Name: 一个小鼠膀胱癌原位模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学习建立小鼠膀胱癌原位模型的方法，通过导管插入、局部烧灼和肿瘤细胞粘附技术，在雌性C57BL/6小鼠中实现肿瘤成功建立。该模型为膀胱癌治疗研究提供了可靠的实验平台。

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本工作由美国国家科学基金会职业奖（CBET-0846395）和杜兰大学比较医学系资助。

1. 动物
<ol>
	<li>雌性 C57BL/6J 小鼠（Mus musculus）在发货前经供应商检测确认无传染性外寄生虫、蠕虫内寄生虫以及17种小鼠病毒的抗体。小鼠饲养于杜兰大学经AAALAC认证的动物实验设施中，遵循 实验动物护理和使用指南.1 </li>
	<li>小鼠以每笼4-5只的密度群养于带有硬木垫料的独立通气聚碳酸酯笼具中，笼顶配有微隔离滤膜。自由提供颗粒状啮齿类动物饲料和自来水。</li>
	<li>小鼠在研究开始前需适应环境7天。</li>
</ol>
2. 细胞
<ol>
	<li>使用小鼠移行细胞癌细胞系 MB49 制备膀胱肿瘤。</li>
	<li>细胞在添加了 10% 胎牛血清、100 单位/毫升青霉素和 100 单位/毫升链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基中培养。</li>
	<li>培养物在 37°C 和 5% CO2 条件下维持，每两到三天更换一次培养基。</li>
</ol>
3. 动物原位肿瘤模型
本文所述的膀胱肿瘤模型灌注方法是对 Gunther 等人2所描述步骤的改进。
<ol>
	<li>使用2%异氟烷（MWI/VetOne，Meridian，ID，货号# 501017）与氧气混合诱导麻醉，并以0.75-1.25%浓度维持麻醉。（可同时处理多只动物，此时需提高异氟烷浓度。）为防止角膜干燥，应用人工泪液眼膏润滑眼睛。使用加热垫置于纸单下以维持体温。</li>
	<li>剪除下背部毛发以促进与金属接地板的接触，并在剃毛区域涂抹导电凝胶。</li>
	<li>将每只小鼠单独仰卧置于金属接地板上，使用已移除针芯的润滑型24号、3/4英寸套管针经尿道插入导管，进行膀胱插管。</li>
	<li>排空膀胱内尿液后，将一根铂金丝经导管插入膀胱，使导管两端均露出导线——导管腔内端露出约2 mm。选用铂金丝是因为该材料具有抗氧化特性。</li>
	<li>随后通过电凝装置接触导线外露部分，向膀胱施加2.5 W电流，持续约0.5秒。</li>
	<li>将导线移至膀胱内另一位置，并再次施加2.5 W电荷。</li>
	<li>取出导线后，用1 ml注射器将100 μl浓度为1×106 个细胞/ml的MB49细胞悬液经导管注入膀胱。</li>
	<li>注射器保持连接在导管上，以防止细胞悬液外流；插管小鼠继续维持麻醉状态90分钟，以使细胞充分附着于灼伤部位。</li>
	<li>恢复前，每只小鼠经腹腔注射100-200 μl无菌生理盐水。</li>
	<li>孵育期结束后移除导管，动物留在加热垫上恢复，直至翻正反射恢复，随后将小鼠放回原饲养笼中。</li>
</ol>
4. 超声
<ol>
	<li>在对小鼠进行膀胱超声检查以监测肿瘤生长之前，需让肿瘤生长 3-5 天。</li>
	<li>首次超声检查时，按上述方法对动物进行麻醉。将小鼠置于仰卧位，并通过剪除腹部毛发来准备皮肤。</li>
	<li>将一根 24 号静脉留置针经尿道插入膀胱。此时可引流膀胱并收集尿液以进行进一步分析。</li>
	<li>通过留置针向膀胱内注入 100 μl 无菌生理盐水，以提高超声下膀胱的可见度。</li>
	<li>在腹部涂抹超声耦合剂，然后进行超声检查，评估膀胱壁和膀胱腔的情况。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
接种后3-5天开始出现肿瘤组织。根据我们的经验，在12只小鼠的实验组中，通常有50%或更多的小鼠在第5天时可在膀胱内检测到组织肿块（体积为0.5 - 1.0 μl，采用公式 V=π/6·L·W·H 计算）。使用MB 49细胞时，肿瘤将持续生长，若不进行治疗，小鼠通常在第24天需要实施安乐死。当小鼠出现嗜睡或恶病质、毛发竖立、弓背、无反应行为，或体重减轻超过初始体重的20%时，建议实施安乐死。
肿瘤生长迅速，当质量达到200 mg或以上时，会出现坏死中心3，这显然是因为发育中肿瘤的细胞增殖速度超过了血管新生所能提供的血液供应能力。还可以通过血尿的程度间接监测肿瘤的进展，这可能与肿瘤内快速的血管新生有关。 consistently 观察到，未治疗的荷瘤小鼠在接种后第14天尿液中即含有血液。这些小鼠尿液中红细胞浓度随时间推移而增加，且收集到的尿液体积减少。超过50 mg的肿瘤通常在接种后14天左右即可相对容易地触及。

<ol><li>Institute of Laboratory Animal Resources. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%22">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals</a>. , National Academies Press. Washington, DC. (1996).</li>
<li>Gunther, J. H., Jurczok, A., Wulf, T., Brandau, S., Deinert, I., Jocham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+syngeneic+orthotopic+murine+bladder+cancer+%28MB49%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49).</a> Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).</li>
<li>Zhang, X., Atala, A., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression-targeted+gene+therapy+for+the+treatment+of+transitional+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Expression-targeted gene therapy for the treatment of transitional cell carcinoma.</a> Cancer Gene Ther. 15, 543-552 (2008).</li>
</ol>

动物实验严格按照杜兰大学机构动物护理和使用委员会制定的指南和规定进行。

这种在雌性小鼠中建立原位膀胱肿瘤的微创方法也可用于MB49以外的其他细胞类型，但应预期结果可能有所不同。当使用侵袭性较低的肿瘤细胞时，可略微增加功率（以0.5 W为增量确定新的最佳功率），从而产生更利于肿瘤细胞附着的区域；同时延长灌注细胞在膀胱内的孵育时间，将增加细胞在灼伤部位的附着量（未发表数据）。尽管某些方案建议使用10 W的电灼功率2，但该功率应视为上限，甚至应完全避免使用。当使用其他细胞类型时，增加接种细胞的浓度也可提高成功率。

<table><tbody><tr><td>C57Bl/6J 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>000664</td><td>3-5 周龄</td></tr><tr><td>聚碳酸酯笼具及通风笼架</td><td>Lab Products</td><td>Super Mouse 750</td><td>327 mm x&lt;br/&gt;190 mm x&lt;br/&gt;143 mm</td></tr><tr><td>硬木垫料</td><td>Harlan 实验室</td><td>实验室&amp;#8211;级 SaniChips</td><td></td></tr><tr><td>啮齿类动物饲料</td><td>Harlan 实验室</td><td>啮齿类动物饲料 2019</td><td></td></tr><tr><td>静脉导管</td><td>MWI 兽医用品公司</td><td>009231</td><td>24 G x &amp;#190; 英寸</td></tr><tr><td>电灼仪</td><td>Bovie 医疗公司</td><td>Aaron 900</td><td></td></tr><tr><td>超声设备</td><td>Sonosite</td><td>180 Plus (兽用)</td><td></td></tr><tr><td>MB49 细胞系</td><td>维克森林大学浸信会医学中心</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gemini Bio 产品公司</td><td>100106 500A57B</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr></tbody></table>

一种小鼠膀胱癌的原位模型

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

在此简便的操作过程中，通过导管插入、局部烧灼以及后续的细胞黏附，在雌性C57小鼠体内建立膀胱肿瘤模型。首先对小鼠进行经尿道导管插入并排空膀胱，随后再次插入导管，以便将铂金丝置入膀胱内，同时避免损伤尿道或膀胱。导管由聚四氟乙烯（Teflon）制成，可作为导线的绝缘层，使电流通过导线导入膀胱，造成局部烧伤。使用电灼装置向导线暴露端输送2.5 W功率，烧除膀胱壁的细胞外层，从而为后续经导管注入悬浮状态的癌细胞提供附着位点。细胞在膀胱内保留90分钟后，移除导管，使膀胱自然排空。通过超声成像监测肿瘤的形成过程。配套视频中特别详细展示了导管插入技术的操作要点。

通过导管插入、局部烧灼以及随后将癌细胞黏附至灼伤部位，可在雌性小鼠体内以微创方式建立膀胱肿瘤模型。

在此简单操作中，通过导管插入、局部烧灼以及...，在雌性C57小鼠体内建立膀胱肿瘤。

这是WT Godbe教授，我和Georgina Dobe博士希望介绍一种建立小鼠膀胱癌原位模型的方法。首先让我们介绍为实验动物进行术前准备的步骤。今天我们展示的小鼠为雌性C57黑鼠，购自杰克逊实验室。我们选择雌性小鼠，因为导管插入更为方便。这些小鼠年龄介于三到五周之间，体重通常在16至20克范围内。使用呼吸机进行麻醉，设置为以每分钟0.8至1升的流速输送含2%异氟烷的氧气。持续监测呼吸频率，以防止角膜干燥。在持续超过一个半小时的手术过程中，使用人工泪液眼膏直接涂抹于眼睛表面，然后轻轻将眼膏推入眼睛与皮毛之间，以保持眼部润滑。同时，剪除下背部的毛发，以促进其与金属接地板的良好接触，该接地板将在电灼术中使用，从而在膀胱内产生灼伤损伤。这些灼伤部位随后将作为接种肿瘤细胞的黏附位点，待肿瘤细胞注入膀胱腔后发挥作用。本方案中其余技术操作则主要依赖导管插入，我们采用24号静脉留置导管进行操作。在安全移除并丢弃探针后，使用如KY润滑剂或Astroglide等润滑剂对导管鞘进行润滑，以助于插入并防止尿道损伤。进行导管插入时，需用镊子固定外阴。插入导管时，必须注意尿道护理，并遵循导管插入技术，具体操作将详细展示。我们建议使用手术放大镜以使术野更加清晰。此处我们看到小鼠的外部盆腔解剖结构。现在我们所指示的是阴门，其围绕着尿道外口。进行导尿时，操作者往往倾向于将导管插入结构的中部，但尿道口实际上位于下方。我们发现，使用镊子夹住阴唇并轻轻将其向外上方翻卷，可使尿道更易于接触，这种方法更为简便。需注意避免将导管误插入尿道口正下方的阴道。 另一个需要注意的参数是导管插入的角度。通常的自然倾向是沿动物体长轴方向笔直插入。然而，在初始插入后，采用更陡的角度会使导管的进一步插入相对容易一些。然后可以减小导管插入的角度，以帮助防止对动物造成损伤。此处，Beck 博士以较陡的角度插入。请注意，导管将从阴门底部插入。有时旋转导管有助于润滑尿道并辅助插入；导管初步插入后，可减小插入角度，使其更平缓，从而直接插入膀胱。请注意熟练操作者所需的时间。然而，并非每次插入都需要这么长时间。在最佳情况下，该操作所需的时间如下。现在我们已经能够高效地对小鼠进行插管，接下来回到肿瘤细胞接种方案。下一步是排出膀胱中的大部分尿液，我们通过对手术区域施加轻柔压力来实现，使尿液经导管排出，导管末端可作为收集区域。随后将移除并引流导管。接下来，我们准备一根铂丝，用于向膀胱通入电流以诱导造成损伤。请注意，该铂丝末端带有一个钩状结构，用于测量目的。将导丝完全插入导管后，我们希望导管内侧有2至3毫米的导丝暴露。正是这一暴露部分会与膀胱壁接触并造成灼伤损伤。在完成小鼠插管后，我们将单独插入导丝。将导管略微向外抽出，以留出额外空间，使导丝能够从导管末端伸出，而不会刺穿膀胱。电流通过电灼装置输送。我们使用设定为2.5瓦特并处于凝固模式的

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医学

一个小鼠膀胱癌原位模型

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建立小鼠正位膀胱肿瘤模型：将癌细胞经膀胱内灌注植入小鼠膀胱的操作步骤

关键词：正位肿瘤模型，膀胱肿瘤，小鼠模型，膀胱内灌注，癌细胞植入

将肿瘤细胞植入其起源器官可作为评估新型疗法的一种有效临床前模型。MB49...

用于基因递送研究的原位膀胱癌模型

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小鼠膀胱肿瘤类器官的培养、操作及原位移植

学习建立小鼠膀胱癌原位模型的方法，通过导管插入、局部烧灼和肿瘤细胞粘附技术，在雌性C57BL/6小鼠中实现肿瘤成功建立。该模型为膀胱癌治疗研究提供了可靠的实验平台。

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