免污染和蒸发。在微量滴定板振荡器上摇动板 2 分钟，然后在 20 摄氏度下孵育 2 天，直到动物达到 L 4 阶段。接下来，为了对动物进行消毒，向每个孔中加入 30 微升 0.6 毫摩尔 FUDR 储备溶液。

此步骤使每个孔中的最终体积达到 150 μL，并将 OP 50 的最终浓度从 6 毫克/毫升降低到 5 毫克/毫升。使用胶带密封器密封板，并在微孔板振荡器上摇晃 2 到 3 分钟。如果 OP 50 是在第 2 天 30 分减去 2 点添加的，那么重要的是在第二天上午 9：00 之前在中午返回板之前将 FUDR 添加到 20 摄氏度的培养箱中。

大多数动物应该是坟墓并包含几个蛋。每个添加的药物对寿命的影响是在所需浓度下进行测试。如果将药物溶解在 DMSO 中，DMSO 的最终浓度不应超过 0.6%，因为 DMSO 浓度高于 0.6%缩短添加药物后的 elgan 寿命。

用胶带密封剂密封板，并在微量滴定板上摇晃 2 到 3 分钟。摇床将板放回 20 摄氏度的培养箱中。添加药物偶尔会杀死每板几只动物，尤其是在使用水以外的溶剂时。

使用倒置显微镜检查动物尸体。一般来说，每 96 个世界板的死动物应少于 10 只 将板放回 20 摄氏度的培养箱中两天，让新鲜氧气进入培养物。取下密封剂。

等待 1 分钟，然后重新密封板。在微米级较紧的板振荡器上摇动板 2 到 3 分钟，在成人寿命的第 5 天每周重复一次，向 96 个孔中的每一个孔中加入 5 微升 100 毫克/毫升的 OP 50 溶液，以防止饥饿。从实验开始到死亡，蠕虫每周移动 3 次，通过它们的寿命进行评分。

使用具有 2 x 或 2.5 x 物镜的倒置显微镜观察 96 中的蠕虫。实验开始时，第 0 天的孔板。计算每个井中的蠕虫总数。

包含超过 18 只来自分析的动物的传感器孔，因为这些孔中的动物将没有足够的 OP 50，并且将在每次计数过程中显示饮食限制的影响。记录作为活体动物移动的动物的日期和数量。运动和液体比固体介质容易得多，并且可能由强光诱导。

使用更高的放大倍率可能有助于发现非常细微的运动，例如咽尖的运动。这种微妙的运动通常是在非常老的动物中观察到的唯一运动。将板放回 20 摄氏度的培养箱中。

每两到三天重复一次计数过程，直到所有动物都死了。这是 Excel 工作表的设计，用于记录每个孔的寿命数据。它在平板应变中的坐标、药物的药物浓度以及在实验开始时记录第 0 天存活的动物总数。

每周记录 3 次活着和死去的动物的日期以及数量，以便跟踪每口井中不同种群的生存情况。该图显示了海洋优雅、寿命、在 20 摄氏度和 25 摄氏度下记录的曲线的结果。基于微量滴定的寿命测定可准确再现寿命中温度依赖性的变化。

同样，如此处所示，微量滴定板测定再现了据报道寿命与野生型 N 2 动物不同的突变体的寿命变化。该图显示了增加米氮平剂量如何影响 Sea Elegance 的平均寿命。通过微量滴定板分析获得的数据具有足够的定量性，可以确定剂量反应关系一旦掌握，该技术可用于筛选大型化学库，以查找可延长寿命并看到优雅的分子。

感谢您的观看，祝您的实验好运。