Name: 鸡脑干切片的制备及文化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: 学习制备鸡听觉脑干切片用于体外电生理记录和长期器官型培养的方法。该技术可保存神经环路完整性，帮助研究神经元发育与听觉功能机制。

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Rubel 实验室现任及前任成员。

1. 解剖区域的准备
<ol>
<li>用 95% O2 / 5% CO2 混合气体持续通入人工脑脊液（ACSF）中（pH 值为 7.2–7.4，渗透压为 295–310 mOsm/L）。</li>
<li>在 ACSF 通气的同时，使用 70% 乙醇清洁工作区域。同时清洁振动切片机和切片刀片，并用蒸馏水（dH2O）冲洗刀片。</li>
<li>在解剖区域放置洁净的吸液垫，并配备适当的解剖工具。</li>
<li>将琼脂块（40 mg 琼脂糖 / mL，即 dH2O 中含 4% 琼脂糖）粘附至振动切片机切片室的平台上*。 
*提示：在解剖前预先制备琼脂。将预先制备好的琼脂置于加盖的培养皿中，存放于冰箱内。琼脂糖购自 EMD Chemicals 或 Invitrogen。</li>
</ol>
2. 准备含培养基的6孔板
<ol>
<li>在无菌操作台内，向6孔板的每个孔中加入1 mL培养基，每个孔对应一只动物，于35°C、5% CO2条件下孵育。</li>
<li>根据需要准备相应数量的培养膜插件，并将其放置于操作台内备用。</li>
</ol>
3. 鸡听觉脑干的分离
<ol>
<li>将鸡蛋置于明亮的光源下，以确定无胚胎的气室区域（通常位于鸡蛋较大的一端）。</li>
<li>打破鸡蛋较大的一端，暴露膜囊；用解剖刀在膜囊上切开，轻柔取出鸡胚胎的头部。</li>
<li>用剪刀迅速将头部离断。</li>
<li>将剃刀刀尖置于两眼稍后方的中线位置，沿头尾方向对颅骨进行中线切开，仅施加轻微压力*。 
*提示：施加的压力取决于胚胎的发育年龄（即：越年轻胚胎所需压力越小，越年长则需越大）。</li>
<li>轻柔拨开皮肤和羽毛，暴露颅骨，并确认中线切口位置准确。</li>
<li>用剃刀片横向切断颅骨的前部；将刀片置于眼睛后方，快速切穿整个颅骨及脑组织*。 
*提示：需施加较大力度以完全移除颅骨前段。</li>
<li>在颅骨后部、头部两侧可见颈部肌肉稍前方的位置，使用小剪刀从中线向侧方做切口；剥离颅骨及周围组织，暴露小脑与脑组织。</li>
<li>用小剪刀剪断脑干周围连接的组织，轻柔地将其从颅底分离；当所有连接组织均被切断后，脑干应可自由脱离颅骨*。 
*提示：必要时可将颅骨翻转（脑组织朝下），以便切断残留的附着组织。</li>
</ol>
4. 脑干切片的制备
<ol>
<li>从颅骨取出后，通过视顶盖将脑干向下固定。</li>
<li>用小剪刀轻轻剪断小脑脚，完全移除小脑，暴露第四脑室的底部。</li>
<li>用镊子去除脑干表面的膜组织和血管，然后通过视顶盖进行侧向切割以分离脑干。</li>
<li>在琼脂块前方（朝向振动切片机刀片的一侧）的振动切片机载物台上放置少量瞬间胶。</li>
<li>使用镊子轻柔而迅速地提起脊髓处的脑干，将组织头端朝下、背侧朝向振动切片机刀片的方向置于超级胶上*。 
*提示：下一步操作前，应使用无尘纸或滤纸吸去多余胶水。</li>
<li>轻轻将充氧的ACSF倒入振动切片机的载物台*。 
*注意：此ACSF可持续用O₂气泡饱和2/CO2然而，在如此小体积的溶液中对ACSF进行通气会导致脑干切片发生不希望的移动（甚至可能造成损伤）。如果操作迅速，使用解剖过程中已氧合的ACSF已足够。</li>
<li>振动切片机刀片应呈 20-22° 角度。启动振动切片机（振荡幅度应调至最大），并向上移动载物台靠近刀片，使组织顶部与刀片平行后再进行切片。</li>
<li>快速将刀片移向脑干组织。在刀片即将接触组织前显著放慢速度。</li>
<li>以尽可能慢的速度开始切片组织。完成整个冠状面组织的切片后，用毛刷或断裂的玻璃棒、一端装有橡胶吸头的烧制抛光移液管，轻柔地将切片从刀片上移开。</li>
<li>300-下层阶段500 μm 步骤，并再次切片。重复此过程，直至脑干组织中可见解剖学特征。此时，对包含听觉结构的脑干组织进行切片，厚度为200-1000 μm 厚度，取决于组织的年龄和实验需求。</li>
<li>仔细保持可用切片的切片顺序，即第1个st 切片代表该通路最尾侧的区域（低频声音处理），而最后一个切片代表最头侧的部分（高频声音处理）*。 
*注意：关于切片在培养中放置位置的内容，请参见第6节。 体外 生理学储存，参见下一节。</li>
</ol>
5. 切片保存用于 体外 生理学
<ol>
<li>根据鸡胚的发育年龄和切片厚度，每只动物可提供 1 至 6 片切片。</li>
<li>使用一端连接橡胶球的火焰抛光玻璃移液管，将单个切片轻柔地放入孵育 chamber 中。chamber 应编号。每个孔中仅放置一片切片，以保持一定的拓扑特异性（例如，最尾侧的切片放入第 1 个 chamber，最头侧的切片放入最后一个 chamber）。chamber 中应充满人工脑脊液（ACSF），并持续通入 95% O2 / 5% CO2 混合气体（pH 7.4，渗透压 295–310 mOsm/l）。</li>
<li>将 chamber 置于 36°C 温水浴中，使切片平衡约 1 小时。</li>
<li>将 chamber 从温水浴中取出，在室温下静置约半小时。</li>
<li>室温静置约半小时后，可将切片从孵育 chamber 转移至安装在显微镜上的约 0.5 mL 记录 chamber，用于电生理实验。</li>
<li>切片在从温水浴中取出后最多可使用约 6 小时。</li>
</ol>
6. 器官型脑片培养的制备 8
<ol>
<li>切片操作完成后（参见第6节），立即使用一端连接橡胶球的火焰抛光玻璃移液管，吸取约500 μL ACSF将切片转移至置于冰上的48孔板中，每孔放置一片切片*。 
*提示：切片厚度需至少为300 μm，最多可达1000 μm。</li>
<li>收集完所有切片后，将48孔板转移至超净台中。</li>
<li>从培养箱中取出含有培养基的6孔板，并将其转移至超净台中。</li>
<li>在将单个脑组织的切片放置到膜上之前，先将一个已准备好的膜插件（参见第2.2节）放入含有培养基的孔中。确保膜下方无气泡存在。</li>
<li>使用玻璃移液管将一片切片连同少量ACSF液滴滴加至培养膜上，并用移液器吸除多余的ACSF。对剩余切片重复此操作（每个膜上最多放置4片切片）*。 
*提示：确保切片之间互不接触，并将切片置于膜中央位置，避免接触膜边缘。</li>
<li>根据所需数量重复上述操作*。 
*提示：若后续需对培养物进行操作，建议每个6孔板中最多只使用3个膜插件，以减少培养物离开培养箱的时间。</li>
<li>每周在超净台中更换培养基三次：用带有无菌吸头的真空管吸取旧培养基，同时用镊子将膜插件从孔中取出；在膜插件仍处于孔外时，向孔中加入1 mL新鲜培养基。待所有孔的培养基更换完毕后，将培养板放回培养箱中。</li>
</ol>
7. 代表性结果：

<img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig1.jpg" alt="神经回路示意图及用于研究突触连接的实验脑切片图像" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 鸡听觉脑干的双耳神经回路。 (A) 冠状切面示意图以及 (B-F) 体外 鸡听觉脑干的切片图像。(A) 图示听觉神经（AN）向脑干内的大细胞核（NM）和角状核（NA）发出的传入性兴奋性输入。NM 向脑干双侧的层状核（NL）发出双侧兴奋性投射。上橄榄核（SON）向 NA、NM 和 NL 发出抑制性输入。 体外 (B-F) 中的切片为连续图像200 μm 从尾侧（B）到头侧（F）的鸡听觉脑干切片，分别代表从低频到高频区域。该神经回路负责编码用于声音定位的声音时间特性。（B）中的比例尺 = 500 μm 并适用于 (C-F) 中的图像。(D) 中的箭头指向 NL 的单层细胞体。

<img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig2.jpg" alt="膜片钳技术；电生理学比较；电压迹线图；50 mV/50 ms 比例尺。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 培养的神经元发育出正常的生理反应特性。 对急性分离组织（A&amp;C）以及培养 4 天（B）和 7 天（D）的组织记录的膜电压变化叠加图，这些变化由超极化和去极化电流脉冲诱导产生。注意在脑片培养方法中，超极化电压的“下垂”现象、外向电流的显著减弱以及单个动作电位的发放特性，均与年龄匹配的急性组织相似地逐步发育形成。电流刺激持续时间为 200 ms，步阶幅度为 50–100 pA。静息膜电位（RMP）介于 -55 至 -60 mV 之间。

<img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig3.jpg" alt="神经网络荧光图像；神经元示意图；脑区研究；显微成像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 培养切片中的解剖结构。 鸡胚E11期听觉脑干左侧在体外培养7天后的微分干涉差显微图像（DIC）。使用针对微管相关蛋白2（MAP2）的抗体进行标记，该蛋白存在于胞体和树突中，呈绿色荧光。通过电穿孔导入Alexa荧光葡聚糖染料，将巨细胞核（NM）神经元簇及其轴突标记为红色。NM和NL细胞群均可见。同侧NM的轴突末梢投射至背侧NL树突（白色箭头）。

<ol><li>Howard, M. A., Burger, R. M., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+switch+to+GABAergic+inhibition+dependent+on+increases+in+Kv1-type+K%2B+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A developmental switch to GABAergic inhibition dependent on increases in Kv1-type K+ currents.</a> J Neurosci. 27, 2112-2123 (2007).</li>
<li>Kuba, H., Koyano, K., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+membrane+conductance+improves+coincidence+detection+in+the+nucleus+laminaris+of+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Development of membrane conductance improves coincidence detection in the nucleus laminaris of the chicken.</a> J Physiol. 540, 529-542 (2002).</li>
<li>Gao, H., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+of+intrinsic+and+synaptic+properties+of+chicken+nucleus+laminaris+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Early development of intrinsic and synaptic properties of chicken nucleus laminaris neurons.</a> Neuroscience. 153, 131-143 (2008).</li>
<li>Sanchez, J. T., Wang, Y., Rubel, E. W., Barria, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+glutamatergic+synaptic+transmission+in+binaural+auditory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Development of glutamatergic synaptic transmission in binaural auditory neurons.</a> J Neurophysiol. 104, 1774-1789 (2010).</li>
<li>Jackson, H., Hackett, J. T., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+in+the+chick%3A+ontogeny+of+postsynaptic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Organization and development of brain stem auditory nuclei in the chick: ontogeny of postsynaptic responses.</a> J Comp Neurol. 210, 80-86 (1982).</li>
<li>Rubel, E. W., Parks, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken%3A+tonotopic+organization+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 164, 411-433 (1975).</li>
<li>Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken%3A+ontogeny+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 166, 469-489 (1976).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Reyes, A. D., Rubel, E. W., Spain, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+properties+underlying+the+firing+of+neurons+in+the+avian+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Membrane properties underlying the firing of neurons in the avian cochlear nucleus.</a> J Neurosci. 14, 5352-5364 (1994).</li>
<li>Monsivais, P., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accommodation+enhances+depolarizing+inhibition+in+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Accommodation enhances depolarizing inhibition in central neurons.</a> J Neurosci. 21, 7823-7830 (2001).</li>
<li>Lu, T., Trussell, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+elimination+of+endbulb+synapses+in+the+chick+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development and elimination of endbulb synapses in the chick cochlear nucleus.</a> J Neurosci. 27, 808-8017 (2007).</li>
<li>Kuba, H., Yamada, R., Fukui, I., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonotopic+specialization+of+auditory+coincidence+detection+in+nucleus+laminaris+of+the+chick%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tonotopic specialization of auditory coincidence detection in nucleus laminaris of the chick.</a> J Neurosci. 25, 1924-1934 (2005).</li>
<li>Trussell, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+for+preservation+of+timing+in+central+auditory+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms for preservation of timing in central auditory pathways.</a> Curr Opin Neurobiol. 7, 487-492 (1997).</li>
<li>Trussell, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+mechanisms+for+coding+timing+in+auditory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic mechanisms for coding timing in auditory neurons.</a> Annu Rev Physiol. 61, 477-496 (1999).</li>
<li>Sorensen, S. A., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+level+and+integrity+of+synaptic+input+regulates+dendrite+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The level and integrity of synaptic input regulates dendrite structure.</a> J Neurosci. 26, 1539-1550 (2006).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

几十年来，鸡脑干急性切片制备一直被用于研究听觉信息处理 9, 10这种方法已提供了大量的 体外 来自发育期和成熟期的双耳听觉处理生理学数据 4, 11, 12人们对这一高度特化的神经环路以及各个核团在声音时间信息处理中的作用已有深入了解。 13, 14事实上，对该结构和功能均已明确的神经环路进行短期实验性操控，已被证明具有显著优势 15然而，从长期发育的角度来看，此类操作并不可行，因此有必要开发能够解决这一问题的技术。本文提出了一种新颖的技术，为研究此类问题提供了可能。最终，器官型脑片培养技术有望在特定且较长的发育阶段内，对突触活动、内在通道调控、突触后受体反应以及差异基因表达进行干预。该方法将进一步拓展对鸡听觉环路的已有丰富认知，并有助于科学家更深入地理解神经生物学发育中的基本问题。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;鸡脑脊液（Chicken ACSF）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>M-11624</td><td>130 mM</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>M-10576</td><td>26 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-9333</td><td>3 mM</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8282</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7528</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>Acros Organics</td><td>423525000</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;鸡细胞培养基（4&amp;#x00B0;C保存）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高级最低必需培养基（含NEAA、110 mg/L丙酮酸钠，不含L-谷氨酸）</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12492-013</td><td>48.00%</td></tr><tr><td>Earl&amp;rsquo;s平衡盐溶液</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-2888</td><td>24.00%</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7513</td><td>1.00%</td></tr><tr><td>葡萄糖溶液（200 g/L，无菌过滤）</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7528</td><td>2.75%</td></tr><tr><td>马血清（热灭活，无菌过滤）</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1138</td><td>24.00%</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素*</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-0781</td><td>1.00 ml&lt;br/&gt;* = 如需防止污染，每100 ml培养基中加入1 ml</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;专用设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell-CM细胞培养小室</td><td>PICMORG50</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>6 Well Cell Culture Cluster</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Forma Scientific CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 水套式培养箱</td><td>Forma Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

鸡听觉脑干切片的制备与培养

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

鸡的听觉脑干是一个成熟的模型系统，已被广泛用于研究发育特定阶段的听觉处理解剖学和生理学1-4，以及中枢神经系统中时间编码的机制5-7。
本文介绍了一种制备鸡听觉脑干切片的方法，该切片可用于急性实验操作，或用于培养器官型切片以进行长期的实验干预。
鸡的听觉脑干由角状核、巨细胞核、层状核和上橄榄核组成。这些核团负责双耳声音处理，而单个冠状切片制备物可完整保留整个神经环路。最终，器官型脑片培养技术可为操控多个发育参数提供机会，例如突触活动、突触前和突触后组分的表达、控制兴奋性的相关因子表达以及差异基因表达等。
该方法可用于拓展关于神经环路发育、精细化及成熟过程的普遍认知。

鸡的听觉脑干由负责双耳声音处理的核团组成。单个冠状切片制备可保持完整的神经环路，而培养方法则为在分子、细胞和网络水平上研究神经元结构和听觉功能的发育提供了独特的制备手段。

鸡的听觉脑干是一个成熟的模型系统，已被广泛用于研究听觉信息处理的解剖学与生理学特性……

本实验的总体目标是制备可用于体外全细胞电生理记录或长期器官型培养的鸡听觉脑干切片。首先从鸡蛋中取出胚胎，完成这一步骤；随后进行第二步，即从颅骨中解剖出脑组织，并分离出听觉脑干区域。该实验步骤的第三步是在切片振荡器上制备脑干区域的切片。最后一步是将脑干切片置于记录生理信号的孵育 chamber 中，或放置于 Millipore 板上用于培养。最终，可通过生理记录或长期的器官型培养获得结果，显示来自鸡胚的健康听觉脑干切片。您好，我叫 Armand Sidle。这两种方法均可为鸟类听觉发育提供深入见解。此外，由于这种双耳听觉回路具有独特的结构与功能，该方法还可用于研究拓扑外显子再生、树突动态，以及内在和突触特性。通常，初次接触该技术的研究人员会遇到困难。为了获得可用于生理学和培养研究的活性样本，需要迅速完成组织的解剖、切片和保存。首先，通过在每毫升蒸馏水中加入40毫克琼脂，配制4%的琼脂溶液，并在微波炉中加热至沸腾。将热的琼脂溶液倒入培养皿中，冷却至完全凝固。切下一小块琼脂并将其粘附到振动切片台上。接着，准备 500 至 1000 毫升人工脑脊液（A CSF），以备后续使用。在振动切片室中使用，持续通入由95%氧气和5%二氧化碳组成的混合气体，pH范围为7.2至7.4，渗透压为295至310毫渗摩尔每升。当人工脑脊液（ACSF）正在通气时，用70%乙醇清洁解剖至培养区域、振动切片机及刀片。用蒸馏水冲洗振动切片机刀片，并使其自然晾干。在解剖区域放置一张洁净的吸液垫，并摆放适当的解剖工具，通常包括手术刀、剪刀、镊子、剃刀刀片、固定针、培养皿和刮匙。在无菌细胞培养操作台中，为六孔板中的每只鸡胚各填充一个孔。将一毫升培养物和培养基加入培养板中，在35摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育。根据需要准备相应数量的培养膜插件，并将其存放在超净台内以备后续使用。使用时置于解剖垫上。将一枚鸡蛋置于光源下，寻找充满空气且无胚胎的区域，该区域通常位于鸡蛋较大的一端。使用刮刀的平端将鸡蛋较大的一端敲开，露出膜囊。用手术刀或剪刀在膜囊上切开一个小口，然后用刮刀轻轻取出鸡胚胎的头部。使用剪刀快速切除胚胎的头部。将剃刀刀片的尖端置于眼睛中点稍后方，沿中线从头侧向尾侧切开颅骨。对较年轻的胚胎施加轻柔压力。对较老的胚胎减少压力。切口完成后，此时需增加压力。对于较年长的动物，轻轻拨开皮肤和羽毛以暴露颅骨，并确认中线位置。切割时，使用剃刀刀片施加较大力度，在眼睛后方定位刀片，迅速向下切割整个颅骨和脑组织，以阻断颅骨的前部。将已阻断的组织放置于培养皿中，腹面朝上。通过侧肌区域固定组织，并用持续通气的脑脊液完全浸没。使用小剪刀在颅骨尾部区域沿中线向侧方做切口，位置略位于头部两侧可见的颈部肌肉前方。掀开颅骨和组织以暴露小脑和脑组织。暴露脑组织后，定位小脑和脑干，以便将脑组织从颅骨中取出。使用小型剪刀轻轻剪除附着在

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离体 培养鸡小脑切片及颗粒细胞前体的靶向电穿孔

鸟类和哺乳动物的听觉脑干神经元专门负责快速神经编码，这是正常听觉功能的基本过程。这些神经元起源于胚胎后脑的不同前体细胞。本文介绍了利用电穿孔技术在鸡胚后脑中表达基因的方法，以研究基因在听觉发育过程中的功能。...

在卵内 鸡听觉脑干中的电穿孔技术

本方案以可视化方式展示了脑干-脊髓制备过程，并全面、分步详解了脑干横切片的制备方法。该方案旨在提高实验可重复性，并增加成功获取存活时间长、具有节律性活性、可用于记录脑干呼吸区神经输出信号的脑片的可能性。...

新生啮齿类动物脑干-脊髓节律性活动体外制备及薄片制备

整合神经元对多种突触输入的响应，最佳方法是采用一种能够保留所有突触前核团、以维持自然时序和环路可塑性的实验体系；然而，脑片通常会切断大量连接。我们开发了一种改良的脑片制备方法，可在保持体外实验可行性的同时，模拟体内环路的活动状态。...

体外楔形脑片制备以模拟体内神经元环路连接

本文介绍了一种获取鸡胚非冠状位听觉脑干切片的实验方案，用于在单个脑干切片中研究听觉频率拓扑特性（tonotopic...

切片胚胎鸡听觉脑干以评估音调拓扑梯度与微环路

学习制备鸡听觉脑干切片用于体外电生理记录和长期器官型培养的方法。该技术可保存神经环路完整性，帮助研究神经元发育与听觉功能机制。

鸡听觉脑干切片的制备与培养

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