Name: 使用全山原位杂交分子和有机体生物学链接 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-31T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: 学习全山原位杂交技术，用于观察斑马鱼胚胎发育阶段的基因表达模式。该方法将分子生物学与有机体发育相结合，为学生提供整合性的研究体验。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者谨此感谢雪城大学生物系以及 Marilyn Kerr 博士在《比较脊椎动物生物学》课程管理工作中所给予的支持。Albertson 实验室的研究得到了美国国立卫生研究院/国家牙科与颅面研究所授予的 R21DE019223 项目资助，以及美国国立卫生研究院/国家老龄化研究所授予的 R01AG031922 项目资助。

1. 目标cDNA的质粒转化
第一部分：质粒转化
（所需时间：3 小时加上过夜孵育）
<ol>
<li>将SOC营养肉汤在42°C水浴中预热（每反应500 μL）</li>
<li>在冰上解冻感受态细胞</li>
<li>向25 μL感受态细胞中加入1 μL质粒</li>
<li>冰上放置20分钟</li>
<li>在42°C水浴中热激细胞45秒</li>
<li>立即放回冰上冷却2分钟</li>
<li>向每管细胞中加入500 μL 42°C的营养肉汤</li>
<li>在37°C、255转/分钟（rpm）条件下振荡培养2小时</li>
<li>取75 μL转化混合物涂布于Luria Bertani（LB）琼脂平板</li>
<li>倒置平板，于37°C过夜培养</li>
</ol>
第二部分：E. coli 培养
（所需时间：15 分钟加上过夜孵育）
<ol>
<li>每个反应中，取 3 mL LB 培养基和 3 μL 50 mg/mL 氨苄青霉素加入培养管中</li>
<li>从琼脂平板上刮取 1 个细菌菌落，加入每根培养管中</li>
<li>将培养管于 37°C、255 rpm 条件下振荡培养过夜</li>
</ol>
第三部分：质粒制备
（所需时间：1.5 小时）
<ol>
<li>使用 5 Prime FastPlasmid Mini Kit（目录号 #2300000）从过夜培养物中分离质粒</li>
<li>为检测所制备质粒的存在，将试剂盒洗脱的 DNA 在含溴化乙锭染色的 1% Tris-乙酸-EDTA（TAE）凝胶上电泳</li>
</ol>
2. 原位 地高辛标记RNA探针合成
第一部分：质粒的线性化
（所需时间：2.5 小时）
<ol>
<li>在 1.5 mL 微量离心管中混合： 
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>制备好的质粒</td>
 <td>20 mL </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>限制性内切酶*</td>
 <td>2 mL </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>缓冲液**</td>
 <td>10 mL </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X 牛血清白蛋白 (BSA)</td>
 <td>10 mL </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>焦碳酸二乙酯 (DEPC) 水</td>
 <td>58 mL </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>100 mL </td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
</li>
<li>在 37°C 下孵育 2 小时 
*根据质粒不同而变化 
**根据限制性内切酶不同而变化</li>
</ol>
第二部分：转录
（所需时间：3 小时）
<ol>
<li>在 1.5 mL 微量离心管中混合： 
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>线性化质粒</td>
 <td>4 mL </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X 转录缓冲液**</td>
 <td>4 mL </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>地高辛标记混合物</td>
 <td>4 mL </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>聚合酶*</td>
 <td>2 mL </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase 抑制剂</td>
 <td>2 mL</td>
</tr>
<tr>
 <td>DEPC 水</td> 
 <td>24 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>40 mL </td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
</li>
<li>在 37°C 下孵育 1 小时</li>
<li>加入 2 μL 聚合酶*</li>
<li>在 37°C 下孵育 1 小时</li>
<li>加入 2 μL DNase</li>
<li>在 37°C 下孵育 20 分钟 
*随质粒不同而变化 
**随聚合酶不同而变化</li>
</ol>
第三部分：沉淀
（所需时间：5 分钟操作时间，加上 2 小时至过夜孵育，1 小时离心及重悬）
<ol>
<li>加入 4 μL 的 0.2 M EDTA</li>
<li>加入 5 μL 的 4 M 氯化锂</li>
<li>加入 150 μL 冰冷的 100% 乙醇</li>
<li>在 -80°C 下孵育 2 小时至过夜</li>
<li>在 4°C 下以 14,000 rpm 离心 30 分钟，弃去上清液</li>
<li>将沉淀干燥 7 分钟</li>
<li>用 20 μL DEPC 处理水重新悬浮</li>
<li>在 37°C 下孵育 5 分钟</li>
</ol>
第四部分：分级分离——仅当探针大小大于 0.6 kb 时进行
（所需时间：根据探针大小而定，通常不超过20分钟）
<ol>
<li>在 1.5 mL 微量离心管中混合： 
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>RNA 探针</td>
 <td>20 mL </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEPC 水</td>
 <td>12 mL </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>碳酸氢钠</td>
 <td>4 mL </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>碳酸钠</td>
 <td>4 mL </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>40 mL </td>
 </tr>
</tbody>
</table>
</li>
<li>在 60°C 水浴中孵育。孵育时间根据以下公式确定： 
时间（分钟）=（起始 kb - 目标 kb）/（0.11 × 起始 kb × 目标 kb） 
目标平均大小 = 0.6 kb</li>
</ol>
第五部分：最终沉淀
（所需时间：5 分钟操作时间，加上 2 小时至过夜孵育，1 小时离心与重悬，1 小时凝胶电泳）
<ol>
<li>加入 40 μL DEPC 水</li>
<li>加入 8 μL 醋酸钠</li>
<li>加入 1.04 μL 冰醋酸</li>
<li>加入 240 μL 冰冷的 100% 乙醇</li>
<li>在 -80°C 下孵育 2 小时至过夜</li>
<li>在 4°C 下以 14,000 rpm 离心 30 分钟，弃去上清液</li>
<li>将沉淀干燥 7 分钟</li>
<li>用 20 μL DEPC 水重悬沉淀</li>
<li>涡旋混匀</li>
<li>为检测核糖探针的存在，将重悬后的溶液在含溴化乙锭的 1% TAE 琼脂糖凝胶上电泳</li>
</ol>
3. 整体封片 原位 杂交
第一部分：胚胎固定与蛋白酶K消化
（所需时间：固定过夜，次日储存需4小时，从储存到第二部分需2.5小时）
<ol>
<li>收集不同发育阶段的斑马鱼胚胎，并在4%多聚甲醛（PFA）中于4°C过夜固定</li>
<li>用含0.1% Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBSt）洗涤固定后的胚胎，每次10分钟，共洗涤3次</li>
<li>为确保胚胎充分接触实验试剂，必要时使用尖头镊子手动去除胚胎的绒毛膜</li>
<li>通过在PBSt中依次用25%和50%甲醇梯度溶液各洗涤1小时进行脱水，然后在-20°C下保存于100%甲醇中</li>
<li>使用前，在PBSt中通过50%甲醇（2次）和25%甲醇（1次）各洗涤10分钟以重新水化胚胎，最后在100% PBSt中洗涤2次，每次10分钟。PBSt/甲醇洗涤的具体时间并不关键</li>
<li>如有需要，将胚胎置于含10%过氧化氢的PBSt溶液中漂白，以去除深色色素。根据胚胎发育阶段，孵育时间应为10–20分钟，且微量离心管盖应保持打开状态，以防气压积聚</li>
<li>根据胚胎发育阶段，使用以PBSt按1:5000稀释的50 mg/mL蛋白酶K消化胚胎，时间为3–15分钟</li>
<li>将胚胎在4% PFA中重新固定30分钟，随后在PBSt中洗涤3次，每次5分钟</li>
</ol>
第二部分：核糖探针的杂交
（所需时间：3 小时，外加杂交过夜，次日 1.5 小时至第三部分）
<ol start="9">
<li>将胚胎置于预热至70°C的预杂交液（PHS）中，在70°C水浴中预杂交2-3小时</li>
<li>移除PHS，加入0.5 mL杂交液和1.5 μL先前合成的地高辛标记的核糖探针，在70°C孵育过夜。根据核糖探针靶标的不同，温度可在几度范围内波动</li>
<li>次日，在70°C下依次用含75%、50%和25% PHS的2X盐-柠檬酸钠（SSC）溶液梯度洗涤胚胎，每次10分钟，然后在68°C下用0.2X SSC溶液洗涤30分钟</li>
<li>在马来酸缓冲液（MAB）中于室温洗涤2次，每次10分钟</li>
</ol>
第三部分：抗地高辛（α-DIG）抗体孵育
（所需时间：3 小时以上用于封闭，以及过夜封闭，第二天再需 2.5 小时进行第四部分）
<ol start="13">
<li>将胚胎转移至12孔板中</li>
<li>在1-2 mL封闭液中室温下预封闭胚胎，至少3小时</li>
<li>同时，通过另取一份封闭液并将抗地高辛抗体按1:2000比例稀释于其中，对抗体进行预封闭</li>
<li>去除预封闭液，加入1-2 mL预封闭的α-DIG溶液，4°C孵育过夜</li>
<li>次日，用MAB缓冲液洗涤胚胎；先让胚胎在MAB中孵育5分钟，随后更换缓冲液，分别孵育两个10分钟、一个30分钟和一个60分钟。具体时间无需精确</li>
<li>用碱性磷酸酶（AP）缓冲液洗涤胚胎，每次5分钟，共洗涤3次</li>
</ol>
第四部分：染色与最终处理
（所需时间：染色需1小时至过夜，具体取决于所用的核糖探针；开始甘油洗涤前需4小时；每次甘油洗涤需6-10小时；可在甘油中保存）
<ol start="19">
<li>向胚胎中加入 1–2 mL 染色液，用铝箔包裹培养板，并定期（约每 20 分钟）检查染色情况，直至染色程度充分</li>
<li>用 PBSt 洗涤胚胎 2 次，每次 5 分钟，以终止染色反应</li>
<li>使用 PBSt 中的 25% 甲醇（1 次）和 50% 甲醇（2 次）各洗涤 10 分钟，然后用 100% 甲醇洗涤，以去除背景染色</li>
<li>让胚胎在 100% 甲醇中于室温孵育至少 2 小时</li>
<li>用 PBSt 中的 50% 甲醇（2 次）和 25% 甲醇（1 次）各洗涤 10 分钟进行再水化，然后用 100% PBSt 洗涤 2 次</li>
<li>将染色后的胚胎通过梯度洗涤转移至含 80% 甘油的 PBSt 溶液中，并于 4°C 保存</li>
</ol>
配方：
<ul>
<li>LB 琼脂平板——10 g LB 琼脂 + 250 mL 蒸馏水，高压灭菌，冷却至不烫手时加入 
250 μL 氨苄青霉素，将15–20 mL温热溶液倒入每个培养皿中，静置使琼脂凝固</li>
<li>LB 培养基 — 12.5 g LB 培养基粉末 + 200 mL 蒸馏水，高压灭菌，使用前冷却</li>
<li>1% TAE 琼脂糖凝胶——0.4 g 琼脂糖，40 mL 1× TAE 2 μL 溴化乙锭；上样 7 μL 质粒（靶cDNA的质粒转化）或 3 μL 核糖探针和 4 μL DEPC 水（原位 DIG标记的RNA探针合成）+ 1 μL 上样染料， 5 μL DNA 标准分子量标记</li>
<li>预杂交液 - 50% 甲酰胺，5× SSC，9.2 mM 柠檬酸，1% Tween-20</li>
<li>杂交液——预杂交液加 500 μg/ mL tRNA 和 50 μg/ mL 肝素</li>
<li>MAB- 100 mM 马来酸，150 mM NaCl，0.2 M NaOH，0.1% Tween-20，调至 pH 7.5</li>
<li>封闭液——3 份 MAB，1 份 MAB 中的 10% Boehringer 封闭试剂，1 份热灭活的羊血清</li>
<li>AP缓冲液——60 mM Tris-HCl（pH调至9.5），60 mM NaCl，30 mM MgCl2，0.1% Tween-20</li>
<li>染色液——AP缓冲液中的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐（BCIP）与硝基蓝四氮唑（NBT）</li>
</ul>
4. 代表性结果
当操作正确时，NBT、BCIP 与碱性磷酸酶之间的反应会形成紫色沉淀，应在斑马鱼胚胎上呈现为紫色染色。核糖探针应事先由目的基因对应的 cDNA 合成。因此，可以推断所观察到的任何染色区域均代表在该特定发育阶段目的基因发生转录的斑马鱼部位。本课程所用的核糖探针由以下基因的 cDNA 合成：aldh1a2（先前称为 raldh2；Begemann et al., 2001；图1）；fgf8a（Reifers et al., 1998；图2）；deltaC（Oates et al., 2005）；myod1（Weinberg et al., 1996）；shha（Krauss et al., 1993）；pax2a（Brand et al., 1996；图3）以及 myl7（先前称为 cmlc2；Yelon et al., 1999）。预期染色出现在中线及体节、尾芽、肌节、脑和心脏等解剖结构中。Ace/fgf8a 突变体预期在上述多种结构中存在缺陷。使用常规体视显微镜即可清晰观察染色结果。其他参考资料提供了与本文所述相似的WISH技术的更多细节及故障排除方法（Clark, 2003；D'Costa et al., 2009；Schmoldt et al., 2009；Schoenwolf, 2009）。
<img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig1.jpg" alt="胚胎发育阶段示意图；标注特征：后脑、眼睛、胸鳍原基。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1. 一条受精后24小时的斑马鱼胚胎，已与特异性针对aldh1a2的核糖探针进行杂交。可在眼睛、后脑、胸鳍芽原基和体节中观察到特异性染色。上为头端，下为尾端。
<img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig2.jpg" alt="胚胎脑发育示意图；标注：端脑、间脑、中脑-后脑边界。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2. 一条处于13体节发育阶段的斑马鱼胚胎，经fgf8a特异性探针杂交处理。可见端脑、背侧间脑、中脑-后脑边界、体节及尾芽部位有特异性染色。腹侧朝左，背侧朝右。
<img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig3.jpg" alt="胚胎脑发育，标记的显微图像，中脑-后脑边界，耳泡。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3. 受精后22小时的斑马鱼胚胎，已与针对特定基因的核糖探针进行杂交 pax2a，一种用于可视化神经系统的可靠标记物。可在脉络丛裂、中脑-后脑边界、耳泡和脊髓神经元中观察到特异性染色。背侧视图，左侧为头侧。

<ol><li>Albertson, R. C., Yelick, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+fgf8+signaling+in+left-right+patterning+of+the+visceral+organs+and+craniofacial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton.</a> Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).</li>
<li>Aramaki, M., Kimura, T., Udaka, T., Kosaki, R., Mitsuhashi, T., Okada, Y., Takahashi, T., Kosaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+expression+profile+of+chicken+CHD7%2C+the+ortholog+of+the+causative+gene+for+CHARGE+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+A+Clin+Mol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Embryonic expression profile of chicken CHD7, the ortholog of the causative gene for CHARGE syndrome.</a> Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 79, 50-57 (2007).</li>
<li>Begemann, G., Schilling, T. F., Rauch, G. J., Geisler, R., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+neckless+mutation+reveals+a+requirement+for+raldh2+in+mesodermal+signals+that+pattern+the+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish neckless mutation reveals a requirement for raldh2 in mesodermal signals that pattern the hindbrain.</a> Development. 128, 3081-3094 (2001).</li>
<li>Brand, M., Heisenberg, C. P., Jiang, Y. J., Beuchle, D., Lun, K., Furutani-Seiki, M., Granato, M., Haffter, P., Hammerschmidt, M., Kane, D. A., Kelsh, R. N., Mullins, M. C., Odenthal, J., van Eeden, F. J., Kane, D. A., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+zebrafish+genes+affecting+the+formation+of+the+boundary+between+midbrain+and+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations in zebrafish genes affecting the formation of the boundary between midbrain and hindbrain.</a> Development. 123, 179-190 (1996).</li>
<li>Clark, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClark%2C+M+%22In+situ+Hybridization%3A+Laboratory+Companion%22">In situ Hybridization: Laboratory Companion</a>. , Wiley-VCH. (2003).</li>
<li>D'Costa, A., Shepherd, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+development+and+genetics%3A+Introducing+undergraduates+to+developmental+biology+and+genetics+in+a+large+introductory+laboratory+class%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Zebrafish development and genetics: Introducing undergraduates to developmental biology and genetics in a large introductory laboratory class.</a> Zebrafish. 6, 169-177 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Emerging+Model+Organisms%3A+A+Laboratory+Manual%2C+Volume+1%22">Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 1</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2008).</li>
<li>Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2010).</li>
<li>Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+limb+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in limb organogenesis.</a> Organogenesis. 4, 109-115 Forthcoming.</li>
<li>Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M., Huang, R., Christ, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+somite+development%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in somite development.</a> Ann Anat. 190, 208-222 Forthcoming.</li>
<li>Huelsken, J., Behrens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The Wnt signaling pathway.</a> J Cell Sci. 15, 3977-3978 (2002).</li>
<li>Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+conserved+homolog+of+the+Drosophila+segment+polarity+gene+hh+is+expressed+in+tissues+with+polarizing+activity+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos.</a> Cell. 75, 1431-1444 (1993).</li>
<li>Oates, A. C., Mueller, C., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+function+of+deltaC+and+her7+in+anterior+segment+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cooperative function of deltaC and her7 in anterior segment formation.</a> Dev. Biol. 280, 133-149 (2005).</li>
<li>Pizard, A., Haramis, A., Carrasco, A. E., Franco, P., López, S., Paganelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridization+and+detection+of+RNAs+in+vertebrate+embryos+and+isolated+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2004).</li>
<li>Reifers, F., Bohli, H., Walsh, E. C., Crossley, P. H., Stainier, D. Y., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+is+mutated+in+zebrafish+acerebellar+%28ace%29+mutants+and+is+required+for+maintenance+of+midbrain-hindbrain+boundary+development+and+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf8 is mutated in zebrafish acerebellar (ace) mutants and is required for maintenance of midbrain-hindbrain boundary development and somitogenesis.</a> Development. 125, 2381-2395 (1998).</li>
<li>Schmoldt, A., Forecki, J., Hammond, D. R., Udvadia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+differential+gene+expression+in+zebrafish+to+teach+basic+molecular+biology+skills%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Exploring differential gene expression in zebrafish to teach basic molecular biology skills.</a> Zebrafish. 6, 187-199 (2009).</li>
<li>Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchoenwolf%2C+GC+%22Laboratory+Studies+of+Vertebrate+and+Invertebrate+Embryos%3A+Guide+and+Atlas+of+Descriptive+and+Experimental+Development%22">Laboratory Studies of Vertebrate and Invertebrate Embryos: Guide and Atlas of Descriptive and Experimental Development</a>. , 9th Edition, Pearson Education- Benjamin Cummings. Upper Saddle River, NJ. (2008).</li>
<li>Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somite+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Somite development in zebrafish.</a> Dev Dyn. 219, 287-303 (2000).</li>
<li>Weinberg, E. S., Allende, M. L., Kelly, C. S., Abdelhamid, A., Murakami, T., Andermann, P., Doerre, O. G., Grunwald, D. J., Riggleman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+zebrafish+MyoD+in+wild-type%2C+no+tail+and+spadetail+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of zebrafish MyoD in wild-type, no tail and spadetail embryos.</a> Development. 122, 271-280 (1996).</li>
<li>Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+expression+of+cardiac+myosin+genes+reveals+regulated+aspects+of+heart+tube+assembly+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish.</a> Dev. Biol. 214, 23-37 (1999).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

在比较脊椎动物生物学实验课程中，使用WISH技术帮助学生通过已知基因表达模式的可视化，理解遗传学在解剖发育过程中的作用。课程的第一部分，学生对代表多个不同脊索动物分类群的生物体进行解剖，从而有充足的时间学习、理解、比较和对比脊椎动物的解剖结构。
作为课程第二部分的引言，学生们接受了一次正式讲座，内容涉及斑马鱼的发育过程与解剖结构。讲座还讨论了WISH实验的方法及预期结果。随后，学生们获得了处于体节形成期和prim-6发育阶段，以及受精后2天和5天（dpf）的活体斑马鱼，并在解剖显微镜下进行观察。此举旨在帮助学生更深入地理解斑马鱼胚胎的外观特征，以及在个体发育过程中发生的各类形态学变化。
在下一次实验课中，学生将获得此前已进行过WISH（原位杂交）的斑马鱼胚胎。他们需要观察并描述每个目标基因（所使用的核糖探针）的基因表达模式。用于WISH的胚胎来自杂合子ace/fgf8a品系个体之间的交配。根据孟德尔遗传规律，来自ace/fgf8a交配的胚胎中，预计有25%为纯合突变体，并在本课程重点关注的多种解剖结构上表现出缺陷。根据已发表的文献和Albertson实验室的未发表观察结果，预计这些突变体会出现脑部发育异常、心脏环化异常，以及体节缺陷（Brand et al., 1996; Albertson and Yelick, 2005; 个人观察）。
要求学生观察每种基因表达模式所对应的所有标本，包括野生型（在发育早期阶段，杂合子动物与其野生型同胞无法区分）和纯合突变体。随后要求学生撰写实验报告，描述他们的观察结果，并结合解剖学和遗传学知识，分析异常的基因表达如何引发解剖结构的畸形。
学生们似乎对这项实验练习表现出兴奋和好奇。大多数学生以前从未使用过WISH技术，因此对课程的这一部分极为感兴趣。学生们发现斑马鱼胚胎中不同的基因表达模式十分有趣，有些人甚至将染色所呈现的图样与一些广为人知的图案和符号联系起来描述，例如笑脸。最终的实验报告表明，学生普遍理解了WISH实验流程以及基因在特定解剖结构中的表达情况。学生还被要求理解在实验中通过WISH所研究的各个基因的具体功能（Stickney et al., 2000；Huelsken et al., 2002；Geetha-Loganathan et al., 2008a；Geetha-Loganathan et al., 2008b）。然而显然，部分学生对相关信号通路和目标基因的背景知识较为有限。在今后的比较脊椎动物生物学课程中，若能在WISH技术的导论讲座中增加有关这些概念的讲解，或将有助于提升教学效果。
由于该实验方案通常需要连续四天完成，具体取决于课程安排，学生可能只能在课堂上完成部分实验，其余步骤必须由授课教师负责完成。在我们的比较脊椎动物生物学课程中，学生在实验室完成染色反应，而之前的所有步骤均由助教完成。如果希望学生在课堂上完成整套WISH实验，可根据课程的时间安排，将实验方案划分为若干子单元，在多个实验课中分步进行。如果学生无法完成全部实验流程（例如本课程因每周仅进行一次实验课而不具备可行性），则可以让学生在课上开始时加入染色液，并根据所使用的核糖探针，在一小时内完成染色。染色所需时间因不同的核糖探针及多种实验条件而有显著差异，应在课前预先确定。值得注意的是，如果学生仅在实验课中进行染色显影，则所有前期步骤均由教师负责，这将需要在课堂外投入大量时间和精力。如有需要，也可采用免疫组织化学作为WISH的替代方案，利用抗体标记来观察蛋白质的定位；但目前针对斑马鱼发育相关基因的特异性抗体尚不易获得。另一种选择是，在不同脊椎动物物种上进行WISH实验，让学生比较相同基因在不同生物体中的表达模式（Pizard et al., 2004; Aramaki et al., 2007; Emerging Model Organisms, 2008; Emerging Model Organisms, 2010）。
在比较脊椎动物生物学课程中使用WISH的总体目标是向学生展示如何利用分子生物学技术来研究解剖结构的发育过程。同时，这也为学生提供了思考基因表达改变如何不仅导致发育畸形，还可能引发进化变化的机会。这一研究领域被正式称为进化发育生物学（常简称为“evo-devo”），是一个快速发展的学科，旨在通过发育过程将基因型与表型联系起来，并阐明进化变化的潜在机制基础。随着该领域的兴起，越来越多的生态学家、生物整体学家和生理学家在其研究中采用分子技术。我们认为，在比较脊椎动物生物学课程中引入WISH技术有助于使课程内容紧跟当前科研技术与概念的进步，通过整合不同生物学分支，促进高年级生物学课程之间的横向衔接。此外，这种整合式教学方法将使学生能够在一门课程中学习多种生物学研究技术，从而获得更加多元化的教育体验，并推动未来跨学科科学研究的发展。

<table><tbody><tr><td>5 Prime 快速质粒小提试剂盒（100 次）</td><td>Fisher Scientific</td><td>2300000</td><td></td></tr><tr><td>One Shot TOP10 化学感受态 E. coli 菌株与 SOC 培养基 </td><td>Invitrogen</td><td>C404003</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-500</td><td></td></tr><tr><td>LB肉汤</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐 </td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Acros Organics</td><td>42383-0010</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 100 × 20 mm，未处理</td><td>实验室产品销售</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>14 ml 培养管，带卡扣盖</td><td>Fisher Scientific</td><td>1495911B</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶 &amp;缓冲液 &amp;amp; 10xBSA</td><td>New England Biolabs</td><td>有所不同</td><td></td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯（DEPC）25 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758-25mL</td><td></td></tr><tr><td>三水合乙酸钠 USP/FCC 500g</td><td>Fisher Scientific</td><td>s608500</td><td></td></tr><tr><td>Gal 200 proof 乙醇 </td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>Tris-乙酸-EDTA (TAE) 50倍浓缩液 1L</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp13321</td><td></td></tr><tr><td>低电渗琼脂糖 100 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-100</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭 10 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-E1510</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖凝胶上样染料 40% 蔗糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP655-1</td><td></td></tr><tr><td>1 kb 全量程 DNA 标准品</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2582200</td><td></td></tr><tr><td>DIG RNA标记混合物</td><td>罗氏集团</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA聚合酶</td><td>罗氏集团</td><td>1031163</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA聚合酶</td><td>罗氏集团</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA聚合酶</td><td>罗氏集团</td><td>810274</td><td></td></tr><tr><td>Protector Rnase抑制剂</td><td>罗氏集团</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I，无RNase，10,000单位 </td><td>罗氏集团</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 分子生物学试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>e5134-500G</td><td></td></tr><tr><td>氯化锂 100 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>L121100</td><td></td></tr><tr><td>碳酸钠 1 kg</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP357-1</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠，500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸 ACS 500 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>a38500</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛 R 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>o4042500</td><td></td></tr><tr><td>PBS 磷酸盐缓冲液 10X</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp3991</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 500 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp337500</td><td></td></tr><tr><td>甲醇 5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4124</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K 50 mg</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp170050</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺 1 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>F841</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC 1 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp13251</td><td></td></tr><tr><td>无水柠檬酸 ACS 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>a940500</td><td></td></tr><tr><td>V型核糖核酸转运</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>r7876-2.5KU</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠盐 50 mg</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp252450</td><td></td></tr><tr><td>马来酸 R 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>o3417500</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>s271500</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>s318500</td><td></td></tr><tr><td>封闭剂</td><td>罗氏集团</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>羊血清 500 ml</td><td>Invitrogen</td><td>16070096</td><td></td></tr><tr><td>抗 DIG-AP 片段</td><td>罗氏集团</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>2M Tris 溶液 500 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp1759500</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>m33500</td><td></td></tr><tr><td>BCIP 3 ml</td><td>罗氏集团</td><td>11383221001</td><td></td></tr><tr><td>NBT 3 ml</td><td>罗氏集团</td><td>11383213001</td><td></td></tr><tr><td>甘油 99% 2.5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC158920025</td><td></td></tr><tr><td>12 孔聚苯乙烯标准板（带盖）</td><td>VWR 国际</td><td>62406-165</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 螺口管，每架 50 个，每箱 500 个</td><td>实验室产品销售</td><td>L262861</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 螺口管，25 个/架，500 个/箱</td><td>实验室产品销售</td><td>L262890</td><td></td></tr><tr><td>1.6 ml 微量离心管 </td><td>实验室产品销售</td><td>L234401</td><td></td></tr><tr><td>2 Parafilm 2&quot; x 250 英尺</td><td>Fisher Scientific</td><td>s37441</td><td></td></tr><tr><td>7 ml 移液管 </td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1020-2520</td><td></td></tr><tr><td>.1-10 &amp;mu;l 移液器吸头，散装 </td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-3000</td><td></td></tr><tr><td>1-200 &amp;mu;l 吸头，散装 </td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-0006</td><td></td></tr><tr><td>101-1000 &amp;mu;l 移液器吸头，散装 </td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-2021</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>杂货店</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt;&lt;李&gt;高压灭菌&lt;/li&gt;&lt;李&gt;微型离心机&lt;/li&gt;&lt;李&gt;37&amp;#x00B0;C 型培养箱（带摇床）&lt;/li&gt;&lt;李&gt;4&amp;#x00B0;C 微型离心机&lt;/li&gt;&lt;李&gt;水浴锅&lt;/li&gt;&lt;李&gt;涡旋&lt;/li&gt;&lt;李&gt;凝胶电泳装置&lt;/li&gt;&lt;李&gt;-20&amp;#x00B0;C 冷冻室&lt;/li&gt;&lt;李&gt;-80&amp;#x00B0;C 冷冻室&lt;/li&gt;&lt;李&gt;摇床/振荡器&lt;/li&gt;&lt;李&gt;4&amp;#x00B0;C型冰箱&lt;/li&gt;&lt;李&gt;体视显微镜（最好配有教学屏幕或相机）&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

使用整体封片法 原位 将分子生物学与生物体生物学相联系的杂交技术

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

整体封片 原位 杂交（WISH）是分子生物学实验室中常用的一种技术，用于通过在整体标本中定位特定mRNA转录本来研究基因表达。该技术（改编自Albertson和Yelick，2005）曾在美国雪城大学高年级本科生《比较脊椎动物生物学》实验课程中使用。在《比较脊椎动物生物学》实验课的前三分之二阶段，学生主要通过传统解剖和使用模型，学习代表不同脊索动物分类群的多种生物的胚胎学和大体解剖学。课程的最后阶段则采用了一种创新的教学方法，即通过观察脊椎动物发育并结合分子技术来教授解剖学，其中包括对斑马鱼胚胎进行WISH实验。实验使用了成纤维细胞生长因子8a（fibroblast growth factor 8 a）杂合子fgf8a）突变品系， ACE，被使用。由于孟德尔遗传规律，ace 杂交产生了野生型、杂合子和纯合子 ace/fgf8a 突变体呈1:2:1比例。使用在中线以及发育中的解剖结构（如心脏、体节、尾芽、肌节和脑）中具有已知表达模式的RNA探针。采用13个体节期和prim-6期的斑马鱼进行WISH实验，学生在课堂上完成染色反应。通过对不同发育阶段斑马鱼胚胎的研究，学生能够观察这些解剖结构在个体发育过程中的变化。此外，部分 ace/fgf8a 突变体表现出心脏环化异常，以及体节和脑部发育缺陷。本实验课程的学生通过外部解剖结构及基因表达模式，观察了多种器官系统的正常发育过程。同时，他们还识别并描述了呈现异常解剖结构发育和基因表达的胚胎（即候选突变体）。
对于所在机构尚未配备必要设备，或实验与课程创新经费有限的教师而言，试剂和仪器的经济成本可能是需要考虑的因素，同时无论在何种教学环境下，教师所需投入的时间和精力也同样重要。然而，我们认为，在此类课堂实验环境中使用WISH技术，能够在发育遗传学与解剖学之间建立重要的联系。随着技术的进步，对生物体发育进行分子水平研究的能力正变得越来越容易、成本更低且日益普及，许多进化生物学家、生态学家和生理学家正转向分子生物学领域的研究策略。在比较脊椎动物生物学实验课堂中应用WISH技术，正是分子生物学与解剖学在单一课程中融合的一个实例。这为高年级大学生提供了实践现代生物学研究技术的机会，有助于实现教育的多元化，并推动未来跨学科的科学研究。

整体装片 原位 原位杂交（WISH）被应用于高年级本科生的比较脊椎动物生物学课程中，作为脊椎动物解剖实验的补充。这使学生能够在同一门课程中研究基因表达模式和宏观解剖结构，从而将分子生物学与个体生物学的学习相结合。

整体原位杂交（WISH）是分子生物学实验室中常用的一种技术，通过定位……来研究基因表达。

本实验的总体目标是观察斑马鱼胚胎在特定发育阶段的基因表达模式。该目标通过以下步骤实现：首先，将地高辛标记的反义RNA探针与目标MR mRNA进行杂交；第二步，检测该RNA探针。使用针对强力霉素的抗体，该抗体与碱性磷酸酶酶偶联。该实验步骤的第三步是通过加入NBT和BCIP进行染色，二者与碱性磷酸酶反应生成不溶性紫色沉淀。该实验步骤的最后一步是将染色充分的胚胎置于甲醇中孵育，以减少非特异性染色。最终，利用全胚胎原位杂交技术，可以获得在特定发育阶段斑马鱼胚胎中基因表达模式的结果。与传统的组织学课堂演示或解剖实验等现有方法相比，该技术的主要优势在于，它使学生有机会在分子生物学与生物体发育及进化趋势之间建立概念性联系，从而提供真正整合性的学习体验。尽管这些方法传统上被用于研究少数模式生物的发育过程，但它们也可轻松应用于其他非模式生物，以探究发育通路在脊椎动物类群中的保守性，以及这些通路在哪些环节发生偏离，从而导致进化上的新特征出现。该方法对本科生而言可能较为陌生，因此部分学生在初期可能会遇到困难，但掌握此方法将有助于他们在本科科研实践及高年级课程中取得良好进展。开始此操作时，使用移液管将约50个斑马鱼胚胎转移至一个微量离心管中。去除多余液体后，用移液器向管中加入1.5毫升4%多聚甲醛。将胚胎管置于室温下的振荡器上过夜。次日早晨，去除固定液并弃去。加入 1.5 毫升含 0.1% Tween 20 的磷酸盐缓冲液溶液以洗涤胚胎。如有必要，使用尖头镊子手动包埋胚胎，然后用移液枪将包埋好的胚胎转移至一个洁净的微量离心管中。接着向管中加入1.5毫升含25%甲醇的PBST溶液。孵育1小时后，在不扰动胚胎的前提下，尽可能吸除溶液。然后加入1.5毫升含50%甲醇的PBST，孵育至少一小时。最后，更换为1.5毫升100%甲醇，并置于-20摄氏度环境中。胚胎可在-20摄氏度的甲醇中长期保存。使用前，用移液器吸出管中的甲醇并丢弃移液头。向管中加入含50%甲醇的PBST，孵育10分钟。重复此步骤，进行第二次洗涤，然后吸去溶液，并用含25%甲醇的PBST重复孵育。最后，在100% PBST中清洗两次，每次10分钟。用PBST配制10%过氧化氢溶液。将斑马鱼胚胎浸入该溶液中，在室温下敞开通微量离心管管盖孵育10至20分钟，具体时间取决于胚胎的发育阶段。为去除深色色素沉着，使用移液器吸除并弃去过氧化氢溶液。用 1.5 毫升 PBST 多次冲洗胚胎，以终止反应。将 50 毫克/毫升的蛋白酶 K 储存液在 PBST 中按 1:5,000 比例稀释，通常为在 4.999 毫升 PBST 中加入 1 微升蛋白酶 K。移除胚胎中的PBST。使用移液管弃去液体，并向管中加入1.5毫升蛋白酶K溶液。将胚胎浸入蛋白酶K溶液中，在室温下处理3至15分钟，具体时间根据胚胎的发育时期而定。用PBST多次洗涤以终止反应。然后吸除PBST，将胚胎浸入4%多聚甲醛中，在室温下重新固定30分钟，用移液管吸除多聚甲醛并弃去。向胚胎中加入1.5毫升PBST，洗涤5分钟。小心地用移液器将离心管中的 PBST 吸出并弃去。再用另外两份体积的 PBST 重复洗涤。随后进行 rip 探针杂交，将水浴预热至 70 摄氏度，并配制预杂交溶液。然后使用移液管吸除并弃去 PBST。将胚胎浸入 0.5 毫升预杂交溶液中，在 70 °C 水浴中孵育 2 至 3 小时，注意不要扰动胚胎。用移液器将预杂交溶液从微型离心管中吸出并弃去。轻轻加入0.5毫升杂交溶液至管中。然后迅速加入先前合成的脱氧素至标记的核糖中。使用浓度约为每毫升一微克的管状核糖探针。在70摄氏度下孵育过夜。第二天，配制75%、50%和25%的PHS溶液，以及两倍浓度的柠檬酸钠盐水（SSC）和0.2倍浓度的SSC溶液。将更多溶液放入70摄氏度水浴中加热。当溶液温度达到70摄氏度时，从水浴中取出。然后吸除管中的杂交溶液并弃去。向每个样品中加入0.5毫升预热的P-H-S-S-S-C溶液，在70摄氏度下孵育胚胎10分钟。最后，将胚胎在0.2倍浓度的SSC溶液中于68摄氏度孵育30分钟。用移液器吸出离心管中的0.2倍浓度SSC溶液并弃去。将胚胎在 1.5 毫升 pH 7.5 的苹果酸缓冲液中室温孵育 10 分钟。重复此步骤，再次洗涤。根据书面实验方案配制封闭液。将MAB中的胚胎转移至12孔板的每个孔中。吸除多余的MAB，并向每孔加入一到两毫升封闭液。室温下振荡孵育至少三小时。用剩余的封闭液将抗原按一抗稀释比例1:2000进行稀释。室温下轻柔振荡孵育至少三小时。注意不要扰动胚胎。用移液器将孔板中封闭液吸出并弃去。轻轻加入先前配制好的含抗体和封闭液的抗脱氧剂，放入4°C环境中过夜孵育。第二天，用1.5毫升苹果酸缓冲液更换五次清洗胚胎。先将胚胎在苹果酸缓冲液中孵育5分钟，随后更换缓冲液，并继续孵育两次，每次10分钟。一个30分钟和一个60分钟的时间间隔。吸出孔中最后的甲酸缓冲液，弃去移液头。每孔加入1.5至2毫升碱性磷酸酶缓冲液，孵育5分钟。重复此步骤两次。移除碱性磷酸酶缓冲液，向各孔中加入1.5至2毫升染色液。用铝箔纸将整块板包裹以避光，并每隔20分钟轻轻振荡。停止振荡，在体视显微镜下观察胚胎，检查染色是否充分。当观察到染色充分后，用移液器将染色液从孔中移除并弃去。加入 PBST 以终止染色反应。用另一份PBST重复洗涤步骤，用移液器将PBST从孔中吸出并弃去，以使胚胎脱水。向孔中加入1.5至2毫升含25%甲醇的PBST，孵育10分钟。再用含50%甲醇的PBST重复此步骤两次，每次洗涤孵育10分钟。随后将胚胎转移至100%甲醇中，孵育至少2小时，以减少非特异性染色。孵育结束后，用移液器将孔中的甲醇吸出并弃去，以使胚胎重新水化。先用含50%甲醇的PBST洗涤两次，每次10分钟；接着用含25%甲醇的PBST洗涤10分钟。然后用100% PBST洗涤两次，每次10分钟。最后，通过梯度洗涤将染色后的胚胎转移至含80%甘油的PBST溶液中，并在4摄氏度下保存，直至观察。若操作正确，目的基因的表达将表现为斑马鱼胚胎上出现紫色染色。该图像显示的是受精后24小时的斑马鱼胚胎，已与针对AAL DH one A的特异性RIBA探针杂交，可在眼睛、后脑、胸鳍芽、体节及脊索等部位观察到特异性染色。此图像显示了一个处于13体节发育阶段的斑马鱼胚胎，该胚胎已与针对FGF8a的特异性探针进行杂交。在此情况下，特异性染色可见于外胚层、背侧神经管、中脑、后脑边界、体节以及尾芽。该图像还显示了一个受精后22小时的斑马鱼胚胎，该胚胎已与针对PAX2a的特异性探针进行杂交，该标记物强健，可用于可视化神经系统。掌握后，可在脉络膜裂、中脑、后脑边界、耳泡和脊髓神经元中观察到特异性染色。该技术可根据课程安排进行调整，分多次实验课完成。教师可能需要在课堂之外投入额外的时间和精力。观看本视频后，我们希望您能更加自如地将整体原位杂交和酵母双杂交技术引入本科生实验室。随着学生逐步掌握这些技能，了解该技术将有助于他们顺利过渡到高年级或研究生阶段的科研实践。

using-whole-mount-situ-hybridization-to-link-molecular-organismal

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用全山原位杂交分子和有机体生物学链接

本视频展示了双色整体原位杂交技术，该方法可用于在年轻的鸡胚中可视化两种不同基因的空间和时间表达模式。该方法最初由 David Wilkinson、Domingos Henrique、Phil Ingham 和 David Ish-Horowicz...

早期鸡胚双重整体原位杂交

整体原位杂交是发育生物学中最常用的技术之一。本文中，我们介绍一种高分辨率的双荧光原位杂交实验方案，用于分析单个基因的精确表达模式，并确定两个基因表达区域的重叠情况。我们同时包含碘化丙啶核复染步骤，以突出显示组织结构。...

斑马鱼全胚胎高分辨率双荧光标记 原位 杂交

介绍了一种结合多种技术的方法，以最大限度地从小鼠组织中收集数据。...

联合使用疏水性染料， 原位 杂交、免疫组织化学与组织学

整体封片 原位 E8.5 至 E11.5 小鼠胚胎的杂交

此处我们描述一种整体荧光标记方法 原位 杂交（FISH）方案，用于确定果蝇胚胎发育期间表达的RNA的表达与定位特性， 黑腹果蝇.

完整组织 RNA 荧光 原位 杂交检测 Drosophila 胚胎

通过结合RNA整体染色的方法 原位...

RNA 原位杂交在整装胚胎及细胞组织学中的应用：适用于海洋软骨鱼类

斑马鱼是一种小型热带鱼，已成为研究脊椎动物发育和疾病过程中基因功能的常用模型。通过以下方法可确定目标基因的时间和空间表达模式： 原位...

高分辨率整体成像 原位 斑马鱼胚胎杂交技术用于研究基因表达与功能

我们描述了一种多靶点显色整体原位杂交 原位 杂交（MC-WISH）过程在完整样本中 果蝇...

多靶标显色整体原位杂交 原位 杂交法用于比较基因表达区域 果蝇 胚胎

本视频文章详细介绍了一种简单直接的体内方法，可用于系统且高效地表征多种无脊椎动物胚胎中复杂信号通路和调控网络的组分。...

简约的力量：海胆胚胎作为 体内 用于研究复杂细胞间信号网络相互作用的发育模型

Astyanax 胚胎的整体原位杂交

学习全山原位杂交技术，用于观察斑马鱼胚胎发育阶段的基因表达模式。该方法将分子生物学与有机体发育相结合，为学生提供整合性的研究体验。

使用整体封片法原位将分子生物学与生物体生物学相联系的杂交技术

探索更多视频

使用整体封片法 原位 将分子生物学与生物体生物学相联系的杂交技术

探索更多视频

使用整体封片法原位将分子生物学与生物体生物学相联系的杂交技术