用钙离子指示剂加载果蝇神经末梢

大家好，我叫Greg McLeod。我的实验室研究神经末梢中的钙调节及其对神经传递的影响。我们以黑腹果蝇（Oph Melanogaster）作为研究模型。

果蝇因其基因可操作性强且神经系统结构简单易研究，成为神经科学家理想的研究模型。在该神经系统中，已有可遗传编码的荧光指示剂用于检测神经末梢中的钙离子变化。然而，这些指示剂对钙离子的敏感性有限，且常表现出非线性响应。

合成指示剂更适合用于检测与神经活动相关的快速钙离子变化。我们将演示一种将葡聚糖偶联的合成钙离子指示剂加载到活体神经末梢中的技术，适用于 oph lava。葡聚糖偶联有助于防止钙离子指示剂被隔离到线粒体等细胞器中。

该加样技术可同样适用于幼虫、胚胎和成虫。我们将在载玻片上的小型雪茄盒浴中解剖幼虫。蓝色牙科蜡将用于支撑玻璃加样床。

从一个不拥挤的离心管侧面取一条游离的三龄幼虫。将幼虫置于数滴预冷的Schneider溶液中，并用大头针从头部和尾部固定，使背中线朝上。使用一对锋利的显微剪进行切割。

在胸部之间做一个小切口，切口需足够大，以便剪刀的下部刀刃能够插入。沿背部中线从胸部之间一直向头部方向剪开外骨骼。将幼虫旋转180度，然后将切口一直延伸至尾部末端。

需要注意的是，不要让底部刀片过深地刺入内脏，尤其是幼虫，以免损伤需要观察的肌肉和神经。大部分内脏会从切口处向上突出，靠近尾部在此处剪断一条气管，在另一侧也重复此操作，并将下方的气管一直剪至头部。

用剪刀剪除大部分内脏并将其从培养皿中移除。稍停片刻，放下剪刀，拿起第二把镊子。夹住角质层的切口边缘，将其横向拉向一侧并用大头针固定。

另一侧重复上述操作。向头部方向继续推进四个体节，重复该操作。修剪。此阶段应确保所有体节中的肌肉7、6、13和12均未受到任何损伤。

若已有样本受损，需另取一条幼虫进行解剖，因为此类损伤不可避免地会导致神经节收缩，从而影响后续成像。在接下来的步骤中，脑半球、腹神经节和节段神经将清晰可见。我们将用玻璃FOP床套住节段神经的压切端，并利用塑料填充丝将钙指示剂施加到神经的暴露末端。

但首先，我们将演示如何制备填充丝以及用于制作填充丝的填充效果。将采用两步拉制技术处理一根黄色缺陷光纤，沿其长度方向缓慢加热至一半位置，直至塑料变软并呈透明状。此时停止加热，并立即向上牵拉尖端，将其拉成一根细丝。

直径约为半毫米。将纤维切成50毫米长。现在将纤维置于解剖显微镜下并固定切口端。

末端形成一个缩颈，然后拉动另一端，拉出一段长约1厘米的细丝。必须在滤纸上用新的剃须刀片将其切断，以避免挤压，确保切口锋利，便于后续填充。使用无细丝的薄壁毛细管开始操作。

使用拉针仪将其拉成细锥形尖端。将制备好的针具置于解剖显微镜下，用一小片砂纸在锥形部分划痕。推动划痕远端的尖端，使其远离划痕一侧，从而让尖端整齐折断。

断裂处的内径应大于外径。在填充丝的末端，使用微型镊子加热使断裂部分收缩进入玻璃尖端，直至其内径达到约12微米。使用Bumps燃烧器抛光尖端的钝端。

可使用紧密贴合的凯尔特管连接刚性多段管和注射器，对效应器的钝端施加负压。同一根管和注射器将用于吸取和排出钙指示剂。钙指示剂应溶解于蒸馏水中，浓度为5毫摩尔。

将此溶液分装成每份五微升的等份。在4摄氏度下保存。请勿冷冻这些试剂，以保持其未冻结状态直至使用。

现在，将一到两厘米的钙离子指示剂吸入玻璃微电极丝中，即可准备进行该负载技术中最关键的步骤。使用剪刀和镊子，逐根切断最前部节段神经，并尽可能靠近腹神经节。从腹侧神经节分离最前部节段神经束。

清除所有碎屑。将填充丝的尖端置于幼虫中央的牙科蜡斜面上。连接吸液管和注射器。

用完美尖端的移液器吸取一些Schneider's溶液。现在将神经末端吸入尖端内。尖端与神经末端的贴合必须紧密，但不可过紧。

必须阻止施耐德氏管进一步进入保护区域。通常移除学术管和注射器，并将其连接到F灯丝上。将灯丝侧面接触浴液中的施耐德氏管以释放任何静电，然后立即在距离神经切断处50微米范围内插入灯丝胶效应，但不得实际接触神经。

缓慢推出钙离子指示剂，使施奈德氏液的体积增加约三分之一。最终钙离子指示剂浓度略低于2毫摩尔。将样品置于黑暗、湿润的环境中，于室温下孵育约40分钟。此处需要强调两点。

首先，尖端必须含有生理溶液，以稀释钙指示剂。由于钙指示剂仅溶于水，生理溶液中必须含有数毫摩尔浓度的钙，因为轴突末端封闭是一个依赖钙的过程，而轴突末端封闭对于维持神经末梢的健康至关重要。

第二个要点是，在切断神经后，必须在五分钟内将染料施加到神经的切断端。超过五分钟，轴突的末端将无法吸收分子量为10,000的葡聚糖偶联钙指示剂。要在此时间限制内完成操作，需要一些练习。

切勿通过降低钙离子水平来试图延缓轴突顶端的生长，因为这会损害神经损伤后的未来生理功能。经过40分钟孵育后，将施耐德氏溶液中的制备物轻轻接触灌注丝的侧面，然后重新插入，以从尖端和起始部位去除大部分钙离子指示剂溶液。再次使用该丝从浴液中吸取新鲜的施耐德氏溶液，并用施耐德氏溶液完全充满腔室。

床中不得有气泡，因为Schneider溶液将作为导体之一，使浴液与玻璃微电极刺激的神经绝缘。再次将标本置于黑暗处至少60分钟，但不超过4小时，在孵育期间每30分钟用新鲜的Schneider溶液更换一次RINs，钙指示剂随之沿轴突运输并在神经末梢富集。在希望观察标本前20分钟，用HL六号溶液冲洗标本。

当谷氨酸或L-谷氨酸浓度高于约0.4毫摩尔时，需将钙离子浓度调节至HL六至七毫摩尔，以阻止神经诱发的肌肉收缩。由于Schneider氏溶液本身已含有较高浓度的谷氨酸和钙离子，因此不适用于钙成像实验。这些浓度需要您进行相应调整。

只要在加样过程中存在至少2 mM的钙离子，Tate也可参与，从而可在HL六中完成Schneider的自发荧光加样及成像。在体视显微镜上设置样品以进行成像时，同样务必先释放所有静电，然后用一对镊子同时触碰浴液和物镜。

如果使用的是浸液物镜，应将其降至浴液中，然后瞬间接地基底进行刺激，或将一根电极放入浴液中，另一根插入填充物中，施加低于三伏、持续时间为300微秒的方波直流脉冲，可可靠地引发神经动作电位。此处我们观察到，在肌肉六与肌肉七之间的裂隙中，有两组神经末梢因驱动细胞质表达绿色荧光蛋白（GFP）而得以显影。这些神经末梢还通过顺向填充了钙离子指示剂Rod Dextran，其激发和发射光谱与GFP不同。

该视野仍包含神经末梢，但 Rod Rin 对钙的亲和力较低，在神经处于静息状态时几乎不可见。然而，当单个动作电位或短暂的两秒刺激串引起钙离子进入末梢时，Rod Rin 会表现出高度响应性。如上图所示，在对刚刚展示的紧密间隔的 80 赫兹刺激串进行荧光分析时，I 型 S 末梢中的反应通常强于 I 型 B 末梢中的反应。

低亲和力钙离子指示剂如 Rod Dextrin 和 flu。一种四聚体 Dextrin 在 10 至 80 赫兹的神经刺激频率范围内，在这些神经末梢中表现出近乎线性的响应。此处所示示例来自肌肉四号上的神经末梢，该末梢已加载 Rod Dextrin。