人外周血自然杀伤细胞的扩增、纯化及功能评估

本实验的总体目标是快速扩增大量人自然杀伤（NK）细胞。首先从血沉棕黄层或全血样本中分离外周血单个核细胞（pbmc）或NK细胞，然后将pbmc与人工抗原呈递细胞在NK细胞扩增培养基中进行共培养。

在培养基中添加IL-2，可维持NK细胞培养三周，期间每周使用aAPCs进行刺激，并注意将NK细胞数量控制在每毫升培养液不超过1×10⁶个。最后通过非放射性细胞毒实验验证扩增后NK细胞的功能活性。采用此扩增方案，通常在21天结束时可获得中位数达21,000倍的NK细胞扩增产量，这些细胞对多种肿瘤具有高细胞毒活性，该结果已通过钙释放实验确认。

这种医学方法有助于回答自然杀伤细胞（NK细胞）生物学领域的一个关键问题，因为历史上获取大量NK细胞非常困难。该技术对人类癌症的免疫治疗具有重要意义，因为生成足够数量的NK细胞用于此类治疗在历史上一直极具挑战性。演示该技术的将是本实验室的高级研究助理Cecily，她将从健康供体获取外周血单个核细胞（P BMCs）血液。

通常以血库的血沉棕黄层作为来源。首先，加入PBS将血沉棕黄层的体积调整至140毫升。然后，将35毫升样品叠加于15毫升Fial PA上，进行梯度分离离心，离心条件为400 ×g，20分钟。

不要中断操作。仔细从菲科帕（Ficoll-Paque）血浆界面处回收外周血单个核细胞（PBMCs），并将红细胞（RBCs）管留置备用。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤PBMCs三次，每次以400 ×g离心10分钟。

使用该部分外周血单个核细胞用于自然杀伤细胞扩增。现在返回梯度离心管，吸除上清液。

将红细胞转移至两个50毫升离心管中，用PBS洗涤至50毫升刻度线处。离心后，通过刮取红细胞层顶部去除上清液，以去除粒细胞。

进行三次洗涤后，将红细胞重悬于等体积的else's溶液中，并在4°C下保存，最长可保存一个月。该红细胞组分可用于在扩增两周后进行NK细胞的花环分离纯化。为了在体外高效扩增功能性NK细胞，使用表达膜结合型IL-21的K562克隆9细胞（下文简称K562细胞）。

使用九克隆IL-21作为人工抗原呈递细胞，首先计数外周血单个核细胞（PBMC），并计算出每5×10⁶个细胞所需的体积，用于自然杀伤（NK）细胞扩增。针对每5×10⁶个PBMC，照射10×10⁶个K562九克隆IL-21细胞。使用γ射线照射仪以100 Gy剂量进行照射，照射后的细胞也可冻存以备将来使用。随后用PBS洗涤预先照射的细胞，并将其重悬于NK细胞扩增培养基中。

现在将照射过的细胞与PBMC按2:1的比例加入40毫升NK细胞扩增培养基中，将T75培养瓶直立放置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。在第3天，通过400 × g离心5分钟收集活化的细胞，更换一半培养基为新鲜的NKEM，并继续培养。在第5天重复换液操作。一周结束时，计数细胞，留出5 × 10⁵个细胞用于流式细胞术表型分析，并进行第二次刺激计数，同时将K562细胞按1:1比例进行照射。

克隆九个IL-21细胞以扩增其细胞，然后将细胞加入NK细胞扩增培养基中，终浓度为每毫升2.5×10⁵个细胞。将细胞置于T75培养瓶中，在扩增第10天和第12天继续以每毫升2.5×10⁵个细胞的密度在NK细胞扩增培养基中传代培养。在扩增第14天，再次对细胞进行计数，并通过流式细胞术对部分样本进行表型分析。

使用玫瑰花结分离法（rosette SEP）纯化该源自PBMC的细胞扩增产物，并通过流式细胞术表型分析验证NK细胞的纯度。对纯化的NK细胞使用经辐照的K562克隆9.21细胞以1:1的比例进行第三次刺激。最后在第21天，采用完整的表型抗体组合通过流式细胞术分析扩增后的NK细胞。

将细胞冻存于含10% DMSO的FBS中，每管细胞密度最高不超过5 × 10⁷个细胞。细胞毒性实验可使用新鲜或冻存的NK细胞。若使用冻存NK细胞，需在实验当天先将细胞冻存管解冻，接种于NKEM培养基中，恢复培养24小时。取1 × 10⁶个靶细胞重悬于1 mL含钙的NKEM培养基中，于37°C孵育1小时，期间偶尔振荡。在U型底96孔板中，每孔加入200 µL浓度为1 × 10⁶个细胞/mL的NK细胞，设三个复孔，并按所示进行细胞系列稀释。

钙负载一小时后，用NK细胞扩增培养基将靶细胞洗涤两次，每次以400 ×g离心五分钟。重新计数靶细胞，并重悬于浓度为1 × 10⁵个细胞/毫升的培养基中。向96孔板的每孔加入100微升靶细胞，以100 ×g离心一分钟以启动细胞接触，随后在37°C、5% CO₂条件下孵育四小时。

为了均匀悬浮释放的钙，将细胞沉淀轻轻吹打混匀，在100 ×g条件下离心5分钟，然后小心吸取100微升上清液转移至新的平底96孔板中，注意避免产生气泡；如有必要，可用细针刺破可能形成的气泡。使用荧光酶标仪读板，设置激发滤光片为485纳米，发射滤光片为530纳米。

计算特异性裂解百分比。通常，从富集血层（buffy coat）中分离出的 5 × 10⁶ 个 PBMC 扩增后可获得 1 × 10⁹ 至 10¹⁰ 个 NK 细胞。扩增后的 NK 细胞表达多种 NK 细胞受体，其表达水平与富集血层中的未扩增原代 NK 细胞相当。

NK细胞可能占第14天外周血单个核细胞（pbmc）的2%至18%。通过Rosette SEP法纯化扩增的细胞，可在NK细胞纯度达到99%（由CD3指示）的条件下，回收培养物中40%至70%的NK细胞。CD56阴性但扩增后的NK细胞对多种肿瘤细胞系表现出细胞毒性，包括神经母细胞瘤、急性髓系白血病（AML）、骨肉瘤和黑色素瘤。

此处代表性 A ML 杀伤效应以特异性裂解百分比表示。实时 BIOT 视频展示了自然杀伤细胞对负载钙黄绿素的神经母细胞瘤细胞系 CHP 134 的杀伤过程。在此操作之后，还可进行其他方法，例如分析 NK 细胞的细胞因子产生，或在动物肿瘤模型中进行过继性转移实验，以进一步探究 NK 细胞功能的相关问题。

观看本视频后，您应能充分了解如何扩增和纯化大量自然杀伤细胞（NK细胞）。该过程可直接从外周血单个核细胞开始，随后纯化NK细胞；也可先通过花环法纯化NK细胞，再启动扩增。在实验初期，一份典型的血沉棕黄层可获得1500万至4000万个NK细胞，所有这些细胞均可用于通过本方法所述方案扩增出数量极多的NK细胞。