使用热激法将质粒DNA转化至大肠杆菌

大家好，我是 Alex Hoge。我在加州大学欧文分校生理学与生物物理学系的 Gym Hall 实验室工作。今天我将向大家演示如何通过电击法转化电感受态的大肠杆菌。

今天，我将使用该技术将我的连接产物转化至大肠杆菌中，因为我接下来要在斑马鱼中进行一些整体原位杂交实验。好的，现在我们开始进行转化实验。首先，你需要将水浴锅或干浴器预热至42摄氏度。

你需要将刚从主培养物中取出的细菌置于冰上。今天我们将使用来自ities的感受态细胞，同时将DNA也置于冰上。此外，你还需要一管处于室温或37°C的SOC培养基，以及含有氨苄青霉素的LB琼脂平板。

现在我将把DNA加入到细菌中。操作时我会在火焰旁进行，以避免细菌污染。接下来，我将把连接产物与细菌混合。

加入50 µL细菌后，立即放回冰上，可轻轻弹动管子以混匀细菌与DNA，冰上静置最多15分钟。现在15分钟已过，我们准备进行热激处理，即将细菌置于42°C下45秒。因此，我将试管从冰中取出，直接放入42°C水浴中，启动计时器计时45秒，然后迅速放回冰中，立即从42°C转移至冰上。

然后我们等待两分钟。现在，我将向细菌中加入 SOC 培养基，并将其置于 37°C 环境中 30 分钟。我取 500 µL 的 SOC 培养基加入细菌中，然后放入我自制的小型培养装置中。

因此，如果你打算在培养箱中使用离心管和临时制作的容器，请务必将离心管水平放置，因为这样它们的振荡效果会更好。现在我们已准备好将试管放入摇床中，以便在37°C下孵育30分钟。

现在我们已经完成了37摄氏度的孵育，接下来要将细菌涂布到含有抗生素的LB培养基上。以我为例，所用的抗生素是氯霉素。取每个样本50 µL，加到平板上。

因此，用剩余的500微升液体，将其放入小型台式离心机中离心，以沉淀细菌。离心后，我们得到一个良好的菌体沉淀，接下来需要去除几乎所有的SOC培养基，仅留下50微升，然后将这50微升浓缩的细菌涂布到平板上。因此，我大约移除了450微升。

我就留这么多。现在我要将菌体沉淀重悬于剩余的 50 µL SOC 培养基中。之后，我可以将这 50 µL 转移至另一块平板上进行涂布。

因此，我对每个样品进行抗性筛选，然后进行转染并涂布平板。最终每个样品将得到两个平板。现在我们需要将细菌均匀涂布到LB平板上。

我将使用一些经过高压灭菌的玻璃珠，但你也可以使用一根做成类似涂抹棒形状的移液管。现在我要在培养皿上放几颗玻璃珠。这样很好。

好了，10 和 15。加入珠子后，将所有培养皿像这样叠放在一起，轻轻摇晃，使珠子将细菌均匀地分散到培养皿的各个位置。因此，我在培养皿干燥之前持续移动它们。

这意味着当你移动磁珠时，不应看到明显的液体条纹。例如，在这块平板中，磁珠倾向于聚集在一起，并出现大量条纹。这个有液体渗出的说明磁珠仍在移动，而这个干燥的则说明已完成干燥。

现在培养皿已经干燥，因此我们可以弃去磁珠。我只需像这样轻轻拉出即可，以便回收利用。接下来，我们将培养皿放入37°C培养箱中过夜培养。在37°C培养12小时后，将培养皿倒置放置，随后从培养箱中取出。

正如我们所见，接种50微升的培养皿中的菌落数量少于接种剩余体积的培养皿。在进行细菌转化时，关键是要在培养皿上获得适量的菌落，即合适的密度。在这个培养皿中菌落非常稀少，但如果你希望获得更多的菌落，可以参考这个培养皿中的理想示例，其菌落密度恰到好处，每个培养皿大约有100个菌落。

此平板是一个较差的示例，因为菌落数量过多，无法挑取单个菌落。因此，我刚刚向您演示了如何对每种转化进行大肠杆菌转化操作。该技术中一个非常重要的环节是在热激之前始终保持所有物品处于冰上低温状态。

然后45秒正常，42摄氏度继续反应，之后放回冰上。其余所有步骤必须在温暖温度或37摄氏度下进行。现在我将通过PCR筛选来筛选我的菌落。

因此，另一个要点是准备两块平板。其中一块预期会长出大量菌落，而另一块菌落较少。重要的是，要使用玻璃珠或移液棒使平板表面非常干燥。

感谢观看，祝您的验证顺利成功。