Name: 在Sf9细胞，并在海兔感觉神经元PKC移位实时成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 学习使用激光扫描显微镜对Sf9细胞和海兔感觉神经元中的PKC移位进行实时成像的方法。该技术通过荧光标记揭示蛋白激酶C的动态调控机制，为研究细胞信号转导提供重要工具。

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本研究工作得到了加拿大卫生研究院（CIHR）向 Wayne S. Sossin 提供的资助。Carole A. Farah 获得了魁北克健康研究基金会（FRSQ）的博士后奖学金以及康拉德·哈灵顿（Conrad Harrington）奖学金。作者谨此感谢 Joanna Bougie、Margaret Hastings 和 Margaret Labban 在视频拍摄过程中提供的帮助，以及 Madeline Richmond Pool 在图形概览方面提供的协助。

1. Sf9 细胞单层培养物的制备与维持
<ol>
 <li>Sf9 细胞的培养和维持在组织培养罩中进行。</li>
 <li>Sf9 细胞来源于 Spodoptera frugiperda 卵巢细胞（Sf21 细胞），可从 Invitrogen 公司购买以 Grace's 培养基冷冻保存的细胞。</li>
 <li>在斜颈的 75 cm2 细胞培养瓶中加入 8 mL 补充了添加剂（1X）并添加了 30% 胎牛血清（FBS）的 Grace's 昆虫培养基。</li>
 <li>将冻存的 Sf9 细胞管在 37°C 水浴中快速解冻，通过来回移动试管约 1–2 分钟完成。</li>
 <li>将 Sf9 细胞转移至 75 cm2 细胞培养瓶中，并用手轻轻摇晃培养瓶，使细胞均匀分布。</li>
 <li>在 27°C 下孵育 1–2 小时，直至细胞贴壁。</li>
 <li>移除旧培养基，更换为 10 mL 新鲜的含 30% FBS 的 Grace's 昆虫培养基。</li>
 <li>在 27°C 下孵育，直至细胞达到汇合状态。</li>
 <li>为维持单层培养，从汇合的 Sf9 细胞培养瓶中移除旧培养基，并加入 5 mL 含 10% FBS 的 Grace's 昆虫培养基。</li>
 <li>轻轻敲击培养瓶侧面数次，使 Sf9 细胞脱落。</li>
 <li>使用 10 mL 移液器和移液器辅助装置，轻柔地将培养基上下吹打一次，在向下吹打时喷洒瓶壁。将细胞转移至无菌的 15 mL 聚苯乙烯管中。</li>
 <li>在新的 75 cm2 细胞培养瓶中，将 2 mL Sf9 细胞悬液加入 8 mL 含 10% FBS 的 Grace's 昆虫培养基中（1:5 稀释以维持对数生长期），并用手轻轻摇晃培养瓶。</li>
 <li>在 27°C 下孵育，直至细胞达到汇合状态。</li>
</ol>
2. 在Sf9细胞中表达荧光标记的PKC
<ol>
 <li>进行活细胞成像实验时，将 Sf9 细胞培养在 35 mm MatTek 玻璃底培养皿中，玻璃区域直径为 14 mm，盖玻片厚度为 0.16 至 0.19 mm。</li>
 <li>使用 Cellfectin II 转染试剂，按照制造商推荐方法并结合下述修改条件，在 Sf9 细胞中表达荧光蛋白标记的 PKC。</li>
 <li>第 1 天：接种细胞前，用含 10% 胎牛血清（FBS）的 Grace 昆虫培养基处理每个 MatTek 培养皿，处理时间至少 30 分钟。</li>
 <li>使用血细胞计数板对步骤 11（上文）中的 Sf9 细胞进行计数。</li>
 <li>在每个 MatTek 玻璃盖玻片上接种 0.05 × 106 个细胞，总体积为 150 μL。室温下孵育 30 分钟，使细胞贴壁。</li>
 <li>逐次缓慢向每个培养皿中加入 2 mL 含 10% FBS 的 Grace 培养基，每次加入 1 mL，避免细胞脱落。</li>
 <li>在 27°C 下过夜孵育。</li>
 <li>此后步骤请遵循制造商关于使用质粒 DNA 转染 Sf9 细胞的推荐方案。</li>
 <li>第 2 天：使用 Cellfectin II 转染试剂将荧光标记的 PKC 转染至 Sf9 细胞中。在此系统中，我们常共表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）标记和单体红色荧光蛋白（mRFP）标记的 PKC（质粒构建细节此前已有描述2,5）。单个荧光蛋白表达时，转染后 72 小时约有 70–80% 的细胞表达目标蛋白；共表达两种荧光蛋白时，共表达细胞的比例下降至约 30%。当共表达 eGFP 标记和 mRFP 标记的 PKC 时，为获得最佳蛋白表达水平，mRFP 标记蛋白所用质粒 DNA 量应为 eGFP 的两倍。</li>
 <li>转染后 48–72 小时进行活细胞成像（为获得最佳蛋白表达，建议等待 72 小时）。</li>
</ol>
3. 在Aplysia感觉神经元中表达荧光标记的PKC
<ol>
 <li>关于 Aplysia 神经元细胞培养的制备方法已在 Zhao 及其同事发表的视频文章中有所描述4。</li>
 <li>使用下文详述的显微注射方法，将带有荧光蛋白标记的 PKC 表达于 Aplysia 感觉神经元中。</li>
 <li>用蒸馏水配制 1% 的亮蓝 FCF（Fast Green）储备液，并使用注射器和 28 mm 注射器滤器（0.20 μm）过滤。分装后于 -20°C 保存。&nbsp;</li>
 <li>可在分离神经元后的第 1 天或第 2 天进行感觉神经元的显微注射，但我们发现等待 2 天有助于细胞更好地贴附于盖玻片。</li>
 <li>在分离感觉神经元后的第 2 天，解冻一份亮蓝 FCF 储备液，并再次使用注射器和 28 mm 注射器滤器（0.20 μm）过滤。</li>
 <li>用蒸馏水配制含有 0.5% 亮蓝 FCF 的质粒 DNA 溶液。质粒 DNA 浓度最高可使用至 0.4 μg/μL，但不建议超过此浓度。&nbsp;</li>
 <li>使用 1 mL 注射器和 4 mm 注射器滤器（0.20 μm）过滤质粒 DNA / 亮蓝 FCF 溶液。</li>
 <li>将质粒 DNA / 亮蓝 FCF 溶液在微量离心机中以 16110 × g 离心 15 分钟。</li>
 <li>使用微电极拉制仪（Sutter Flaming/Brown 微移液管拉制仪，型号 P-97）拉制用于神经元显微注射的尖锐电极。使用盒式灯丝，采用内含细丝的薄壁玻璃毛细管（World Precision Instruments TW100F-4，外径 1 mm，内径 0.75 mm，长度 100 mm）拉制玻璃微电极。有关微注射电极拉制的更多细节，请参阅 Sutter 电极制作手册。</li>
 <li>使用微加样器吸头（eppendorf CA32950-050）向每根电极中加入 2 μL 质粒 DNA / 亮蓝 FCF 溶液。</li>
 <li>将含有 Aplysia 神经元培养物的 MatTek 玻底培养皿转移至显微注射工作站。</li>
 <li>显微注射工作站包括以下组件：一个自制的大型玻璃载物台，用于将培养皿置于隔振台（Kinetic Systems 隔振工作站）上；配备外部卤素光源的体视显微镜；三轴可调的微操纵器（Sutter Huxley Wall 型微操纵器，支持粗调和超精细定位）；连接至气动泵（World Precision Instruments PV820 气动皮升泵）的微电极夹持器。气动泵的压力输入端连接至压缩氮气罐。</li>
 <li>将微电极插入微电极夹持器中。</li>
 <li>在体视显微镜下观察，将微量移液管的尖端插入细胞核内。</li>
 <li>施加短暂的氮气压力脉冲（持续时间为 10 至 100 毫秒，压力为 20 lb/in2），直至细胞核呈现均匀绿色。</li>
 <li>将细胞在室温下孵育 4 小时，随后置于 4°C 保存直至使用。为获得最佳的 PKC 易位效果，建议在注射后 20 至 24 小时内进行活细胞成像实验。</li>
</ol>
4. 在活体Sf9细胞及Aplysia感觉神经元中观察PKC的转位
<ol>
 <li>成像时，我们使用配备 Axiovert 200 的蔡司 LSM510 倒置共聚焦显微镜。</li>
 <li>Sf9 细胞与 Aplysia 感觉神经元的成像方案相同，仅以下参数不同：Sf9 细胞使用 63 倍油镜进行成像，而 Aplysia 感觉神经元使用 40 倍油镜进行成像；Sf9 细胞在温度控制的培养室中成像，温度维持在 26–27oC，而 Aplysia 感觉神经元则在室温下成像，温度维持在约 18–20oC。</li>
 <li>我们使用 30 mW 氩离子激光器（激发波长 488 nm），激光输出功率设为 50%，用于成像 eGFP 标记的 PKC 蛋白；使用 HeNe 激光器（激发波长 543 nm）用于成像 mRFP 标记的 PKC 蛋白。在成像前，氩离子和 HeNe 激光线的透射输出分别衰减至 4% 和 50%，并调节针孔至 1。</li>
 <li>必须将培养皿稳定放置于成像载物台上，避免移动或振动。</li>
 <li>使用 10 mL 移液器轻柔地从培养皿中移除 1 mL 培养基，使皿中剩余总体积为 1 mL。</li>
 <li>在细胞中部区域拍摄图像，以便观察到细胞核。</li>
 <li>设置时间序列，采集 10–20 幅共聚焦图像，每 30 秒拍摄一幅。</li>
 <li>开始时间序列采集。</li>
 <li>在拍摄完前两幅图像（即 30 秒时间点后），使用 P1000 移液器将 1 mL 药物（2 倍浓度）逐滴轻柔地加至细胞表面。药物添加过程持续约 30 秒。</li>
 <li>某些药物可诱导快速转位，可在给药后立即观察到（60 秒时间点）；而另一些药物则诱导缓慢转位，最佳观察时间为给药后 5–10 分钟（Movie 1 和 Movie 2）。</li>
 <li>若需洗去药物，使用两个 10 mL 移液器进行清洗：用一支移液器从培养皿一侧轻柔地加入清洗缓冲液，同时用另一支从对侧吸出培养基。</li>
 <li>若清洗有效且药物作用可逆，则 PKC 可在 30–60 秒内重新回到胞质中。</li>
 <li>将视频保存为 LSM 文件格式。</li>
 <li>使用 NIH Image J 软件打开 LSM 文件，并对给药前和给药后的图像进行定量分析。定量方法已在其他文献中描述1。</li>
</ol>

<ol><li>Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &amp, Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+role+for+phosphatidic+acid+in+the+translocation+of+the+novel+protein+kinase+C+Apl+II+in+Aplysia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons.</a> Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &amp, Klein, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M.Isoform+specificity+of+PKC+translocation+in+living+Aplysia+sensory+neurons+and+a+role+for+Ca2%2B-dependent+PKC+APL+I+in+the+induction+of+intermediate-term+facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation.</a> J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).</li>
<li>Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &amp, Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC+differentially+translocates+during+spaced+and+massed+training+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia.</a> J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-independent+PKC+Apl+II+mediates+the+serotonin+induced+facilitation+at+depressed+synapses+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia.</a> J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

我们描述了一种在Sf9细胞和Aplysia感觉神经元中实时成像荧光标记的蛋白激酶C（PKC）转位的技术。Sf9细胞为PKC转位的成像提供了一个简单的系统，因为其培养和转染操作相对直接。相比之下，Aplysia感觉神经元的显微注射需要较长时间才能掌握，可能长达数月。该技术相关的难点之一是电极堵塞。过滤注射溶液并进行离心通常有助于解决此问题，但有时在填充电极过程中会形成气泡。我们发现，使用微加样吸头而非依靠毛细作用来填充电极，有助于最大限度减少气泡的形成。关于活体成像，在成像过程中需严格控制两个因素：温度和运动。温度波动可能影响PKC的转位，因此应考虑使用温度控制腔室。为避免成像过程中的移动，可使用防震台。

<table><tbody><tr><td>Sf9 冻存细胞</td><td>&lt;em&gt;草地贪夜蛾&lt;/em&gt; 卵巢细胞</td><td>Invitrogen</td><td>B825-01</td><td></td></tr><tr><td>格蕾丝&amp;rsquo;补充昆虫培养基（1X），液体</td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>11605-094</td><td>用于培养Sf9细胞</td></tr><tr><td>Corning 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 倾斜颈细胞培养瓶</td><td>工具</td><td>康宁</td><td>430720</td><td>用于培养Sf9细胞</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>试剂</td><td>CanSera</td><td>CS-C08-500</td><td>补充 Grace&amp;rsquo;使用前将含 FBS 的培养基</td></tr><tr><td>注射器</td><td>工具</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>用于过滤快绿溶液</td></tr><tr><td>注射器</td><td>工具</td><td>BD 生物科学</td><td>309602</td><td>用于过滤质粒 DNA / 快绿溶液</td></tr><tr><td>过滤</td><td>工具</td><td>康宁</td><td>431229</td><td>用于过滤快绿溶液</td></tr><tr><td>过滤</td><td>工具</td><td>康宁</td><td>431212</td><td>用于过滤质粒 DNA / 快绿溶液</td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>工具</td><td>MatTek 公司</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>用于转染和成像前培养Sf9细胞</td></tr><tr><td>Cellfectin II 试剂</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>用于在Sf9细胞中表达荧光标记的PKC</td></tr><tr><td>快绿 FCF</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-7252</td><td>用于可视化质粒DNA溶液的显微注射过程 &lt;em&gt;Aplysia&lt;/em&gt; 感觉神经元</td></tr><tr><td>薄壁玻璃毛细管</td><td>工具</td><td>世界精密仪器公司</td><td>TW100F-4</td><td>用于制作微粒&amp;#8211;用于显微注射的电极</td></tr><tr><td>微量移液器吸头</td><td>工具</td><td>Eppendorf</td><td>CA32950-050</td><td>使用前需高压灭菌以填充微量移液器&amp;#8211;用于显微注射的电极</td></tr><tr><td>PV820 气动PicoPump </td><td>工具</td><td>世界精密仪器公司</td><td>SYS-PV820</td><td>显微注射工作站的一部分</td></tr><tr><td>显微镜&amp;#8211;电极夹 holder</td><td>工具</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH6S</td><td>用于固定显微操作器械&amp;#8211;电极 </td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>工具</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-85</td><td>用于定位微操作器&amp;#8211;三轴中的电极</td></tr></tbody></table>

sf9细胞和aplysia感觉神经元中pkc转位的活体成像

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

蛋白激酶C（PKCs）是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，在调控多种细胞过程（如细胞生长、学习与记忆）中发挥核心作用。在脊椎动物中已知存在四个PKC亚型家族：经典型PKC（α、βI、βII和γ）、新型I型PKC（ε和η）、新型II型PKC（δ和θ）以及非典型PKC（ζ和ι）。经典型PKC由Ca²⁺2+ 以及二酰基甘油（DAG），而新型PKC由DAG激活，但不依赖Ca2+-非依赖性。非典型PKCs不被Ca2+ 也不涉及DAG。在 Aplysia californica在我们用于研究记忆形成的模型系统中，神经系统特异性的蛋白激酶C（PKC）同工型共有三种，分别属于三个主要类别：即经典型PKC Apl I、新型I型PKC Apl II和非典型PKC Apl III。PKC是一类脂质激活的激酶，因此经典型和新型PKC在响应胞外信号时的活化通常伴随着其从细胞质向质膜的转位。因此，在活细胞中实时观察PKC的转位已成为阐明导致PKC活化的信号转导通路的不可或缺的工具。例如，该技术使我们得以证实，不同PKC同工型在不同条件下发生转位，从而介导不同类型的突触可塑性；并且5-羟色胺（5HT）对PKC Apl II的激活需要二酰甘油（DAG）和磷脂酸（PA）的共同生成才能实现转位。 1-2重要的是，能够反复观察同一个神经元使我们得以极其精细地测量PKC反应的脱敏过程 3在本视频中，我们演示制备Sf9细胞培养物的每一步操作，以及培养物的 Aplysia 感觉神经元已在另一篇视频文章中被描述 4，在Sf9细胞中表达荧光标记的PKCs以及在 Aplysia 感觉神经元及利用激光扫描显微镜对不同激活剂诱导的PKC转位进行活体成像。

在本视频中，我们展示了利用荧光标记的蛋白激酶C（PKC）在活细胞中可视化PKC转位的过程。

Sf9细胞和Aplysia感觉神经元中PKC转位的活体成像

蛋白激酶C（PKCs）是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，在调控多种细胞过程（如细胞生长等）中发挥核心作用。

本实验的目的是在活细胞中观察荧光标记的PKC转位。首先需要制备SF九细胞培养物或从加州拟蝎（Plegia California）中分离的感觉神经元培养物。第二步是在细胞中表达荧光标记的PKC。最后一步是使用激光扫描显微镜对不同激活剂诱导的PKC转位进行成像。最终，通过在活细胞中实时成像PKC转位，可以获得结果，显示不同的第二信使（如二酰甘油）对不同PKC亚型的差异性调控。大家好，我叫Carol Ferra。我是蒙特利尔神经科学研究所Wayne Sawn博士实验室的研究助理。今天我将演示在Aplysia感觉神经元中对PKC转位进行活体成像的技术。该方法有助于回答突触可塑性领域中的关键问题，例如在记忆形成过程中不同的PKC异构体是如何被激活的。在组织培养超净台中，向一个75平方厘米的细胞培养瓶中加入8毫升含30%胎牛血清的Grace昆虫细胞培养基。随后，在37摄氏度水浴中快速解冻冻存的SF九细胞管，通过来回移动试管约1至2分钟完成解冻。接下来，将SF九细胞转移至细胞培养瓶中，并用手轻轻晃动培养瓶，使细胞均匀分布。将细胞在27摄氏度条件下孵育1至2小时，直至细胞贴壁。然后从培养瓶中移除旧的培养基，并更换为另外 10 毫升含 30% 胎牛血清（FBS）的新鲜 Grace 昆虫培养基，在 27 摄氏度下培养细胞直至细胞达到汇合状态。为了维持单层培养，从汇合的 SF9 细胞培养瓶中移除旧培养基，加入 5 毫升含 10% FBS 的 Grace 昆虫培养基，轻轻敲击培养瓶壁数次以使 SF9 细胞脱落。然后使用 10 毫升移液器轻柔地将培养基上下吹打。用移液管沿瓶壁加入少量培养基后，将细胞转移至无菌的15毫升聚苯乙烯管中。在新的75平方厘米细胞培养瓶中，加入2毫升SF9细胞悬液至8毫升含10%胎牛血清（FBS）的Grace昆虫培养基中，稀释比例为1:5。为维持对数生长期，用手轻轻摇动培养瓶。接着，将细胞再次于27摄氏度孵育，直至细胞达到汇合状态。孵育完成后，SF9细胞即可用于表达荧光标记的PKC，具体操作如书面实验步骤所述。在表达荧光标记的PKC之前，按先前所述方法，在MatTek玻璃底培养皿中制备脊髓神经元细胞培养物。感觉神经元分离后的两天，使用注射器和带有0.2微米孔径的20毫米注射器滤器过滤预先配制的快绿溶液。将编码E-G-F-P-P KC API 2的质粒DNA溶解于含有0.5%快绿的蒸馏水中，终浓度不超过0.4微克/微升。使用1毫升注射器和孔径为0.2微米的4毫米注射器滤器过滤质粒DNA与快绿的混合溶液。然后将过滤后的质粒DNA快绿溶液在微型离心机中以16,110 ×g离心15分钟。接下来，使用微电极拉制仪制备用于神经元显微注射的尖锐电极。采用带有内丝的薄壁玻璃毛细管拉制玻璃微电极。每根电极中加入 2 µL 质粒 DNA 快绿溶液。 使用微量移液器吸头，在显微注射工作站上进行显微注射。该显微注射工作站包括一个自制的大型玻璃载台，用于将培养皿固定在隔振台上；另配备带有外部卤素光源的体视显微镜、显微操作仪以及连接至气动泵的微电极夹持器。将气动泵的压力输入端连接至压缩氮气罐。将含有plegia神经元培养物的Matech玻璃底培养皿转移至显微注射工作站，并将微电极插入微电极夹持器中。在体视显微镜下观察神经元，并将微移液管的尖端插入细胞核内。以20 psi的氮气压力，施加持续时间为10至100毫秒的短暂脉冲，直至细胞核呈现均匀的绿色。室温下孵育细胞4小时，随后置于4摄氏度保存，直至使用。采用配备Axio Avert 200物镜的Zeiss LSM 510倒置共聚焦显微镜对SF9细胞和果蝇感觉神经元进行成像。本视频展示了麻痹感觉神经元的成像过程。SF九细胞成像的详细步骤可参见书面实验方案。使用输出功率为30毫瓦的氩离子激光器，以50%的激光输出强度对EGFP标记的PKC进行成像。接下来，将阿贡激光线衰减至4%透射输出。然后将针孔调整为一，将培养皿稳定在成像台上，并避免移动或振动。使用10毫升移液器轻轻从培养皿中移除1毫升培养基，最终保留1毫升总体积。在培养皿中，找到细胞的中部区域，此处可见细胞核。以30秒为时间间隔，采集10到20组共聚焦图像的时间序列。开始播放视频，第二张图像拍摄后，通过轻轻加入一毫升两倍浓度的药物来诱导转位。将药物以滴加方式持续加在细胞上方，约30秒。此处使用5-羟色胺（serotonin）诱导快速转位，药物处理后可立即观察到转位现象。某些药物可诱导缓慢的转位过程，其最佳观察时间仅在给药后5到10分钟。用两支10毫升移液管洗去药物：在一侧轻轻将洗涤缓冲液沿培养皿壁加入，同时在另一侧吸出培养基。如果洗涤有效且药物作用可逆，PKC将在30至60秒内重新回到细胞质中。将视频保存为LSM文件格式，如图所示。以下是脊髓损伤后感觉神经元中PKC转位的活体成像代表性结果。在感觉神经元中表达了E-G-F-P-P KC APL2，并以每30秒一次的时间间隔连续记录了10幅共聚焦图像。在此示例中，在记录30秒后向培养皿中添加了5-羟色胺。在此示例中，展示了SF九细胞中PKC转位的活体成像。E-G-F-P-P KC APL1和M-R-F-P-P KC APL2在SF九细胞中共同表达，并以30秒的时间间隔连续记录了10幅共聚焦图像。1,2-二油酰基-sn-甘油。在记录 30 秒后，向培养皿中加入了一种可渗透细胞的 DYL 甘油类似物。观看本视频后，您应能充分理解如何在无脊髓综合征感觉神经元中表达荧光标记的 PKC，以及如何对活细胞中的 PKC 转位进行成像。

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在此，我们演示如何将原代海马神经元的转染与活细胞共聚焦成像相结合，以分析病理蛋白诱导的轴突运输变化，并鉴定介导这些效应的分子机制通路。...

利用活细胞成像技术测定病理性蛋白对原代海马神经元轴突运输的影响

学习使用激光扫描显微镜对Sf9细胞和海兔感觉神经元中的PKC移位进行实时成像的方法。该技术通过荧光标记揭示蛋白激酶C的动态调控机制，为研究细胞信号转导提供重要工具。

Sf9细胞和Aplysia感觉神经元中PKC转位的活体成像

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