Name: 单克隆抗体的反对消极行政 H。 capsulatum和其他真菌病原体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 探索单克隆抗体在C57BL/6小鼠模型中对抗荚膜组织胞浆菌的保护效力。本研究通过腹腔给药和鼻内感染实验，评估体液免疫在预防真菌感染中的作用机制。

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1. H. capsulatum 的培养
<ol>
	<li>使用10%的漂白剂清洁生物安全柜，随后进行20分钟的紫外照射，为真菌操作做好准备。H. capsulatum 的酵母相需要遵循生物安全二级（BSL II）操作规范，而菌丝相则需要BSL III级防护。后续步骤中使用酵母相。</li>
	<li>准备一个15 ml的锥形管，加入5 ml PBS。从在37°C培养的BHI血琼脂平板[葡萄糖10 g/L、半胱氨酸0.1 g/L、青霉素-链霉素1%、绵羊红细胞50 ml/L（Colorado Serum Co., Colorado, USA）]上挑取一单菌落H. capsulatum（菌株Hc ATCC G217B），或取-80°C保存的酵母冻存液适量加入PBS中。剧烈涡旋混匀，室温下以1100 × g离心10分钟。小心移除上清液，避免扰动沉淀，加入10 mL新鲜PBS。重复此洗涤步骤三次。将细胞重悬于5 mL PBS中，并转移至50 mL锥形管。</li>
	<li>为打破细胞聚集，将酵母细胞悬液在生物安全柜内（佩戴面部防护）用10 mL注射器通过26G1/2针头反复推注5次。为分离出小而均一的酵母细胞，将细胞在室温下以55 × g离心1分钟，然后小心吸取并弃去顶部1 ml液体。</li>
	<li>将细胞悬液加入含有100 ml HAM F12培养基（GIBCO）的无菌锥形瓶中，培养基中添加16 g/L葡萄糖、1 g/L谷氨酸、8.4 mg/L胱氨酸和6 g/L谷氨酸，在37°C、150 rpm振荡条件下培养48小时。</li>
</ol>
2. 杂交瘤细胞培养与单克隆抗体纯化
<ol>
	<li>将选定的杂交瘤细胞转移至含10%胎牛血清、10% NCTC、1%非必需氨基酸和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中。在37°C、5% CO2条件下，于细胞培养瓶（Becton Dickenson）中培养5-7天。</li>
	<li>随后在室温下以1100 × g离心10分钟，收集上清液，避免扰动沉淀物。</li>
	<li>接着使用蛋白A/G树脂通过FPLC纯化无细胞的上清液。</li>
	<li>然后可通过捕获ELISA（1）使用IgG同型对照作为标准品来计算mAb浓度（图1B）。</li>
</ol>
3. Histoplasma Capsulatum 接种物制备
<ol>
	<li>取48小时 荚膜组织胞浆菌 （菌株 Hc ATCC G217B）酵母相培养物，在 HAM F-12 培养基中培养。</li>
	<li>以 1100 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，加入新鲜 PBS。</li>
	<li>重复步骤 3.2，共 3 次。 </li>
	<li>用注射器将酵母细胞悬液通过26G1/2针头反复推注5次。</li>
	<li>以 55 × g 离心 1 分钟，使残留的细胞团沉淀。将含有单细胞悬液的上清液转移至新离心管中。</li>
	<li>使用血细胞计数板对单细胞悬液进行计数。</li>
	<li>调整细胞浓度，以达到 1.25 x 107 酵母（存活率）或 5.0 x 106 （菌落形成单位、细胞因子和组织学）在悬液中 &lt;50 μL （图2）。</li>
</ol>
4. 单克隆抗体的腹腔注射
<ol>
	<li>用一只手抓住小鼠的尾巴和颈部背侧皮肤（图 3A）。尽可能靠近耳朵处捏住小鼠颈部背侧皮肤以固定小鼠（确保捏起足够的皮肤，防止小鼠转头咬伤操作者；图 3B 和 3C）。</li>
	<li>用小指轻轻压住手掌固定尾巴（图 3D）。</li>
	<li>注射前用 70% 乙醇擦拭注射部位，并在插入针头后回抽观察是否有血液，确认无误后再进行注射。</li>
	<li>使用 26G1/2 针头刺穿皮肤和腹肌，将含有 500μg 抗体的溶液（PBS、同型对照抗体或待测单克隆抗体，溶于 1 mL PBS 中）注入左下腹或右下腹象限（腹膜腔内），操作时使小鼠头部朝下，注意避免损伤膈肌和其他内脏器官（图 3E）。</li>
	<li>拔针前短暂停留，以减少药液外漏的可能性。</li>
	<li>至少等待两小时后，再进行下一步操作。</li>
</ol>
5. 小鼠麻醉与经鼻感染
<ol>
	<li>使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）配制麻醉剂。按照随附书面方案所述，通过腹腔注射给予磷酸盐缓冲液（PBS）、同型对照抗体或实验性抗体。在单克隆抗体注射后等待两小时，再对小鼠进行麻醉并开展鼻内感染实验。 
	 
	使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）配制麻醉剂（7）。 
	 </li>
	<li>在2小时等待期间，准备 荚膜组织胞浆菌 按照随附书面方案中所述制备接种物。</li>
	<li>按照步骤 5.1 至 5.5 操作。用镊子夹捏动物脚趾，检查无反射反应，以确认麻醉生效. 麻醉后，将小鼠前牙轻轻悬挂在尼龙或棉线上，使用两个支柱架固定绳子以悬挂动物。</li>
	<li>缓慢给予约 50 μl 使用微量移液器将接种物注入小鼠鼻腔，同时密切监测小鼠的呼吸频率。鼻腔感染后，让小鼠保持该体位休息2–5分钟，以促进酵母菌沉积至动物肺部（图3F）。</li>
	<li>小鼠感染后，将其置于受监控的温暖环境中饲养（温度保持在25至 37°C），必要时可小心使用加热灯，直至其从麻醉中恢复。小鼠苏醒后，将其放回洁净的笼具中 随意 食物和水的获取 将笼子送回我们的动物实验中心，并置于清洁的动物房（BLSI）中饲养。 </li>
</ol>
6. 生存研究
<ol>
	<li>对感染动物和模拟感染动物进行临床评估，观察呼吸急促、嗜睡、意识模糊和体重减轻等症状。实验室人员应每天检查两次，动物饲养员应每天检查一次。</li>
	<li>在小鼠组织胞浆菌病中，通常直到接近死亡前，除呼吸频率轻度增加外，无其他明显感染迹象。在疾病晚期（通常发生在第10至11天），小鼠会出现明显的呼吸急促，并伴有活动减少。通常会迅速进入濒死状态并死亡。</li>
	<li>应使用CO2在专用容器中对痛苦明显的动物实施安乐死，死亡动物应每日统计数量。</li>
</ol>
7. 菌落形成单位研究、组织学及细胞因子研究
<ol>
	<li>为待采集的每个器官准备含有 10 mL PBS 的 15 mL 圆锥形管。</li>
	<li>在接种亚致死剂量（5.0 × 106）后第 7 天和第 14 天处死动物，并立即取出肺、脾和肝。</li>
	<li>取待检测器官的一小块组织，用福尔马林固定过夜。组织切片将通过显微镜进行病理学评估。</li>
	<li>为待匀浆的每个器官准备含有 5 mL PBS 的 50 mL 圆锥形管，并在管口覆盖 70 μm 细胞滤器。使用无菌 5 mL 注射器活塞分别将各器官剩余部分压碎并加入 50 mL 管中。</li>
	<li>随后对器官匀浆液进行连续稀释（1:100、1:1000 和 1:5000），并将每种稀释液各 100 μL 接种至 BHI-血琼脂平板（2）上。</li>
	<li>根据生产商说明（Roche, Germany）向匀浆液中加入蛋白酶抑制剂片剂。</li>
	<li>将平板在 37°C 下孵育最多 14 天，并计数菌落形成单位（CFU）。</li>
	<li>将器官匀浆液在 4000×g 离心 10 分钟，收集上清液用于后续按制造商推荐的标准方法进行的细胞因子检测。</li>
</ol>
8. 单克隆抗体对的保护作用 H. Capsulatum 依赖于抗体特异性和同种型
<ol>
	<li>单克隆抗体（MAb）的同种型在抵抗H. capsulatum中至关重要，接受抗Hsp60的IgG1或IgG2a单克隆抗体处理的小鼠，其存活时间显著长于接受抗Hsp60的IgG2b单克隆抗体、同种型对照单克隆抗体或PBS的对照组小鼠（图4）。</li>
	<li>此外，在接受具有保护作用的单克隆抗体的小鼠中，第7天时肺部和脾脏的菌落形成单位（CFU）数量显著减少，至第14天时肺部酵母菌数量分别下降了2个和2.5个对数单位（图5）。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig1.jpg" alt="蛋白质纯化流程图，包含离心机、PBS、亲和层析和纯化的单克隆抗体。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1：H. capsulatum 及杂交瘤的培养。（A）从 BHI-血琼脂平板上培养的 H. capsulatum 获得单菌落，用于制备液体 HAM F-12 培养物。（B）杂交瘤在细胞培养瓶中的生长，以及利用蛋白 A/G 树脂通过亲和层析纯化单克隆抗体。
<img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig2.jpg" alt="离心示意图，含 PBS 洗涤步骤；使用注射器；该过程产生用于分析的上清液。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2： H. capsulatum 鼻腔感染接种物的制备。经细胞悬液获得后 H. capsulatum 通过移液器破坏聚集体并进行离心后，使用血细胞计数板进行计数。细胞浓度调整至1.25 × 107 （生存实验）或 5 × 106 （菌落形成单位、细胞因子和组织学）在 &lt;50 μL.
<img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig3.jpg" alt="动物操作技术，小鼠固定，实验室操作示意图，实验装置。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3：单克隆抗体给药过程中的小鼠操作。（A）通过尾巴抓取小鼠，（B 和 C）通过握住其颈部后方皮肤并尽量靠近耳朵处进行固定。（D）将尾巴夹于小指与手掌之间。（E）使用26G1/2针头注射单克隆抗体溶液。（F）通过移液器将H. capsulatum细胞悬液轻柔滴入鼻孔，以进行鼻内接种。
<img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig4.jpg" alt="Kaplan-Meier生存曲线，显示PBS、IgG1、IgG2a、IgG2b组在60天内的存活率。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 图4：抗Hsp60的单克隆抗体可改变组织胞浆菌病的发病过程。在感染前2小时，腹腔注射500 μg的IgG1或IgG2a单克隆抗体，可显著延长小鼠的存活时间（与对照组相比，p&lt;0.05），但IgG2b单克隆抗体无此效果。
<img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig5.jpg" alt="单克隆抗体对细菌载量的影响；柱状图；感染后7-14天组织CFU对数比较。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 图 5： 在经腹腔注射给予抗Hsp60特异性单克隆抗体或无关单克隆抗体处理的小鼠中，于鼻腔接种5×106 Hc 酵母菌后7天和14天检测肺组织中的CFU，结果显示接受IgG1和IgG2a亚型单克隆抗体治疗的小鼠真菌负荷显著降低。黑色柱代表感染后第7天的CFU，白色柱代表第14天的CFU（*感染后第7天 p&lt;0.001，**感染后第14天 p&lt;0.001）。

<ol><li>Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+based+ELISAs+for+cryptococcal+polysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide.</a> J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).</li>
<li>Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+to+heat+shock+protein+60+alter+the+pathogenesis+of+Histoplasma+capsulatum.+Infect+Immun+77%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77.</a> , 1357-1367 (2009).</li>
<li>Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+function+and+molecular+mapping+of+M+antigen+in+yeast+phase+of+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum.</a> PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).</li>
<li>Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+antibodies+and+endemic+dimorphic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Protective antibodies and endemic dimorphic fungi.</a> Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. eepe, &amp, G. S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S. Jr, ,, Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li>
<li>Smith, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+laboratory+animals+to+some+injectable+anaesthetics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics.</a> Lab Anim. 27, 30-39 (1993).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文所述方案表明，抗荚膜组织胞浆菌（H. capsulatum）的单克隆抗体（mAb）可改变实验性小鼠组织胞浆菌病的病程。针对病原体细胞表面抗原的单克隆抗体能够调节宿主与病原体相互作用过程中发生的复杂动态变化。本研究证实，在致死性组织胞浆菌病的小鼠模型中，腹腔注射单克隆抗体可介导保护作用，并提示某些候选蛋白可用于疫苗开发，例如H2B、M抗原（表面过氧化氢酶）(3) 和Hsp60。在体内实验中，给予针对Hc Hsp60和H2B的保护性单克隆抗体可降低感染小鼠器官中的真菌负荷和炎症反应，并延长其存活时间。
尽管针对荚膜组织胞浆菌（H. capsulatum）的疫苗研发是一个令人振奋的研究领域，但疫苗在免疫功能低下个体中可能无效，因为他们未必能够有效启动免疫应答。因此，显然这类人群可能最受益于针对荚膜组织胞浆菌抗原（H. capsulatum antigens）的单克隆抗体（mAb）被动治疗。我们的数据表明，针对Hsp60的单克隆抗体，尤其是与其他靶向细胞表面抗原的单克隆抗体联用时，可能改善组织胞浆菌病患者的治疗效...

<table><tbody><tr><td>生物安全柜（BSL2）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HAM F-12 培养基</td><td>GIBCO，由 Life Technologies 提供</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C 摇床</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>26G1/2 针头</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL 三角烧瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FPLC（&lt;em&gt;快速蛋白液相色谱&lt;/em&gt;）系统</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>麻醉剂（氯胺酮和赛拉嗪）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>层析柱支架</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>尼龙绳</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热灯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70&amp;mu;m 细胞滤网</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BHI 琼脂平板</td><td>GIBCO，由 Life Technologies 提供</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

被动给予抗h. capsulatum及其他真菌病原体的单克隆抗体

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

使用该方法学的目的在于：1）提升我们通过抗体或疫苗保护个体、以预防或治疗由荚膜组织胞浆菌（Histoplasma capsulatum）引起的组织胞浆菌病的能力；2）研究毒力因子作为治疗靶点的作用。为制备单克隆抗体（mAb），先对小鼠进行免疫，随后采用本实验室建立的固相ELISA系统评估其免疫反应，并筛选出免疫应答最强的小鼠，分离其脾细胞用于与杂交瘤细胞融合。C57BL/6小鼠已被广泛用于研究H. capsulatum的致病机制，是获取所需数据的最佳模型。为评估单克隆抗体在感染中的作用，小鼠经腹腔注射给予抗H. capsulatum的单克隆抗体或同型匹配的对照单克隆抗体，随后通过静脉（i.v.）、腹腔（i.p.）或鼻内（i.n.）途径感染病原体。在科学文献中，评估单克隆抗体对真菌感染疗效的终点通常依赖于死亡率，并结合早期时间点的菌落形成单位（CFU）测定。生存期（死亡时间）研究至关重要，因其最能反映人类疾病的进程。因此，若无生存曲线，我们干预措施的有效性将无法充分确立。这一点同样适用于疫苗有效性的验证或对毒力突变株的测试。在组织胞浆菌病中，小鼠常在数小时内从活跃状态迅速发展至死亡。某种干预措施（如单克隆抗体给药）可能在初期保护动物免于发病，但疾病可能复发，而短期的CFU实验无法揭示这一情况。除了生存期和真菌负荷检测外，我们还检测感染引发的炎症反应（包括组织病理学、细胞募集和细胞因子反应）。在生存期/死亡时间实验中，小鼠感染后每天至少两次观察其发病迹象。为评估真菌负荷、组织病理学变化及细胞因子反应，小鼠在感染后的不同时间点被实施安乐死。动物实验均依照阿尔伯特·爱因斯坦医学院动物研究研究所的指导原则进行。

C57BL/6小鼠已被用于研究Hc的发病机制，并提供了最佳模型。我们正在探索体液免疫对该真菌的潜在保护作用，并制备了多种单克隆抗体[mAb]（针对组蛋白H2B和一种60kDa热休克蛋白），通过腹腔注射后检测其保护效果。

被动给予抗H. capsulatum及其他真菌病原体的单克隆抗体

使用该方法学的目的在于：1）提升我们通过抗体或疫苗保护个体以预防或治疗……的能力

本实验的总体目标是提升我们利用抗体或疫苗保护个体预防或治疗组织胞浆菌病的能力，并研究毒力因子在疾病发病机制中的作用。首先，通过分离和表征针对目标抗原的单克隆抗体来实现这一目标。实验的第二步是在鼻内感染前两小时，将选定的单克隆抗体经腹腔注射给予实验个体。为了使这些分子有足够时间在体内分布，该实验步骤的第三步是将小鼠麻醉，并通过鼻内途径接种目标接种物。实验的最后一步是监测动物的健康状况。可在不同时间点处死动物，以测定真菌载量并评估炎症反应；也可持续观察动物存活情况。最终可获得结果显示，在致死性感染的小鼠中，通过感染前腹腔给予保护性单克隆抗体，可延长其生存时间并改变受累器官的病理反应。演示该实验步骤的是 Ally Emer，一位在真菌致病机制和动物感染模型方面具有丰富经验的博士后研究人员。与现有方法（如抗真菌药物）相比，该技术的主要优势在于，单克隆抗体是具有特定生物学特性的分子，可通过激活宿主的潜在因子发挥作用。对该方法进行直观演示至关重要。由于单克隆抗体给药和鼻内感染步骤需要熟练的动物操作技术，因此较难掌握。使用漂白剂清洁生物安全二级柜，随后进行紫外线照射，以备用于处理酵母形态的真菌。准备一个15毫升的圆锥形试管，加入5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）。从保存于负80摄氏度的菌种冻存液中挑取一单菌落H caps AUM，接种至PBS涡旋液中。充分混匀后，在室温下以1100 × g离心10分钟。小心弃去上清液，勿扰动沉淀，加入至少10毫升新鲜PBS。最后一次洗涤后，重复此步骤三次。将细胞重悬于 5 毫升 PBS 中。所有洗涤步骤均应在室温下进行。为分散聚集的细胞，使用 10 毫升注射器将酵母细胞通过 26 号半针头推注五次，收集酵母细胞至 50 毫升锥形管中。为了分离出小而大小均一的酵母细胞，将细胞在55 × g条件下离心1分钟，然后弃去上层1毫升液体。将细胞悬液加入含有100毫升Ham's F12培养基的无菌250毫升玻璃锥形瓶中，并在37°C、二氧化碳浓度为室温条件下的摇床培养箱中培养48小时。该培养物将用于制备接种物，并用于评估下一步产生的单克隆抗体的效果。在五到七天后，将选定的杂交瘤细胞在DMEM中进行培养。孵育后，通过收集细胞培养瓶中的全部培养基来收获抗体，然后在1100 × g 条件下离心10分钟。与酵母细胞类似，抗体可在室温下进行洗涤。收集上清液时避免扰动沉淀。接着，使用蛋白AG树脂通过F-P-L-C-A捕获法纯化无细胞上清液。采用Eli SA法计算单克隆抗体浓度，以确定应注射的纯化抗体用量。腹腔内注射 PBS 同型对照抗体或实验抗体，具体操作步骤详见随附的书面方案。单克隆抗体注射后，等待两小时，再对小鼠进行麻醉并继续进行经鼻感染。按照随附的书面方案制备组织胞浆菌 capsulatum 接种物，并组装感染用绳装置：将尼龙绳或棉绳紧密系在两个立柱支架之间，然后分开支架，使绳子绷紧。以每千克100毫克的剂量给予麻醉剂氯胺酮，以及每千克10毫克的赛拉嗪。此外，当抗体已有充足时间扩散时，也可在此时进行准备。对小鼠实施麻醉，并通过脚趾无反应来确认镇静状态。用镊子夹住。轻轻将小鼠的门齿悬挂在绳子上。使用微量移液器缓慢将约 50 µL 接种物注入空气中。密切监测小鼠的呼吸频率。鼻腔感染后，让小鼠保持此体位休息2至5分钟，以促进酵母菌沉积至小鼠肺部。在小鼠恢复麻醉期间，应将其置于受监控的温暖环境中，必要时谨慎使用加热灯。当小鼠苏醒后，将其放回清洁的笼子中。可自由进食和饮水，对感染组和模拟感染组动物进行临床评估。实验室人员应每天检查两次，动物饲养员应每天检查一次，观察是否存在呼吸急促、嗜睡或体重减轻等异常情况。在组织胞浆菌病的早期阶段，直到生命末期之前，通常没有明显的感染迹象，仅表现为呼吸频率轻度增加。在疾病进展期，小鼠会明显消瘦且活动能力下降。通常情况下，病情迅速恶化，小鼠数量急剧减少并死亡。应使用二氧化碳对处于痛苦状态的动物实施适当的安乐死，操作需在专用的密闭容器中进行。通过检查动物对脚趾挤压无反射反应来确认死亡，并对已死亡动物每日进行计数记录。为待采集的每个器官准备含有10毫升PBS的15毫升锥形管。对感染了亚致死接种量（5 × 10⁶）酵母细胞的动物实施安乐死，操作方法如前所述，并立即取出肺、脾和肝脏，同时准备含有5毫升PBS的50毫升锥形管。为每种待匀浆的器官分别准备一个装有70微米细胞筛的培养皿。用5毫升研磨棒分别研磨各器官，并转移至50毫升离心管中。随后将器官匀浆液进行连续稀释，三个稀释梯度分别为1:100、1:1001至1:5,000，并将100微升接种于BHI培养基上。将血液琼脂平板置于含正常大气浓度二氧化碳的培养箱中，37摄氏度下孵育最多14天，并计数菌落形成单位（CFU）的单克隆抗体。同种型在抵抗hcaps Lotum中至关重要，因为接受IgG1或IgG2a抗HSP60单克隆抗体的小鼠，其存活时间显著长于接受IgG2b抗HSP60单克隆抗体、同种型对照单克隆抗体或PS的对照组小鼠。此外，在接受保护性单克隆抗体的小鼠中，第7天时肺部和脾脏的CFU数量显著减少，第14天时肺组织中酵母菌数量分别下降了2和2.5个对数单位。在此步骤之后，可进一步采用其他方法，如测定指示菌落形成单位的酵母负荷、分析感染过程中涉及的细胞因子以及评估组织病理学结构，以回答更多问题，例如阐明抗体介导疾病修饰的作用机制。在处理基因敲除动物以及进行鼻内感染操作时，务必牢记在生物安全条件下工作，并遵守动物护理的相关规定。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

单克隆抗体的反对消极行政 H。 capsulatum和其他真菌病原体

本视频展示了多发性硬化动物模型——DA大鼠慢性复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导方法及临床评分。该疾病通过用包含全鼠脊髓组织与完全弗氏佐剂的乳剂免疫大鼠而诱导，其临床表现与人类疾病相似。...

慢性复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导与临床评分

某些小鼠品系能够抵抗以髓鞘碱性蛋白诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。本文介绍了一种简单的免疫接种方案，可逆转这些小鼠品系的无反应状态，并在多种典型的EAE抗性小鼠品系中诱导出麻痹性疾病。...

通过过继转移与抗原攻击克服实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）抵抗性小鼠品系的无应答状态

本视频展示了一种高效的均质化技术，用于制备抗原-佐剂乳剂，以在小鼠模型中诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。该乳剂的水相中含有自身抗原——髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG），周围由包含灭活病原菌的连续油相包裹。该乳剂可实现抗原的持续释放，从而引发持久的免疫反应。...

制备抗原-佐剂乳剂以诱导自身免疫性脑脊髓炎

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是多发性硬化症的一种成熟动物模型。通过用髓鞘寡突胶质细胞糖蛋白肽35-55（MOG35-55）免疫C57BL/6小鼠，可诱导中枢神经系统中自身反应性免疫细胞引发的上行性弛缓性瘫痪。本文将讨论疾病诱导与监测的相关方案。...

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG35-55）诱导的C57BL/6小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）

本文介绍了一种基于杂交瘤技术制备单克隆抗体的优化方案。通过免疫偶联物对小鼠进行免疫，随后利用聚乙二醇（PEG）和电脉冲将脾细胞与永生化骨髓瘤细胞进行融合。通过HAT选择培养基及抗原特异性的ELISA筛选，获得能够产生抗体的杂交瘤细胞。...

利用杂交瘤技术制备小鼠单克隆抗体

本文提供了一种针对天然产物的单克隆抗体的制备与评价的详细实验方案，可用于多种免疫分析。该流程包括免疫接种、细胞融合、用于阳性克隆筛选的间接竞争ELISA以及单克隆杂交瘤细胞的制备。同时提供了利用MALDI-TOF-MS和ELISA分析对抗体进行表征的技术参数。...

天然产物单克隆抗体的制备

本文提供了一种在小鼠中诱导主动实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的实验方案。同时介绍了一种分离和表征中枢神经系统（CNS）中浸润性淋巴细胞的方法，以展示淋巴细胞在CNS自身免疫性疾病发生过程中的作用。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎期间中枢神经系统淋巴细胞浸润的流式细胞术分析

本方案概述了在小鼠中诱导 预激活型分枝杆菌性葡萄膜炎（PMU）的步骤。该方法详细说明了在小鼠模型系统中产生可靠且显著的眼部炎症的操作流程。通过使用本方案，我们从单只动物中获得了葡萄膜炎眼及未发炎的对侧眼，可用于后续的免疫学、转录组学和蛋白质组学分析。...

作为感染后葡萄膜炎模型的启动型分枝杆菌性葡萄膜炎（PMU）

为了诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（一种多发性硬化症的动物模型），需用含有自身抗原和完全弗氏佐剂的油包水乳剂对小鼠进行免疫。尽管目前已存在多种乳剂制备方案，本文介绍了一种快速、简便且标准化的乳剂均质化制备方法。...

一种快速、简单且标准化的匀浆方法用于制备抗原/佐剂乳剂以诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎

本文介绍一种替代方案，通过使用免疫原性表位髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）35-55 悬浮于含灭活的副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium subsp.

Mycobacterium paratuberculosis 在实验性自身免疫性脑脊髓炎中增强自身抗原免疫原性的佐剂活性

小鼠通常对脓肿分枝杆菌（Mycobacterium...

琼脂糖珠制备 脓肿分枝杆菌 通过气管内接种免疫活性小鼠

探索单克隆抗体在C57BL/6小鼠模型中对抗荚膜组织胞浆菌的保护效力。本研究通过腹腔给药和鼻内感染实验，评估体液免疫在预防真菌感染中的作用机制。

被动给予抗H. capsulatum及其他真菌病原体的单克隆抗体

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