评估运动、学习和记忆功能障碍 果蝇 神经退行性疾病模型

该实验的总体目标是研究成年黑腹果蝇的学习与记忆能力，首先需确定果蝇是否存在运动功能缺陷，通过负向趋地性实验进行检测。随后将果蝇置于T型迷宫中，记录其向偏好的光照区域移动的潜伏期，以验证其正向趋光行为是否正常。

具有正趋光性的果蝇随后被训练以将明亮的环境与奎宁的苦味联系起来。最终，通过检测果蝇将厌恶刺激与明亮环境关联的能力，来评估其学习与记忆水平。Ola，欢迎来到X实验室。

今天我们将向您演示两种常用于研究神经退行性和果蝇的行為學檢測方法。首先，由我們實驗室的本科生 Wil Fredo Sala 和我為您展示厭惡性趨光抑制檢測，隨後由我們實驗室的研究生 kaiwan 為您展示負向重力趨性檢測。將果蠅飼養於標準的玉米粉-瓊脂-糖蜜-酵母培養基中，在 25°C 條件下以 12 小時光照/12 小時黑暗的循環進行維持。

在进行阻塞实验当天，将处女蝇按每组20只进行分组。处女蝇可通过其浅体色以及腹部腹面的一个深绿色斑点来识别。果蝇应每隔三天转移至新的培养管中，且应使用同窝果蝇以尽量减少遗传背景差异带来的影响。

在趋地性实验中，每种基因型或处理组应测试10至20个组。开始时，将雌性和雄性果蝇分别按每组10只进行分组。这些果蝇应单独测试。

由于行为显著受到性别的影响。在麻醉后至少等待一小时再进行后续操作，以确保运动活动未受影响。一旦果蝇准备妥当，将两个空的聚苯乙烯小瓶的开口对齐，通过将上部小瓶垂直连接到下部小瓶上来固定。

从底部向上测量八厘米，在圆周上画一个圆。装置组装完毕后，将一组10只果蝇转移到下方的小瓶中。立即将两个小瓶重新连接，并让果蝇适应一分钟，然后开始测试。

待果蝇稳定后，轻轻敲击试管，使果蝇全部落至管底，然后记录在10秒内爬升至8厘米标记线以上的果蝇数量。通过该标记线的果蝇数量以每组果蝇总数的百分比形式记录。每组重复此操作10次，每次试验之间让果蝇休息1分钟。

在进行PS实验前6小时，将雌性果蝇分选至含有湿润滤纸的聚苯乙烯小瓶中。此步骤可确保果蝇处于饥饿状态，从而对厌恶性味道更为敏感。在本实验中，奎宁溶液作为厌恶性刺激物。

从0.1摩尔的储备液配制一微摩尔的工作溶液。T型迷宫由一个带有活门的中心柱和两个侧室组成，分别为暗室和亮室。在两毫米处，使用手动锯将两个15毫升塑料离心管的封闭端切下，在每端安装连接适配器，并用多聚甲醛密封连接处。

用铝箔包裹一根试管，以作为暗室使用。通过将光照室和暗室分别拧到中心柱的两侧来组装TMA。中间的活门保持关闭状态，将光源直接连接到光照室的适配器上，完成装置的组装。在进行实验前，将每组10只果蝇逐一转移至一个空的15毫升离心管中，并轻轻盖上盖子以防止果蝇逃逸。

接下来，将暗室从TMA上拧下。将一只果蝇转移至管中，并立即将其重新插入迷宫。关闭房间内的灯光，并打开红色灯。

让果蝇在暗室中适应30秒，然后缓慢打开照亮明室的光源。光源开启后，打开分隔两个小室的活门。如果果蝇在10秒内进入明室，则视为具有正趋光性，可用于训练。

若果蝇未对此作出反应，则表明其视觉系统存在问题，需从实验中剔除。在确认果蝇具有正向趋光性后，轻敲装置将果蝇重新赶回暗室，关闭隔离门，并在第32次休息期间关闭光源。通过将滤纸放入亮室，并用移液器向滤纸滴加1毫升奎宁溶液，以准备厌恶刺激。

确保滤纸完全浸透厌恶刺激液。开始训练时，缓慢打开活门并打开光源，让果蝇进入含有奎宁气味的光照区域。

一分钟后，轻敲装置将果蝇赶回暗室。重复此操作九次，共进行10次条件化训练。通常情况下，野生型果蝇在经过三到五次训练后，训练刚结束时便会立即避开亮室。

进行五次测试试验。如果训练后的果蝇在10秒内未走入检测室的光区，则记录为一次通过。记录连续五次试验中的通过率，并予以确定。

PC零时。训练并完成初始PC零时记录后，将每只果蝇放回其原始编号的食物管中，并静置六小时。训练六小时后，按之前演示的方法进行五次额外的测试试验，此次通过率代表PC六时，用于评估短期记忆。

在负向地理趋向性实验中，越过八厘米标记的果蝇数量被转换为百分比，并以爬行通过率表示。如右侧所示，在10次试验中，过表达人源tau蛋白的10日龄雄性或雌性果蝇，相较于左侧同龄过表达GFP的果蝇，表现出显著的运动能力缺陷。

在厌恶性光趋向抑制实验中，表现通过平均通过率或成功回避试验的百分比来表示。与左侧的对照组相比，右侧显示的总试验中过表达tau蛋白的果蝇在训练后即刻以及六小时后测试时，均表现出较弱的将光线与苦味关联的能力。完成此步骤后，可采集样本进行免疫组织化学分析，以进一步探究形态学差异。观看本视频后，您应能充分理解如何在果蝇中研究学习与记忆。

请记住，这一切都关乎你自己。