Name: 皮下感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-09T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: 了解利用小鼠皮下感染模型评估耐甲氧西林金黄色葡萄球菌毒力及宿主免疫反应的方法。该模型可分析细菌存活、扩散及感染部位趋化因子和细胞因子水平，为研究MRSA致病机制提供重要工具。

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本工作获得了 Burroughs-Wellcome 职业奖和美国国立卫生研究院资助项目 AI074832（授予 G. Y. Liu）的支持。

1. 准备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）用于感染（感染前两天）
<ol>
<li>从保存的菌种中挑取一环耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），接种至血琼脂（胰蛋白酶大豆琼脂，TSA）平板上。</li>
<li>观察血琼脂平板上的溶血表型（菌落周围出现透明溶血环）。</li>
<li>挑选一个溶血表型与其他实验一致的菌落。</li>
<li>将该菌落接种至含有3 mL Todd Hewitt肉汤（THB）的15 mL带盖试管中，必要时加入相应的抗生素。</li>
<li>在37°C、220 rpm振荡条件下培养过夜。</li>
</ol>
2. 感染前小鼠的准备（感染前一天）
<ol>
<li>根据小鼠体型大小，剃除小鼠背部约 3 x 4 cm 面积的毛发。</li>
<li>在剃毛区域涂抹约 5 mm3 的脱毛膏（购自当地药店）。</li>
<li>使脱毛膏在皮肤表面作用约 1 分钟。</li>
<li>用 ddH2O 浸湿纸巾。</li>
<li>用湿润的纸巾擦去脱毛膏。</li>
</ol>
3. 准备用于感染的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（感染当天）
<ol>
<li>将过夜培养的细菌培养物用10 mL预热的THB在50 mL带螺帽试管中按1:500至1:1000的比例稀释。</li>
<li>在37°C、220 rpm振荡条件下培养约2.5小时，直至A540达到2.5。</li>
<li>在4°C下以3,225 × g离心10分钟，收集耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。</li>
<li>弃去上清液。</li>
<li>用10 mL Dulbecco's磷酸盐缓冲液（DPBS）重悬细菌沉淀。</li>
<li>重复步骤3和4。</li>
<li>用DPBS将细菌沉淀重悬至所需浓度。</li>
<li>将细菌悬液进行连续稀释，稀释倍数从101至108。</li>
<li>将稀释后的细菌悬液接种至血琼脂平板。</li>
<li>将平板在37°C培养过夜。</li>
<li>观察并记录接种物的溶血表型。</li>
<li>计数平板上的菌落形成单位（CFU）数量。</li>
<li>根据平板上的CFU数量计算接种物浓度。</li>
</ol>
4. MRSA 皮下感染（感染当天及感染后第3天）
<ol>
<li>在已剃毛的区域皮下注射 100 μL 细菌悬液。</li>
<li>注射后观察动物 3 至 5 小时，以确保小鼠存活。</li>
<li>每天观察动物背部的病灶，并在需要时每天记录病灶面积。病灶观察应包括记录病灶大小和形态。皮肤和肌肉病灶均通过测量病灶的长度与宽度相乘进行定量。不规则形状的病灶需分解为若干较小的对称部分，每个部分均采用相同方法测量。病灶测量也可使用计算机辅助组织形态学评估软件（ImageJ；美国国立卫生研究院 NIH 提供的开源软件，网址：<a href="http://rsb.info.nih.gov/ij">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a>）2。</li>
<li>感染后第 3 天，通过吸入异氟烷麻醉后行颈椎脱位法处死动物。</li>
<li>观察并记录皮肤上的病灶情况。</li>
<li>用无菌剪刀在皮肤上做切口。</li>
<li>小心剥离皮肤，观察并记录肌肉上的病灶情况。</li>
<li>切除病灶及周围约 2–5 mm 的组织。</li>
<li>采集脾脏和肾脏。</li>
<li>使用组织匀浆器，或将组织与 100 μL DPBS 置于微量离心管中，反复使用 1 mL 注射器的推杆推压，进行组织匀浆。</li>
<li>向每根试管中加入 900 μL DPBS。</li>
<li>将样品涡旋振荡 5 分钟。</li>
<li>用 DPBS 将悬液进行 101 至 106 倍的系列稀释。</li>
<li>将稀释后的悬液接种至 THA 平板上。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
<ol>
<li>每次皮下注射后，若感染操作正确，可在皮肤表面观察到隆起的水疱（图1A）。如果皮肤表面未观察到水疱，则注射可能过深，这可能影响感染结果（病灶大小、CFU）。</li>
<li>每次实验均需对细菌悬液进行系列稀释，并在血琼脂平板上检测CFU。此步骤可提供重要信息：1）接种菌是否具有均一的表型；2）用于感染的活菌确切数量。</li>
<li>可在感染后不同时间点评估病灶形成及细菌存活情况。本研究中在感染后第3天进行检测。病灶大小在皮肤表面（图1B：1×109；图1D：1×107 CFU）和肌肉表面（图1C：1×109；图1E：1×107 CFU）进行分析。病灶面积等于长度（mm）×宽度（mm），可用于评估组织损伤程度（图2A和图2B）。该结果有助于确定特定毒力因子引起的组织损伤程度。此外，切除病灶组织并用DPBS匀浆后进行平板培养，以定量CFU数量（图2C），从而反映感染部位细菌的存活情况。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2528/2528fig1.jpg" alt="细菌感染分析，皮肤与肌肉对比，进展时间线；实验感染过程示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 皮肤与肌肉病灶。 在CD1小鼠一侧 flank 皮下接种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA，LAC株）。在感染后0时和第3天拍摄图像。（A）感染后0时（p.i.），（B）-（G）感染后第3天（p.i.）；B、D 和 F：皮肤病灶；C、E 和 G：肌肉病灶；B 和 C：接种1×109 CFU；D 和 E：接种1×107 CFU；F 和 G：模拟感染（mock）。
<img src="/files/ftp_upload/2528/2528fig2.jpg" alt="病灶面积与CFU/mL数据比较；图示分组图表中的统计学显著性。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 感染后第3天感染部位的皮肤病变大小及可存活细菌计数。 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA，LAC株）感染的CD1小鼠皮肤与肌肉病变。（A）皮肤病变大小。（B）肌肉病变大小。（C）组织总菌落形成单位（CFU）。H：1 × 109 CFU 接种量；L：1 × 107 CFU 接种量。*：p &lt; 0.05，Mann-Whitney检验。

<ol><li>Ahn, J. Y., Song, J. Y., Yun, Y. S., Jeong, G., Choi, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+Staphylococcus+aureus-infected+septic+mice+by+suppression+of+early+acute+inflammation+and+enhanced+antimicrobial+activity+by+ginsan%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Protection of Staphylococcus aureus-infected septic mice by suppression of early acute inflammation and enhanced antimicrobial activity by ginsan.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 46, 187-197 (2006).</li>
<li>Girish, V., Vijayalakshmi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affordable+image+analysis+using+NIH+Image%2FImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ.</a> Indian J Cancer. 41, 47-47 (2004).</li>
<li>Hahn, B. L., Onunkwo, C. C., Watts, C. J., Sohnle, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+dissemination+and+cutaneous+damage+in+a+mouse+model+of+staphylococcal+skin+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Systemic dissemination and cutaneous damage in a mouse model of staphylococcal skin infections.</a> Microb Pathog. 47, 16-23 (2009).</li>
<li>Hruz, P., Zinkernagel, A. S., Jenikova, G., Botwin, G. J., Hugot, J. P., Karin, M., Nizet, V., Eckmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD2+contributes+to+cutaneous+defense+against+Staphylococcus+aureus+through+alpha-toxin-dependent+innate+immune+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">NOD2 contributes to cutaneous defense against Staphylococcus aureus through alpha-toxin-dependent innate immune activation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12873-12878 (2009).</li>
<li>Ji, Y., Zhang, B., Van, S. F., Horn, P. W. arren, Woodnutt, G., Burnham, M. K., Rosenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+critical+staphylococcal+genes+using+conditional+phenotypes+generated+by+antisense+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of critical staphylococcal genes using conditional phenotypes generated by antisense RNA.</a> Science. 293, 2266-2269 (2001).</li>
<li>Somerville, G. A., Beres, S. B., Fitzgerald, J. R., DeLeo, F. R., Cole, R. L., Hoff, J. S., Musser, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+serial+passage+of+Staphylococcus+aureus%3A+changes+in+physiology%2C+virulence+factor+production%2C+and+agr+nucleotide+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">In vitro serial passage of Staphylococcus aureus: changes in physiology, virulence factor production, and agr nucleotide sequence.</a> J Bacteriol. 184, 1430-1437 (2002).</li>
<li>Tseng, C. W., Kyme, P., Low, J., Rocha, M. A., Alsabeh, R., Miller, L. G., Otto, M., Arditi, M., Diep, B. A., Nizet, V., Doherty, T. M., Beenhouwer, D. O., Liu, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+Panton-Valentine+leukocidin+contributes+to+inflammation+and+muscle+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus Panton-Valentine leukocidin contributes to inflammation and muscle tissue injury.</a> PLoS One. 4, e6387-e6387 (2009).</li>
<li>von Kockritz-Blickwede, M., Rohde, M., Oehmcke, S., Miller, L. S., Cheung, A. L., Herwald, H., Foster, S., Medina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+mechanisms+underlying+the+genetic+predisposition+to+severe+Staphylococcus+aureus+infection+in+the+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Immunological mechanisms underlying the genetic predisposition to severe Staphylococcus aureus infection in the mouse model.</a> Am J Pathol. 173, 1657-1668 (2008).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

<ol>
<li>小鼠皮肤和软组织感染模型是一种强大的工具 体内 病原体毒力评估。该病原体的致病性 S. aureus 皮肤和软组织感染中的感染情况可能因多种参数而异，包括接种量、细菌生长阶段、接种深度、小鼠年龄以及小鼠的遗传背景 7, 8在使用该模型研究毒力功能时，必须严格控制这些参数，以确保实验结果的一致性。我们已在多种小鼠品系中研究了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的皮肤感染，包括SKH1（无毛小鼠）、C57Bl/6、BALB/c和CD1。不同品系小鼠的感染结果存在差异。 7，这与其他研究报道一致，即小鼠的遗传构成是决定MRSA感染严重程度的重要因素 1在本实验中，我们采用 CD1 小鼠，因为该小鼠品系已被证明非常适合用于相关研究 S. aureus 毒力因子 5 且比其他菌株更便宜。</li>
<li>为确保实验结果的一致性，每次实验前必须检测用于感染的菌落是否具有溶血表型。 在绵羊血琼脂上呈现的β-溶血表型（菌落周围出现透明区域）反映了α-毒素的表达 S. aureus 分...

<table><tbody><tr><td>THB</td><td>VWR international</td><td>95025-314</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>27G1/2 针头</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>羊血琼脂（TSA）</td><td>VWR international</td><td>90004-328</td><td></td></tr></tbody></table>

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（mrsa）的皮下感染

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）对全球公共卫生构成严重威胁，目前在美国，MRSA引起的皮肤和软组织感染已占所有软组织感染病例的一半以上。在各类软组织感染中，肌炎、化脓性肌炎和坏死性筋膜炎与社区来源的MRSA感染相关的报道日益增多。为了深入理解MRSA与宿主免疫系统之间的相互作用如何导致更严重的感染，建立动物模型至关重要，这有助于研究宿主和细菌两方面的因素。已有多种感染模型被用于评估金黄色葡萄球菌（S. aureus）在浅表皮肤感染过程中的致病机制。本文中，我们描述了一种皮下感染模型，可用于观察皮肤、皮下组织及肌肉的病理变化。

小鼠皮肤和软组织感染模型用于评估耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的毒力功能及宿主免疫应答。本文介绍了一种用于皮肤和软组织感染的皮下感染模型。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的皮下感染

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是全球公共卫生的重大威胁，目前MRSA引起的皮肤和软组织感染已占所有软组织感染病例的一半以上。

以下实验的总体目标是检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的存活与播散情况，以及感染部位的趋化因子和细胞因子水平。首先，通过去除小鼠背部的毛发，以获得清晰的观察区域。第二步。将MRSA菌液皮下注射至小鼠体内，在感染后第三天，可通过测定组织匀浆在琼脂平板上的菌落形成单位数量来评估感染病理学变化和细菌计数。你好，你怎么样？我叫De Lordon。我是一名博士后研究员。大家好，我叫Mariel Sanchez。我是一名博士生，我是Andrea Huda。我是一名研究助理，我们隶属于西达赛奈医学中心儿科的乔治·李（George Lee）实验室。该方法有助于回答医学领域的关键问题，例如严重感染的建模，包括肌炎、多发性肌炎和坏死性筋膜炎。尽管该方法可为严重急症感染提供见解，也可应用于其他系统，如A族链球菌及其他病原体。此外，我们还可以研究引起肌炎和多发性肌炎的其他生物体的功能与发病机制。通常，刚接触该实验操作的人员可能会遇到困难，因为一个名为caucus areas global regulator的调控因子具有高度变异性。若不采取谨慎措施，所收集的数据可能会出现显著差异，从而导致数据解读困难。让我们开始。在生物安全二级实验室内，使用冻存块准备一块含羊血的TSA基础琼脂平板以及一个无菌接种环。将 Mercer 菌种从 -80 摄氏度的保存环境中取出。然后使用无菌接种环，从保存的菌种中刮取少量冰屑并转移至平板上。获取少量Mercer菌种冰屑后，应立即将菌种保存管放回冰箱冷冻，以避免反复冻融对菌种造成损伤。使用接种环在琼脂平板上进行划线，以促进单个Mercer菌落的生长。在37摄氏度下孵育平板，无需补充CO2，过夜。次日，准备并标记新的血卵黄平板、TSA平板，以及含3毫升THB的15毫升带盖离心管。取出过夜培养的 M SSA 平板，观察菌落的溶血表型。使用无菌接种环，选择一个表型与先前实验菌落一致的菌落。用同一接种环划线接种，将所选菌落接种至 THB 培养基中。将平板置于含THB溶液的培养基中，在37摄氏度下振荡培养过夜，转速为每分钟220转。这些细菌将用于后续步骤中对小鼠进行皮下感染的接种。同时将血琼脂平板也放入培养箱中。第二天早上将使用该平板确认THB溶液中细菌的溶血表型是否与最初选择的菌落一致。如果溶血表型与原始克隆不一致，则不要开始实验。将小鼠转移至平台，并剃除其背部的毛发。如果动物过于具有攻击性，可能需要使用异氟烷进行镇静。在剃毛区域涂抹约五立方毫米的脱毛膏，例如 NA。NA 可在当地药店购买。务必购买含有婴儿油的脱毛膏，因为不含婴儿油的产品对小鼠的刺激性过强。将脱毛膏涂抹于皮肤表面，孵育约一分钟；在脱毛膏孵育的同时，用双蒸水浸湿几张纸巾。一分钟后，用这些湿纸巾擦拭剃毛区域，使其清洁干净。确保皮肤上无脱毛膏残留。在细菌培养箱中，将10毫升THB置于50毫升螺旋盖试管内，于37摄氏度预热4至10小时。取20微升过夜培养的细菌菌液转移至预热的THB中。这将稀释过夜菌液。将菌液稀释至1:500。将试管置于37摄氏度、220转/分钟的摇床培养箱中，振荡培养约2.5至3小时。培养结束后，用THB培养基进一步将细菌悬液稀释至1:10，并用分光光度计测定悬液浓度。在 514 纳米波长处测定吸光度。将悬浮液在 37 摄氏度下重新孵育，并以每分钟 220 转的速度振荡，直至 1 比 10 稀释的悬浮液吸光度达到 0.25。为收集 M er，将 50 毫升离心管在 4 摄氏度下以 3,225 ×g 离心 10 分钟，弃去上清液，重悬沉淀。将细菌菌种悬浮于10毫升DPBS中，并通过重复离心步骤再次洗涤细菌，用于此重度感染模型。将细菌沉淀重新悬浮于约1毫升DPBS中，得到浓度约为1×10¹⁰菌落形成单位/毫升。制备羊血A-R-T-S-A平板，用DPBS将细菌进行连续稀释，稀释倍数从10¹至10⁸倍，然后接种平板。将连续稀释的细菌悬液以每份10 µL滴加到血琼脂平板上，每个稀释度设三个重复。于37°C培养过夜。培养16至18小时后，观察并记录接种菌的溶血表型。计数平板上的菌落形成单位。感染接种量将根据平板上的菌落形成单位数量进行计算。用先前制备的含细菌悬液的DPBS准备一支含有100微升的注射器。注射前，应使小鼠处于镇静状态，呼吸频率约为每秒一次。本视频中展示的是已处死的小鼠，仅用于演示目的。注射后，在一侧 flank 注射 M 型血清。将小鼠放回笼中。注射后观察动物三到五小时，确保小鼠存活后再转移回动物房。动物处死后，每天监测其背部病灶情况。测量并记录皮肤病灶的大小和状态。皮肤和肌肉病灶面积均通过测量病灶的长度与宽度（单位：毫米）相乘来定量计算。形状不规则的病灶必须分解为若干较小的对称部分，并对每一部分采用相同方法进行测量。准备含有100微升DPBS的1.5毫升微量离心管，用于组织收集。用无菌剃须刀片在皮肤上划一小切口，再用无菌剪刀切除病灶。切除病灶时，应确保同时切除病灶周围约两到五毫米的健康皮肤。将病灶组织放入组织收集管中，用于分析肌肉病灶。小心剥离皮肤，以测量病灶大小并记录肌肉组织上病灶的状况。取出脾脏和肾脏，将这些组织分别放入各自的收集管中。使用1毫升注射器振荡约30秒，对组织进行匀浆处理。向每支试管中加入 900 微升 DPBS。组装 THA 板，将匀浆后的组织样本涡旋振荡五分钟。对样本进行连续稀释。悬浮液通常稀释至10到10的6次方倍。在96孔板中，将每种连续稀释的悬浮液各取10 µL加入孔板中。将板置于37 °C细菌培养箱中过夜培养。第二天早晨，计数平板上的菌落形成单位，并根据稀释倍数计算菌落形成单位的数量。如果感染操作正确，在皮下注射后会立即在皮肤表面观察到隆起的水疱。若未观察到水疱，可能是注射过深，这可能会影响感染效果。可在金黄色葡萄球菌感染后的不同时间点通过MSA评估病灶大小和细菌存活情况。以下是在感染后第三天检查的皮肤病变，为在单侧腹侧接种一乘以十的七次方菌落形成单位后，CD1小鼠身上出现的病灶示例。肌肉病变通常位于皮肤病变下方的组织中。以下是之前所示皮肤病变照片所对应的肌肉表面病变示例。这些肌肉病变是在小鼠感染七次方10个菌落形成单位后第三天观察到的。病变面积定义为病变的长度乘以宽度，以毫米为单位测量，可用于评估皮肤组织损伤程度。可通过切除的病灶对感染部位定植的细菌进行菌落形成单位数量的定量。菌落形成单位计数可以表明某种毒力因子是否为金黄色葡萄球菌（MSA）提供了生存优势。在进行该操作时，必须始终注意采取标准安全防护措施，因为操作过程中需使用针头以及高致病性微生物。最后，与我们的模型相比，脓肿模型使用的接种量低1000倍，可用于回答其他问题，例如：哪些S因子促进了持续性RSA感染？请务必注意，操作装有Mars A的注射器可能极其危险，应采取预防措施，例如将注射器直接丢弃至锐器盒中，以避免被针头意外刺伤。此外，本实验中必须遵循标准的BS O2操作规程，以确保工作区域得到妥善消毒。以上就是全部内容。感谢观看。你好。再见。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

皮下感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的

大鼠耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）实验性心内膜炎模型

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