耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的皮下感染

以下实验的总体目标是检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的存活与播散情况，以及感染部位的趋化因子和细胞因子水平。首先，通过去除小鼠背部的毛发，以获得清晰的观察区域。第二步。

在感染后第三天，将通过皮下注射的方式向小鼠施用含有 MRSA 的悬浮液，通过测定组织匀浆在琼脂平板上的菌落形成单位数量，可评估感染病理学变化及细菌计数。你好，最近怎么样？我的名字是 De Lordon。

我是一名博士后研究员。大家好，我叫Mariel Sanchez。我是一名博士生，而我是Andrea Huda。

我是一名研究人员，隶属于西达赛奈医疗中心儿科的乔治·李（George Lee）实验室。该方法有助于回答医学领域的关键问题，例如重症感染的建模，包括肌炎、多发性肌炎和坏死性筋膜炎。尽管该方法可为重症急症感染提供深入见解，也可应用于其他系统，如A族链球菌及其他病原体。

此外，我们还可以研究引起肌炎和多发性肌炎的其他生物体的功能与发病机制。通常，刚接触该实验操作的人员可能会遇到困难，因为一个名为caucus areas global regulator的基因座具有高度变异性。若不加以谨慎，所收集的数据可能会出现显著差异，从而导致数据分析和解释困难。

让我们开始。在生物安全二级（BSL-2）实验室内，使用冻存菌种制备含羊血的TSA基础琼脂平板，并准备好无菌接种环。将 Mercer 菌种从 -80°C 冷冻保存条件下取出。

然后使用无菌接种环，从保藏菌种中刮取一小块冰屑转移到平板上。获取一小块 Mercer 保藏菌种后，应立即将该保藏菌种放回冷冻保存，以避免反复冻融对菌种造成损伤。用接种环在琼脂平板上划线，以促进单个 Mercer 菌落的生长。

在37摄氏度下孵育该培养板，无需补充CO2，孵育过夜。次日，准备并标记新的血卵黄培养基、TSA平板以及一个含有3毫升THB的15毫升带盖离心管。

取出过夜培养的 M SSA 平板，观察菌落的溶血表型。使用无菌接种环，选择一个表型与先前实验菌落一致的菌落。用同一接种环划线接种，将所选菌落接种至 THB 培养基中。

将平板置于含THB溶液的环境中，于37°C、220转/分钟振荡条件下过夜培养。这些细菌将用于后续步骤中对小鼠进行皮下感染的接种。同时将血琼脂平板放入培养箱中。

第二天早上将使用该平板确认细菌在THB溶液中的溶血表型是否与最初选择的菌落一致。如果溶血表型与原始克隆不符，则不要开始实验。将小鼠转移至操作平台，并剃除其背部的毛发。

如果动物过于具有攻击性，可能需要使用异氟烷进行镇静。在剃毛区域涂抹约五立方毫米的脱毛膏，例如 NA。NA 可在当地药店购买。

务必购买含有婴儿油的脱毛膏，因为不含婴儿油的产品对小鼠的刺激性过强。将脱毛膏涂抹于皮肤表面，孵育约一分钟；在脱毛膏孵育的同时，一分钟后用双蒸水浸湿几张纸巾。用这些湿纸巾擦拭剃毛区域，使其清洁干净。

确保皮肤上无脱毛膏残留，将10毫升THB在50毫升带螺帽试管中于37摄氏度细菌培养箱内预热4至10小时。取20微升过夜培养的细菌菌液加入预热的THB中。这将稀释过夜菌液。

将菌液稀释至1:500。将试管置于37摄氏度、220转/分钟的摇床培养箱中，振荡培养约2.5至3小时。培养结束后，用THB培养基进一步将细菌悬液稀释至1:10，并用分光光度计测定悬液的浓度。

在 514 纳米波长处测定吸光度。将悬浮液在 37 摄氏度下以每分钟 220 转的速度振荡孵育，直至 1 比 10 稀释的悬浮液吸光度达到 0.25。为收集菌体，将 50 毫升离心管在 4 摄氏度下以 3,225 ×g 离心 10 分钟，弃去上清液，重悬菌体。

将细菌菌种悬浮于 10 毫升 DPBS 中，并通过重复离心步骤再次洗涤细菌，用于此重度感染模型。将细菌沉淀重新悬浮于约 1 毫升 DPBS 中，得到浓度约为 1 × 10¹⁰ 菌落形成单位/毫升。制备羊血 A-R-T-S-A 平板，将细菌用 DPBS 进行连续 10 倍梯度稀释，稀释倍数从 10¹ 至 10⁸，然后接种平板。

将系列稀释的细菌悬液以每滴10 µL的量，分别滴加到血琼脂平板上，每个稀释度设三个重复。将平板置于37°C培养过夜。培养16至18小时后，观察并记录接种菌的溶血表型。

计数平板上的菌落形成单位。感染接种量将根据平板上的菌落形成单位数量进行计算。

使用之前制备的DPBS细菌悬液，准备一支含有100微升的注射器。注射前，应使小鼠处于镇静状态，呼吸频率约为每秒一次。本视频中展示的是已处死的小鼠，仅用于演示目的。

注射后，在一侧 flank 注射 M 型血清。将小鼠放回笼中。注射后观察动物三到五小时，确保小鼠存活后再转移回动物房。

动物处死后，每天监测其背部病灶。测量并记录皮肤病灶的大小和状况。皮肤和肌肉病灶面积均通过测量病灶的长和宽（单位：毫米）相乘来定量。

对于不规则形状的病灶，必须将其分解为若干较小的对称部分，并对每一部分采用相同的方法进行测量。准备1.5毫升微量离心管，每管中加入100微升DPBS用于组织收集。用无菌刀片在皮肤上划一小口，再用无菌剪刀将病灶切除。

切除病灶时，确保同时切除病灶周围约 2 至 5 毫米的健康皮肤。将病灶放入组织收集管中，用于分析肌肉病灶。小心剥离皮肤，以测量病灶大小并记录肌肉组织上病灶的情况。

取出脾脏和肾脏，将这些组织分别放入各自的收集管中。使用1毫升注射器振荡约30秒，以匀浆组织。

向每支试管中加入 900 微升 DPBS。组装 THA 板，将匀浆后的组织样本涡旋振荡五分钟。对样本进行连续稀释。

悬浮液通常稀释至10到10的6次方倍。在96孔板中，将每种连续稀释的悬浮液各取10 µL加入孔板中。将板置于37 °C细菌培养箱中过夜培养。

第二天早晨，计数平板上的菌落形成单位，并根据稀释倍数计算菌落形成单位的数量。如果感染操作正确，在皮下注射后会立即在皮肤表面观察到隆起的水疱。若未观察到水疱，可能是注射过深，这可能会影响感染效果。

可在 MSA 感染后的不同时间点评估病灶大小和细菌存活情况。以下是在感染后第三天检查的皮肤病变，为在单侧 flank 接种 1×10⁷ 菌落形成单位后 CD1 小鼠上的病灶示例。肌肉病变通常位于皮肤病变下方的组织中。

以下是之前所示皮肤病变照片所对应的肌肉表面病变示例。这些肌肉病变是在小鼠感染七次方个菌落形成单位病原体后第三天观察到的。病变面积定义为病变的长度乘以宽度，以毫米为单位进行测量，可用于评估皮肤组织损伤程度。

可通过切除的病灶定量定植于感染部位的细菌菌落形成单位数量。菌落形成单位计数可表明毒力因子是否为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）提供了生存优势。在进行该操作时，需注意由于使用针头和高致病性微生物，应遵循标准安全防护措施。

最后，与我们的模型相比，脓肿模型使用的接种量低1000倍，可用于回答其他问题，例如：哪些S因子能够促进持续性RSA感染？请务必注意，操作装有Mars A的注射器时可能极为危险，必须采取预防措施，例如将注射器直接丢弃至锐器盒中，以避免被针头意外刺伤。此外，本实验中必须遵循标准的BS O2操作规程，以确保工作区域得到妥善消毒。

以上就是全部内容。感谢观看。你好。再见。