一种测量果蝇乙醇敏感性的简便方法

大家好，我是来自达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心精神病学系Adrian Rothenfluh实验室的Thomas Maples。今天我将演示一种测定果蝇对乙醇诱导镇静敏感性的简单方法。该检测基于果蝇在接触乙醇后失去攀附反射和行走能力的现象。

该方法可用于确定不同果蝇品系及突变体之间的酒精敏感性差异。我们还可以利用此检测方法诱导果蝇产生耐受性，即在反复暴露于酒精后，其反应性降低。现在开始操作。

进行本实验时，您将需要以下小瓶。其中装有八只果蝇，这些果蝇应为您在一天或两天前采集的样本。您可以使用雄性或雌性果蝇进行暴露实验。

然而，每个试剂瓶应仅包含一种性别。一个不含果蝇的空食物瓶、一把剃刀、两个由类似棉花的材料制成的瓶塞。如果您没有这种泡沫瓶塞，也可以使用棉球、带吸头的1000微升微量移液器、含有食用染料的纯度为200 proof的乙醇（可在任何杂货店购买）以及一个计时器。

首先，我们需要制作一个暴露室，用于将果蝇暴露于乙醇环境中并监测其活动能力。制作该暴露室时，先用剃刀片将一个瓶塞切成两半，然后将其中一半推入小瓶底部，覆盖在培养基上。

这将为果蝇提供一个平整且无黏性的行走表面。如果使用棉球，请将其平整地压紧，并尽可能使其不那么蓬松，以防止果蝇被棉纤维缠住。如果制备多个培养室，请确保每个培养室中的食物和试管塞所占空间相同。

这确保了每个暴露室中的果蝇所接触的乙醇体积相同。经过练习，可以轻松地同时处理三管果蝇。一旦暴露室制备完成，我们即可开始对果蝇进行乙醇暴露处理。

首先，将一个含有八只果蝇的小瓶转移至暴露室中，并用最初盛放果蝇的小瓶的塞子密封暴露室。接着，用移液器吸取500 µL你所选定浓度的染色乙醇，滴加到一个类似小瓶塞的棉质塞子的一端。然后，将暴露室的塞子替换为涂有乙醇的塞子，将涂有乙醇的一端插入暴露室内。

将乙醇浸润的塞子加入暴露室后，立即启动计时器。乙醇中的染料有助于确保乙醇面朝向暴露室内部，而非朝向小瓶的管壁。这一点尤为重要，特别是当使用棉球而非专用泡沫塞时，因为棉球的任意一侧均可能朝向管内。

在此暴露过程中，我们使用的是100%酒精，它正在扩散到暴露室中，果蝇通过空气吸入该物质。每次将涂有乙醇的塞子放入暴露室后，每隔一分钟，我们将统计有多少果蝇已变得静止不动，即无法翻身并行走。果蝇保持活动状态的时间越长，表明其在每一分钟时间点上的抗性越强。

轻敲装置所在的实验台以惊吓果蝇，确保所有能够活动的果蝇均开始移动。每次轻敲后观察果蝇10秒，使其有足够时间开始移动或翻转身体，每个时间点间隔为1分钟。记录实验开始时八只果蝇中有多少只处于静止状态。

大多数果蝇在受到惊吓后会迅速沿小瓶壁向上爬行。经过约6分钟的100%乙醇暴露后，它们开始行动迟缓，到12分钟时有时会出现不规则移动。大多数果蝇将处于静止状态，无法行走或从仰卧姿势翻身。

只有能够自行翻身并行走的果蝇才应被计为可移动果蝇；仅在原地活动腿部或翅膀的果蝇应被计为静止果蝇；在整个观察期间始终保持仰卧状态的果蝇也应被计为静止果蝇，因其无法自行翻身是中毒的表现。在整个10秒观察时间内持续剧烈振动翅膀的果蝇同样应被计为静止果蝇，即使其位置发生改变。这些果蝇在快速振翅的间隙绝大多数时间处于静止状态。

总之，能够翻身并行走的果蝇属于活动状态，而无法翻身、仅能原地活动腿和翅膀或快速振动翅膀的果蝇则属于静止状态。如果我们应用这些标准，会发现随着暴露于乙醇蒸气的时间（分钟）增加，更多的野生型果蝇会进入静止状态。该实验用于量化乙醇敏感性的指标是中位镇静时间（median sedation time, MST）。

我们将 MST 定义为暴露室中八只果蝇中有四只变为静止状态所需的乙醇暴露时间（分钟）。如果在某一特定观察时间点恰好有四只果蝇处于静止状态，则该值可直接确定。例如，若在暴露 11 分钟后恰好有四只果蝇静止不动，则 MST 为 11。

如果在暴露11分钟后恰好有四只果蝇处于静止状态，并且在12分钟时仍保持相同状态，则应取该时间点作为果蝇首次达到静止时间（ST）的值。若在某一观察时间点恰好没有四只果蝇静止，则需通过线性插值法计算四只果蝇达到静止状态的时间。例如，若在暴露9至10分钟之间，静止果蝇数量从三只跃升至五只，则可通过图形法确定平均静止时间（MST）为9.5分钟。以下通过本实验方法收集的数据表明，该实验设计是测量乙醇敏感性的准确方法。

以下实验使用了六至八管样品，具体数量在图示中标注。暴露于100%乙醇的雄性野生型果蝇的平均生存时间（MST）约为11分钟，标准误差较低。日间变异较小，大多无统计学显著性，但我们仍建议您在同一天平行测量实验组和对照组。

还需注意，A天和B天暴露处理的果蝇并非同一群体个体，而是来自相同遗传品系的兄弟姐妹。雄性和雌性果蝇在100%乙醇暴露下均未表现出平均存活时间（MST）的差异，但我们仍建议固定使用单一性别进行实验。

如果我们让雄性和雌性果蝇暴露于逐渐增加的乙醇剂量下，会得到一条良好的剂量-反应曲线，显示随着乙醇浓度的升高，运动抑制时间（MST）呈统计学显著下降。该检测方法还能重现先前发表的表型，这些表型是使用更复杂的乙醇汽化装置测得的：携带“right rabbit one”突变的果蝇表现出MST显著增加。这一增加在100%和90%乙醇浓度下均被观察到。

利用该实验方法，我们还可以在果蝇中诱导并测量乙醇耐受性。耐受性定义为：在预先暴露于乙醇以诱导耐受后，果蝇对乙醇的反应性降低。将一管果蝇暴露于乙醇中，时间约为其平均昏迷时间（MST）的两倍。

例如，我们将这些雄性柏林野生型品系果蝇暴露于100%乙醇中24分钟。处理后，轻轻敲击将八只果蝇重新送回其食物小瓶中，让其恢复4小时。在恢复4小时后，记录果蝇最初的MST值；随后将同一批果蝇再次暴露于相同剂量的乙醇中，并记录其第二次的MST值。

如图所示，果蝇在第二次接触乙醇时的昏迷时间（MST）显著长于第一次接触时的MST，表明果蝇已对乙醇的镇静作用产生了耐受性。耐受性的量化方法是：将同一管果蝇第二次的MST除以第一次的MST，再减去1，所得数值以百分比形式表示耐受性水平，在本例中约为50%。感谢观看，祝您的实验顺利成功。