Name: 载入果蝇与神经末梢钙指标 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 16 s
Description: 学习将钙指示剂载入黑腹果蝇神经末梢的技术，用于研究神经传递中的钙信号动态。该方法结合专用装置制备，为神经科学研究提供可靠的活体成像手段。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol>
<li>选择一个干净的解剖皿，确保未接触任何固定剂。 </li>
<li>在含有 Ca2+ 和 L-谷氨酰胺的 Schneider's 果蝇培养基中解剖一只游走期 3rd 龄果蝇幼虫（切勿切断任何神经或损伤第 7、6、13 或 12 号肌纤维）。 </li>
<li>选择一支尖端内径为 12&nbsp;微米的玻璃填充移液管。 </li>
<li>使用注射器和管路（以对移液管施加负压），确保移液管尖端无堵塞。 </li>
<li>选择一根细塑料填充丝，可插入玻璃移液管全长。 </li>
<li>将约 1 厘米长的 5 mM 右旋糖酐偶联 Ca2+ 指示剂吸入塑料填充丝中。 </li>
<li>切断所有体节神经。 </li>
<li>将移液管置于斜坡支架上，使移液管尖端可接近解剖后幼虫的腹侧中线。 </li>
<li>在不夹捏神经的前提下，将第 4 体节神经的切断端引入移液管末端（包含少量 Schneider's 培养基）。 </li>
<li>移除管路，并将塑料填充丝插入移液管，直至其末端距离神经切断端约 50 微米（避免触碰神经）。 </li>
<li>向神经末梢排出足够的 Ca2+ 指示剂，使 Schneider's 培养基体积增加约 33%（最终浓度应&lt; 2 mM）。重要提示——此步骤必须在切断神经后 5 分钟内完成。 </li>
<li>将标本置于室温避光环境中，使神经完成染料负载。 </li>
<li>40 分钟后，使用填充丝移除 Ca2+ 指示剂。 </li>
<li>保持移液管位置不变，并将其完全充满新鲜 Schneider's 培养基，后续将用于向神经施加刺激脉冲。 </li>
<li>在开始 Ca2+ 成像前，让 Ca2+ 指示剂在神经中平衡至少 60 分钟，但不超过 4 小时。 </li>
<li>在平衡过程中，每隔 30 分钟用新鲜 Schneider's 培养基冲洗标本一次。 </li>
<li>成像前 20 分钟，将 Schneider's 培养基替换为类血淋巴溶液 No.6（HL6；Macleod 等，2002；2003）。 </li>
<li>可在 HL6 溶液中添加 7 mM 的 L-谷氨酸或谷氨酸盐，以使突触后谷氨酸受体脱敏，防止神经诱发的肌肉收缩（Macleod 等，2004；Reiff 等，2002；2005）。</li>
</ol>

<ol><li>Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+calcium+signals+in+Drosophila+motor+neuron+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals.</a> J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).</li>
<li>Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+neuron+activity+in+the+Drosophila+larval+CNS+detected+with+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators.</a> J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).</li>
<li>Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicles%3A+test+for+a+role+in+presynaptic+calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation.</a> J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).</li>
<li>Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+active+zone+density+during+long-term+strengthening+of+Drosophila+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions.</a> J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).</li>
<li>Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

<table><tbody><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s 昆虫培养基</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0146</td><td>必须含有 L-谷氨酰胺和钙</td></tr><tr><td>L-谷氨酸单钠盐水合物</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr></tbody></table>

用钙离子指示剂加载果蝇神经末梢

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

钙在神经系统中具有多种作用，其中最引人注目的作用是作为神经递质释放的触发因子，而最深远的作用则是作为支持学习与记忆的突触可塑性所必需的信号分子。为了进一步阐明依赖Ca2+的突触机制的分子基础，需要一个既具有遗传可操作性又具备生理可及性的模型系统。黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）正是这样一个理想的模型。在此系统中，已有可遗传编码的荧光指示剂用于检测神经末梢中的Ca2+变化。然而，这些指示剂对Ca2+的敏感性有限，且常表现出非线性响应。相比之下，合成荧光指示剂更适合于测量与神经活动相关的快速Ca2+变化。本文展示了一种将葡聚糖偶联的合成Ca2+指示剂加载到活体果蝇幼虫神经末梢的技术。特别强调了该实验方案中对技术成功最为关键的几个方面，例如如何避免沿分离神经产生静电放电、在长时间加载过程中维持样本的生理状态，以及通过提供Ca2+促进切断轴突末端的封闭以确保轴突存活。目前已有一些低亲和力的葡聚糖偶联Ca2+指示剂（如fluo-4和rhod）可供使用，它们在最小干扰突触前Ca2+动态的同时，展现出较高的信噪比。葡聚糖偶联有助于防止Ca2+指示剂被隔离至线粒体等细胞器内。该加载技术可同样适用于果蝇幼虫、胚胎及成虫。

钙是神经系统中一种普遍存在的信号分子，对于触发神经递质释放和突触强度的改变至关重要。本文中，我们演示了一种将Ca2+指示剂载入果蝇神经末梢的技术。同时，我们还展示了所需装置的制作过程，并强调了该技术成功实施的关键要点。

钙在神经系统中具有多种作用，但最引人注目的作用是作为神经递质释放的触发因子，而更深远的作用则是作为……

大家好，我叫Greg McLeod。我的实验室研究神经末梢中的钙调节及其对神经传递的影响。我们以黑腹果蝇（Oph Melanogaster）作为研究模型。果蝇因其基因可操作性强且神经系统结构简单易研究，成为神经科学家理想的研究模型。在该神经系统中，已有可遗传编码的荧光指示剂用于检测神经末梢中的钙离子变化。然而，这些指示剂对钙离子的敏感性有限，且常表现出非线性响应。合成指示剂更适合用于检测与神经活动相关的快速钙离子变化。我们将演示一种将葡聚糖偶联的合成钙离子指示剂加载到活体神经末梢中的技术，适用于 oph lava。葡聚糖偶联有助于防止钙离子指示剂被隔离到线粒体等细胞器中。该加样技术可同样适用于幼虫、胚胎和成虫。我们将在载玻片上的小型雪茄盒浴中解剖幼虫。蓝色牙科蜡将用于支撑玻璃加样床。从一个不拥挤的离心管侧面取一条游离的三龄幼虫。将幼虫置于数滴预冷的Schneider溶液中，并用大头针从头部和尾部固定，使背中线朝上。使用一对锋利的显微剪进行切割。在胸部之间做一个小切口，切口需足够大，以便剪刀的下部刀刃能够插入。沿背部中线从胸部之间一直向头部方向剪开外骨骼。将幼虫旋转180度，然后将切口一直延伸至尾部末端。需要注意的是，不要让底部刀片过深地刺入内脏，尤其是幼虫，以免损伤需要观察的肌肉和神经。大部分内脏会从切口处向上突出，靠近尾部在此处剪断一条气管，在另一侧也重复此操作，并将下方的气管一直剪至头部。用剪刀剪除大部分内脏并将其从培养皿中移除。稍停片刻，放下剪刀，拿起第二把镊子。夹住角质层的切口边缘，将其横向拉向一侧并用大头针固定。另一侧重复上述操作。向头部方向继续推进四个体节，重复该操作。修剪。此阶段应确保所有体节中的肌肉7、6、13和12均未受到任何损伤。若已有样本受损，需另取一条幼虫进行解剖，因为此类损伤不可避免地会导致神经节收缩，从而影响后续成像。在接下来的步骤中，脑半球、腹神经节和节段神经将清晰可见。我们将用玻璃FOP床套住节段神经的压切端，并利用塑料填充丝将钙指示剂施加到神经的暴露末端。但首先，我们将演示如何制备填充丝以及用于制作填充丝的填充效果。将采用两步拉制技术处理一根黄色缺陷光纤，沿其长度方向缓慢加热至一半位置，直至塑料变软并呈透明状。此时停止加热，并立即向上牵拉尖端，将其拉成一根细丝。直径约为半毫米。将纤维切成50毫米长。现在将纤维置于解剖显微镜下并固定切口端。末端形成一个缩颈，然后拉动另一端，拉出一段长约1厘米的细丝。必须在滤纸上用新的剃须刀片将其切断，以避免挤压，确保切口锋利，便于后续填充。使用无细丝的薄壁毛细管开始操作。使用拉针仪将其拉成细锥形尖端。将制备好的针具置于解剖显微镜下，用一小片砂纸在锥形部分划痕。推动划痕远端的尖端，使其远离划痕一侧，从而让尖端整齐折断。断裂处的内径应大于外径。在填充丝的末端，使用微型镊子加热使断裂部分收缩进入玻璃尖端，直至其内径达到约12微米。使用Bumps燃烧器抛光尖端的钝端。可使用紧密贴合的凯尔特管连接刚性多段管和注射器，对效应器的钝端施加负压。同一根管和注射器将用于吸取和排出钙指示剂。钙指示剂应溶解于蒸馏水中，浓度为5毫摩尔。将此溶液分装成每份五微升的等份。在4摄氏度下保存。请勿冷冻这些试剂，以保持其未冻结状态直至使用。现在，将一到两厘米的钙离子指示剂吸入玻璃微电极丝中，即可准备进行该负载技术中最关键的步骤。使用剪刀和镊子，逐根切断最前部节段神经，并尽可能靠近腹神经节。从腹侧神经节分离最前部节段神经束。清除所有碎屑。将填充丝的尖端置于幼虫中央的牙科蜡斜面上。连接吸液管和注射器。用完美尖端的移液器吸取一些Schneider's溶液。现在将神经末端吸入尖端内。尖端与神经末端的贴合必须紧密，但不可过紧。必须阻止施耐德氏管进一步进入保护区域。通常移除学术管和注射器，并将其连接到F灯丝上。将灯丝侧面接触浴液中的施耐德氏管以释放任何静电，然后立即在距离神经切断处50微米范围内插入灯丝胶效应，但不得实际接触神经。缓慢推出钙离子指示剂，使施奈德氏液的体积增加约三分之一。最终钙离子指示剂浓度略低于2毫摩尔。将样品置于黑暗、湿润的环境中，于室温下孵育约40分钟。此处需要强调两点。首先，尖端必须含有生理溶液，以稀释钙指示剂。由于钙指示剂仅溶于水，生理溶液中必须含有数毫摩尔浓度的钙，因为轴突末端封闭是一个依赖钙的过程，而轴突末端封闭对于维持神经末梢的健康至关重要。第二个要点是，在切断神经后，必须在五分钟内将染料施加到神经的切断端。超过五分钟，轴突的末端将无法吸收分子量为10,000的葡聚糖偶联钙指示剂。要在此时间限制内完成操作，需要一些练习。 切勿通过降低钙离子水平来试图延缓轴突顶端的生长，因为这会损害神经损伤后的未来生理功能。经过40分钟孵育后，将施耐德氏溶液中的制备物轻轻接触灌注丝的侧面，然后重新插入，以从尖端和起始部位去除大部分钙离子指示剂溶液。再次使用该丝从浴液中吸取新鲜的施耐德氏溶液，并用施耐德氏溶液完全充满腔室。床中不得有气泡，因为Schneider溶液将作为导体之一，使浴液与玻璃微电极刺激的神经绝缘。再次将标本置于黑暗处至少60分钟，但不超过4小时，在孵育期间每30分钟用新鲜的Schneider溶液更换一次RINs，钙指示剂随之沿轴突运输并在神经末梢富集。在希望观察标本前20分钟，用HL六号溶液冲洗标本。当谷氨酸或L-谷氨酸浓度高于约0.4毫摩尔时，需将钙离子浓度调节至HL六至七毫摩尔，以阻止神经诱发的肌肉收缩。由于Schneider氏溶液本身已含有较高浓度的谷氨酸和钙离子，因此不适用于钙成像实验。这些浓度需要您进行相应调整。只要在加样过程中存在至少2 mM的钙离子，Tate也可参与，从而可在HL六中完成Schneider的自发荧光加样及成像。在体视显微镜上设置样品以进行成像时，同样务必先释放所有静电，然后用一对镊子同时触碰浴液和物镜。如果使用的是浸液物镜，应将其降至浴液中，然后瞬间接地基底进行刺激，或将一根电极放入浴液中，另一根插入填充物中，施加低于三伏、持续时间为300微秒的方波直流脉冲，可可靠地引发神经动作电位。此处我们观察到，在肌肉六与肌肉七之间的裂隙中，有两组神经末梢因驱动细胞质表达绿色荧光蛋白（GFP）而得以显影。这些神经末梢还通过顺向填充了钙离子指示剂Rod Dextran，其激发和发射光谱与GFP不同。该视野仍包含神经末梢，但 Rod Rin 对钙的亲和力较低，在神经处于静息状态时几乎不可见。然而，当单个动作电位或短暂的两秒刺激串引起钙离子进入末梢时，Rod Rin 会表现出高度响应性。如上图所示，在对刚刚展示的紧密间隔的 80 赫兹刺激串进行荧光分析时，I 型 S 末梢中的反应通常强于 I 型 B 末梢中的反应。低亲和力钙离子指示剂如 Rod Dextrin 和 flu。一种四聚体 Dextrin 在 10 至 80 赫兹的神经刺激频率范围内，在这些神经末梢中表现出近乎线性的响应。此处所示示例来自肌肉四号上的神经末梢，该末梢已加载 Rod Dextrin。

loading-drosophila-nerve-terminals-with-calcium-indicators

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

载入果蝇与神经末梢钙指标

我们利用共聚焦显微镜结合荧光染料，在一种新型的活体果蝇幼虫“内向外”组织制备中，描述了胶质细胞-神经肌肉突触的结构特征。我们使用标记荧光的抗辣根过氧化物酶（HRP）一抗对活神经元末梢进行标记，同时利用荧光葡聚糖对突触周围间隙进行可视化观察。...

实时成像 黑腹果蝇 荧光染料标记的胶质细胞-神经肌肉接头

我们介绍一种已建立的技术，用于测量和分析活体黑腹果蝇（Drosophila...

Drosophila 嗅觉中枢对气味刺激反应的钙成像

本视频介绍 体内 钙成像在 果蝇...

Drosophila 体内 钙成像：神经元活动功能成像的一种方法

微电极介导的FM染料加载与卸载 果蝇 幼虫神经细胞

本视频演示了一种利用荧光染料研究表达光敏通道蛋白的黑腹果蝇（Drosophila）幼虫神经肌肉接头处突触小泡循环的实验方案。蓝光激活光敏通道蛋白，引发钙离子内流及突触小泡的胞吐作用。荧光染料嵌入神经元膜中，并在内吞过程中被摄入，导致荧光增强。随后的蓝光刺激诱导胞吐作用并释放染料，表现为荧光信号减弱。...

分析突触小泡循环与荧光染料摄取 黑腹果蝇 幼虫

本视频演示了一种利用突触定位的钙离子传感器在果蝇中进行体内钙成像的方法。内容涵盖了为显微镜观察准备果蝇、实施嗅觉条件化训练以及可视化气味诱导的钙离子内流的各个步骤。...

体内钙成像利用突触定位钙传感器在黑腹果蝇中的应用

来源： Ishimoto, H. et. al.,利用离体钙成像技术可视化果蝇脑对内分泌信号的响应。J. Vis. Exp. (2018)...

离体钙成像研究Drosophila脑对神经肽的反应

Drosophila的前足和喙部含有丰富的味觉感觉神经元。本文介绍一种利用钙成像技术检测活体果蝇前足和喙部感觉神经元在施加外源性味觉信息素后生理反应的方法。...

测量生理反应 果蝇 利用活体钙成像技术研究感觉神经元对脂质信息素的响应

本文介绍了一种通过蛙类神经残端将钙敏感性染料加载至神经末梢的方法。同时，我们还提供了一套用于记录和分析外周神经末梢快速钙瞬变的实验方案。...

通过神经残端将钙染料载入蛙类神经末梢：蛙类神经肌肉接头中钙瞬变的记录

本文介绍了一种可在果蝇（Drosophila）学习与记忆过程中可视化突触前和/或突触后钙信号的实验方案。该方法结合了定位于突触的钙离子传感器进行活体钙成像，并采用经典的嗅觉条件化范式，从而能够揭示此类联想学习背后的突触可塑性机制。...

在体光学钙成像观察学习诱导的突触可塑性在 Drosophila melanogaster 中的研究

本方案利用基因编码工具，在体内评估黑腹果蝇（Drosophila...

突触前和突触后单个配对成员的功能表征 果蝇 利用CaMPARI标记幼虫中枢神经系统

学习将钙指示剂载入黑腹果蝇神经末梢的技术，用于研究神经传递中的钙信号动态。该方法结合专用装置制备，为神经科学研究提供可靠的活体成像手段。

用钙离子指示剂加载果蝇神经末梢

探索更多视频