Name: 鼠标膀胱壁注射液 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 48 s
Description: 学习小鼠膀胱壁显微注射技术，通过腹部切口和壁内针尖插入实现细胞精准定位植入。该方法可形成稳定局部隆起，为膀胱干细胞与癌症生物学研究提供可靠实验手段。

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我们衷心感谢斯坦福儿科研究基金的试点项目资助以及美国国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所（NIDDK）提供的K08DK087895-01基金支持。

1. 小鼠膀胱壁注射
小鼠品系、年龄和性别的选择取决于实验需求。我们使用8至12周龄的小鼠，因为此阶段处于免疫系统成熟且尚未衰老的时间窗口。一般建议小鼠至少在实验操作前一周到达，以避免应激反应带来的混杂因素。
<ol>
<li>用肥皂和水清洁手术台表面。</li>
<li>使用Cide Swipes或消毒湿巾擦拭手术台表面。</li>
<li>在手术使用前，将清洁的手术器械进行高压灭菌。</li>
<li>此外，在每次使用前以及在不同动物之间手术时，使用热珠灭菌器对手术器械进行即时灭菌。</li>
<li>在首次使用前以及在最后一次手术操作结束后，通过反复吸取和注入无水乙醇来清洗100 μL Hamilton注射器及29或30号（1/2英寸长）针头。</li>
<li>在每只动物之间，用无菌磷酸盐缓冲液清洗并冲洗Hamilton注射器。</li>
<li>将小鼠置于异氟烷诱导室中进行麻醉，异氟烷浓度设定在2-5%之间。</li>
<li>当达到全身麻醉状态后，将小鼠从诱导室中取出，并置于仰卧位，身下放置加热垫以维持正常体温。</li>
<li>通过将动物鼻部置于含有气化异氟烷的喷嘴中维持麻醉状态（根据需要将浓度调整在1-3%之间，以维持适当麻醉深度）。</li>
<li>使用电动剃毛器剃除腹部皮肤毛发。</li>
<li>使用一次性无菌手术巾覆盖肛门区域，以防止手术过程中粪便污染。</li>
<li>使用第二块一次性无菌手术巾覆盖手术区域（下腹部）。</li>
<li>用三块浸有碘伏的纱布对腹部进行消毒，重复此步骤三次。</li>
<li>在解剖显微镜下放大视野，使用剪刀做下腹正中切口。</li>
<li>暴露膀胱。</li>
<li>如果膀胱充盈，可通过轻柔向下按压膀胱顶部使其部分减压。</li>
<li>使用29或30号针头和注射器，将样本溶液（最多50 μL）注入膀胱顶部壁内（壁内注射），针尖斜面朝上。</li>
<li>推动注射器活塞，将样本溶液注入膀胱壁。局部形成的隆起小泡（bleb）表明细胞已成功注入膀胱壁。</li>
<li>拔出注射器，用伤口夹关闭切口，并将小鼠置于加热垫上恢复。</li>
</ol>
2. 代表性结果：
形态局限、无液体渗漏且体积稳定的隆起提示细胞已成功注入膀胱壁（图1）。可通过组织学分析确认注射的细胞是否存在于膀胱壁中。
<img src="/files/ftp_upload/2523/2523fig1.jpg" alt="动物解剖；注射器应用；解剖学研究；研究方法；教学实验。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 使用印度墨水示意膀胱壁成功注射的示例。
<img src="/files/ftp_upload/2523/2523fig2.jpg" alt="小鼠膀胱壁注射过程示意图；正中腹切开术、注射器、细胞溶液操作步骤。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 实验操作流程示意图。

<ol><li>Dinney, C. P., Fishbeck, R., Singh, R. K., Eve, B., Pathak, S., Brown, N., Xie, B., Fan, D., Bucana, C., Fidler, I. J., Killion, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Metastatic+Variants+from+Human+Transitional+Cell+Carcinoma+Passaged+by+Orthotopic+Implantation+in+Athymic+Nude+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Metastatic Variants from Human Transitional Cell Carcinoma Passaged by Orthotopic Implantation in Athymic Nude Mice.</a> The Journal of Urology. 154, 1532-1538 (1995).</li>
<li>Singh, A. V., Franke, A. A., Blackburn, G. L., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soy+Phytochemicals+Prevent+Orthotopic+Growth+and+Metastasis+of+Bladder+Cancer+in+Mice+by+Alterations+of+Cancer+Cell+Proliferation+and+Apoptosis+and+Tumor+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Soy Phytochemicals Prevent Orthotopic Growth and Metastasis of Bladder Cancer in Mice by Alterations of Cancer Cell Proliferation and Apoptosis and Tumor Angiogenesis.</a> Cancer Res. 66, 1851-1858 (2006).</li>
<li>Yanagiuchi, A., Miyake, H., Nomi, M., Takenaka, A., Fujisawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+Microenvironment+by+Growth+Factors+Regulates+the+In+Vivo+Growth+of+Skeletal+Myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+International%22%5BJournal%5D)">Modulation of the Microenvironment by Growth Factors Regulates the In Vivo Growth of Skeletal Myoblasts.</a> BJU International. 103, 1569-1573 (2009).</li>
<li>Miyake, H., Hara, I., Yamanaka, K., Gohji, K., Arakawa, S., Kamidono, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Bcl-2+Enhances+Metastatic+Potential+of+Human+Bladder+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Bcl-2 Enhances Metastatic Potential of Human Bladder Cancer Cells.</a> British Journal of Cancer. 79, 1651-1656 (1999).</li>
<li>Chancellor, M. B., Yokoyama, T., Tirney, S., Mattes, C. E., Ozawa, H., Yoshimura, N., Groat, W. C. de, Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+Results+of+Myoblast+Injection+into+the+Urethra+and+Bladder+Wall%3A+a+Possible+method+for+the+Treatment+of+Stress+Urinary+Incontinence+and+Impaired+Detrusor+Contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Neurourol+Urodyn%22%5BJournal%5D)">Preliminary Results of Myoblast Injection into the Urethra and Bladder Wall: a Possible method for the Treatment of Stress Urinary Incontinence and Impaired Detrusor Contractility.</a> Neurourol Urodyn. 19, 279-287 (2000).</li>
<li>Dinney, C. P., Tanguay, S., Bucana, C. D., Eve, B. Y., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravesical+Liposomal+Muramyl+Tripeptide+Phosphatidylethanolamine+Treatment+of+Human+Bladder+Carcinoma+Growing+in+Nude+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Intravesical Liposomal Muramyl Tripeptide Phosphatidylethanolamine Treatment of Human Bladder Carcinoma Growing in Nude Mice.</a> J Interferon Cytokine Res. 15, 585-592 (1995).</li>
<li>Mohamedali, K. A., Kedary, D., Sweeney, P., Kamaty, A., Davisy, D. W., Evey, B. Y., Huangy, S., Thorpez, P. E., Dinney, C. P., Rosenblum, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vascular-targeting+Fusion+toxin+VEGF121%2FrGel+Inhibits+the+Growth+of+Orthotopic+Human+Bladder+Carcinoma+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">The Vascular-targeting Fusion toxin VEGF121/rGel Inhibits the Growth of Orthotopic Human Bladder Carcinoma Tumors.</a> Neoplasia. 7, 912-920 (2005).</li>
<li>Slaton, J. W., Perrotte, P., Inoue, K., Dinney, C. P., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-%CE%B1-mediated+Down-Regulation+of+Angiogenesis-related+Genes+and+Therapy+of+Bladder+Cancer+Are+Dependent+on+Optimization+of+Biological+Dose+and+Schedule%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Interferon-α-mediated Down-Regulation of Angiogenesis-related Genes and Therapy of Bladder Cancer Are Dependent on Optimization of Biological Dose and Schedule.</a> Clinical Cancer Research. 5, 2726-2734 (1999).</li>
<li>Yokoyama, T., Huard, J., Pruchnic, R., Yoshimura, N., Qu, Z., Cao, B., De Groat, W. C., Kumon, H., Chancellor, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-Derived+Cell+Transplantation+and+Differentiation+into+Lower+Urinary+Tract+Smooth+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Muscle-Derived Cell Transplantation and Differentiation into Lower Urinary Tract Smooth Muscle.</a> Urology. 57, 826-831 (2001).</li>
<li>Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Orthotopic+Models+for+Bladder+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+International%22%5BJournal%5D)">Mouse Orthotopic Models for Bladder Cancer Research.</a> BJU International. 104, 1286-1291 (1988).</li>
<li>Russell, P. J., Jelbart, M., Wills, E., Singh, S., Wass, J., Witherspoon, J., Raghavan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+new+human+bladder+cancer+cell+line+showing+features+of+squamous+and+glandular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a new human bladder cancer cell line showing features of squamous and glandular differentiation.</a> Int. J. Cancer. 41, 74-74 (1988).</li>
<li>Ahlering, T. E., Dubeau, L., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vivo+model+to+study+invasion+and+metastasis+of+human+bladder+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A new in vivo model to study invasion and metastasis of human bladder carcinoma.</a> Cancer Res. 41, 6660-6660 (1987).</li>
<li>Heaney, J. A., Omellas, E. P., Daly, J. J., Lin, J. C., Rout, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+growth+of+human+bladder+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Urol%22%5BJournal%5D)">In vivo growth of human bladder cancer cell lines.</a> Invest. Urol. 15, 380-380 (1978).</li>
<li>Hadaschik, B., Black, P., Sea, J., Metwalli, A., Fazli, L., Dinney, C., Gleave, M., So, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+validated+mouse+model+for+orthotopic+bladder+cancer+using+transurethral+tumor+inoculation+and+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+International%22%5BJournal%5D)">A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumor inoculation and bioluminescence imaging.</a> BJU International. 100, 1377-1384 (2007).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

小鼠膀胱壁注射技术可将特定细胞植入膀胱壁的特定区域。该技术在膀胱癌、平滑肌及干细胞生物学的小鼠模型研究中具有广泛应用。根据定义，小鼠膀胱壁注射可将膀胱癌细胞或干细胞导入原位环境，从而在生理相关的解剖背景下研究其生长与分化过程。事实上，Dinney 等人首次描述了该技术，用于在裸鼠中研究原位人膀胱癌异种移植模型1。
尽管膀胱壁注射技术已在多项膀胱癌和干细胞研究中得到应用 1-9，但它并非唯一使用的方法。许多科学家曾尝试通过皮下、腹腔或静脉注射的方式将膀胱癌细胞植入裸鼠体内，但这些模型并未表现出可预测的成瘤性和转移特性，因而无法实现有效筛选 体内 细胞系11-13此外，还有一些膀胱癌模型依赖于通过尿道接种肿瘤细胞至小鼠体内 14膀胱癌发生的一个主流理论认为，肿瘤的扩散是通过来自尿路其他部位的癌细胞脱落进入尿流，进而“播种”到正常的尿路上皮所致。从这一角度来看，经尿道接种使膀胱腔侧的尿路上皮暴露于癌细胞，可能比膀胱壁注射更具生理相关性。然而，经尿道接种无法控制细胞在膀胱内的具体定植位...

<table><tbody><tr><td>异氟烷（Aerrane）</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>NDC 10019-773-60</td><td></td></tr><tr><td>29 或 30 号针头</td><td>Hamilton Co</td><td>7803-06 或 7803-07</td><td></td></tr><tr><td>100 微升注射器</td><td>Hamilton Co</td><td>7656-01</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠膀胱壁注射

Mouse Bladder Wall Injection

小鼠膀胱壁注射是一种用于原位研究膀胱相关现象的有用技术，包括干细胞、平滑肌以及癌症生物学的研究。在开始注射前，需用肥皂水和消毒液清洁手术区域。手术器械在使用前以及每只动物之间均须灭菌。每只小鼠通过吸入异氟烷进行麻醉（诱导浓度为2-5%，维持浓度为1-3%），然后用剪刀做腹部正中切口以暴露膀胱。若膀胱充盈，可用两指轻轻挤压使其部分减压。将目标细胞悬液使用29或30号针头及1 mL或更小的注射器，直接注射至膀胱顶部的膀胱壁内。随后使用伤口夹关闭切口，并将小鼠置于加热垫上恢复。膀胱壁注射是一种精细的显微外科技术，通过练习可熟练掌握。

小鼠膀胱壁注射是一种用于原位研究膀胱干细胞和癌症生物学的有效方法。这种精细的显微外科技术通过严谨的操作和反复练习即可掌握。

小鼠膀胱壁注射是一种用于原位研究膀胱相关现象的有用技术，包括干细胞、平滑肌以及癌症生物学研究。

本操作的总体目标是将细胞导入膀胱壁的特定区域。首先通过腹部切口暴露膀胱，以实现这一目标。操作的下一步是将针头斜面插入膀胱壁内。该操作的最后一步是推动注射器的活塞，将目标细胞注入膀胱壁。成功的细胞植入表现为形成一个界限清晰的隆起（bleb），无液体渗漏且体积保持稳定。与现有的方法（如经尿道接种细胞至小鼠体内）相比，该技术的主要优势在于能够精确控制细胞在膀胱内的植入位置。直观展示利肌（li muscle）至关重要，因为注射操作难以掌握。掌握针头进入膀胱的正确角度和进针位置，是该技术成功的关键。根据实验需求选择小鼠的年龄、性别和品系。使用8至12周龄的小鼠进行实验。首先用肥皂和水清洁手术台表面，随后使用侧拭布或消毒湿巾擦拭手术台表面。手术器械应在手术前通过高压灭菌器进行灭菌。使用前用70%乙醇擦拭器械，并在每次手术之间用高温珠灭菌器重新灭菌。通过反复吸取无水乙醇，随后吸取灭菌的磷酸盐缓冲液，清洗连接30号针头的100微升Hamilton注射器。将麻醉后的动物仰卧置于保温垫上，以帮助维持正常体温。通过将动物的鼻部置于含有气化异氟烷的喷嘴中，以维持足够的麻醉深度。接着，使用剪毛器去除腹部皮肤上的毛发。手术过程中，使用一次性无菌手术巾覆盖肛门，以防止粪便污染。在下腹部覆盖第二块手术巾，并暴露手术视野。使用解剖显微镜放大，反复用碘伏和酒精对手术部位进行消毒。用剪刀做下腹部正中切口。轻轻按压腹部以暴露膀胱。由于膀胱通常部分或完全充盈，对腹部施加压力会优先推开其他器官，使膀胱从切口处显露出来。如果膀胱充盈，可在其顶部施加轻柔的向下压力，以部分减压。用无菌汉密尔顿注射器吸取50微升样品溶液。将针头斜面朝上插入膀胱壁，并注入样品溶液。成功的注射表现为形成一个界限清晰的隆起水疱，无液体渗漏且体积保持稳定。注射后用伤口夹闭合切口。将动物放在加热垫上使其恢复。此技术若操作得当，可在10至15分钟内完成。可通过注射后不同时间点的膀胱组织学分析来确认实验是否成功。

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医学

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