莱姆病的病原体的蜱肠道内的快速传递和本地化的方法
2011年2月14日
莱姆病的研究往往需要一代感染的蜱与莱姆病螺旋体的病原体，这一过程通常需要几个星期的。在这里，我们展示了一个基于显微注射蜱感染过程，可在数小时内完成。我们也证明内蜱免疫荧光法在B的螺旋体原位本地化。
该程序的总体目标是在蜱肠道中显微注射和定位 Borrelia berg de ferry 细胞。这是通过首先准备玻璃毛细管针头并用 beberg de ferry 电池填充它们来实现的。接下来，通过显微注射将 beberg 延迟细胞转移到蜱肠道中。
然后解剖蜱虫并去除肠道组织。最后，对蜱肠道中的 beberg 延迟进行免疫荧光标记。最终，可以获得结果，证明使用共聚焦显微镜将 Beberg 定位到蜱肠道中的渡轮。
大家好，我是马里兰大学兽医系助理教授 Ruth Paul Paul 博士。今天，我的两位实验室成员 Toro Cairo（博士后研究员）和 Adam Coleman（研究生）将向您展示我们在实验室中经常进行的通过显微注射人工感染蜱虫的程序。显微注射后，我们将解剖蜱虫并使用共聚焦 CE 显微镜对蜱肠道中的细菌进行成像。
一代自然感染的蜱虫显微注射的主要优点是手术的持续时间长。显微注射将整个过程从数周缩短，因为通过自然摄食过程产生受感染的蜱虫大约需要五周时间。该技术还可以适用于注射其他有用的试剂，例如用于 RNAi 的双链 RNA 或用于蜱内特异性抗体干扰的抗血清。
通过在玻璃微移液管拉动装置中加热和拉动一毫米玻璃毛细管来开始制造几个显微注射针。小心地取出脆弱的毛细管。将汇集的针头尖端朝上存放在培养皿中的胶带上。
接下来，在 BSK 文化中种植 b berg de ferry 。培养基浓度为每毫升约 10 至 7 个细胞的 b berg de ferry 沉淀物，以 3000 倍 G 离心 10 分钟。在室温下，去除 snat 并将沉淀完全重悬于 BSK 培养基中，轻轻通过 200 μL 无菌微尖至终浓度为每毫升 10 至 9 个细胞。
由于细胞以高细胞密度重悬并且可能聚集在一起，因此应立即使用细胞悬液进行显微注射以制备蜱虫，将透明的双面胶带放在粘性垫上的载玻片上，小心地从容器中取出蜱虫 使用小刷子将所需数量的蜱虫注射到胶带腹侧朝上朝上朝上。将 5 微升 beberg de ferry 培养物加载到混合的毛细管针中。使用 20 微升微量移液器吸头，检查针头是否有残留的气泡，并重新装入针头中加入细菌培养物。
如有必要，在解剖双目显微镜下观察蜱虫，并专注于蜱虫的肛门孔径区域。轻轻触摸毛细管针的尖端，以打破直径略小于形成显微注射针的蜱肛孔直径的管子。这一步至关重要，因为任何试图用不合适的针尖注射蜱虫都会导致受伤和可能的死亡。
到注射的蜱虫。将固定的蜱虫放在解剖双目显微镜下，并聚焦在肛门孔上，该孔被两个可移动的肛门板覆盖。使用细镊子轻轻触摸并对肛门孔附近的任何区域施加非常轻微的压力。
这将允许分离肛门板并打开与肠道相连的肛门孔。小心地将针尖通过肛门板的强行打开轻轻插入肛门孔中。应尽量减少针头插入，因为玻璃尖端可能会损坏连接到直肠的半透明后肠。
使用配备自动脚踏控制的微型注射器使用以下参数注射 beberg de ferry 解决方案。1000 赫克托·帕斯卡 注射压力 0.2 秒注射时间，以及 8 赫克托·帕斯卡的补偿压力。每个蜱虫在显微注射后接受一次注射。
蜱虫应表现出运动或爬行的迹象，以响应类似于注射前的刺激。要解剖蜱虫以进行免疫荧光显微镜检查，首先将一滴磷酸盐缓冲盐水放在干净的载玻片上进行解剖，然后将另一滴磷酸盐缓冲盐水放在聚 L 赖氨酸涂层载玻片上 对于显微镜检查，请准备另一滴带有双面胶带的载玻片。接下来，从容器中取出蜱虫并将其放在双面胶带上。
在解剖显微镜下使用小刷子观察并聚焦在蜱虫上，将锋利的剃须刀片放在第一对和第二对腿之间的蜱虫上。用力向下按压，将蜱虫切成两块，露出腹部，立即使用细镊子将腹部浸入 PBS 液滴中。抓住切口部位周围的背侧和腹侧外骨骼。
小心地将背盾向上拉，远离蜱虫，露出棕色的肠道憩室。小心将解剖蜱虫始终保持在 PBS 下。半透明的唾液腺束位于肠道前部区域的两侧，如果需要，可以在此时移除。
用镊子将剩余的外骨骼固定到位，小心地将肠道从腹部拉出。通过去除任何滞留的组织（例如气管）来仔细清洁肠道。使用细镊子的尖端，将蜱肠道快速转移到聚 L 赖氨酸载玻片上的 PBS 液滴中。
使用细刀片或用细镊子的尖端轻轻按压，将内脏分成小块。小心吸出肠道组织周围多余的 PBS。让肠道组织在室温下风干。
将蜱肠浸入丙酮中 10 分钟，固定蜱肠。让它风干，室温玻片可以在零下 20 摄氏度的温度下在密闭容器中储存数月。对于肠道的免疫荧光标记，用巴氏笔或其他疏水屏障衬里装置在固定的蜱肠道周围画一个圆圈。
这将有助于在后续孵育步骤中保留染色溶液。用一滴或几滴封闭缓冲液覆盖蜱肠道 30 分钟。在室温下。
用于封闭的血清取决于抗体的宿主动物来源。不要让载玻片从这一点开始干燥。缓慢吸出封闭缓冲液。
用适当的一抗和/或二抗溶液孵育肠道。我们使用荧光素、异硫氰酸酯或 FXI 标记的抗 B 伯格抗体。在封闭缓冲液中以 1 至 100 的稀释度延迟抗体 1 小时。
在室温下，用铝箔盖住容器，以限制暴露在光线下。轻轻抽吸去除抗体溶液。用荧光染料孵育肠道以标记蜱组织，例如 DPI 或碘化丙啶。
我们通常使用 20 微克/毫升碘化哌碘化物的 PBS 溶液，在室温下洗涤 5 分钟，然后用 0.05% 吐温 20 的 PBS 溶液洗涤 3 次，每次 5 分钟。最后，将玻片安装在含有 Antifa 试剂的缓冲甘油中，并小心地盖上玻璃盖。滑玻片可以在此步骤中在 4 摄氏度下储存几个月，放在密封容器图像中，并在共聚焦显微镜下定位 b berg de ferry 。
这里显示了蜱显微注射，针头上装满了 kumasi 亮蓝色，以便可见。细镊子用于对身体施加温和的压力，从而分离肛门板并打开肛门孔进行显微注射。在这里，肠道憩室的前部区域显示在肠道内的 beberg 渡轮上。
肠核和螺旋体分别用碘化丙啶或 fitzy 共轭的抗 beberg 渡轮标记。一旦掌握，我们发现 10 个蜱虫可以被微注入能量，自然有十万只存活并感染了 fer。虽然蜱虫可以立即用于其他实验，但我们通常会等待一两天，以确保蜱虫在手术中存活下来，然后再进行。
观看此视频后，您应该对如何使用共聚焦免疫流在蜱肠道内通过微和局部屏障虫产生人工感染的蜱虫有很好的了解。在工作时，与蜱虫和充满人类病原体（如 brelia brior fry）的细玻璃针进行微工作可能会很危险。注意蜱虫和针的位置，并始终采取生物安全 2 级预防措施。
感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概览
本研究提出了一种基于微注射的方法，用于感染带有烈厄氏螺旋体的蜱虫，显著减少了蜱虫感染所需的时间。此外，还展示了一种用于定位病原体在蜱虫组织中的免疫荧光技术。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 媒介生物学
- 病原体定位
背景
- 莱姆病由烈厄氏螺旋体细菌引起。
- 蜱虫是传播该病原体的主要媒介。
- 传统的蜱虫感染方法耗时较长。
- 快速感染方法可以提高研究效率。
研究目的
- 开发一种更快的方法用于感染蜱虫烈厄氏螺旋体。
- 能够在蜱虫组织中原位定位病原体。
- 提高对蜱虫-病原体相互作用的理解。
所用方法
- 制备用于微注射的玻璃毛细管针。
- 将烈厄氏螺旋体细胞微注射到蜱虫肠道中。
- 解剖蜱虫以分离肠道组织。
- 对肠道组织中的烈厄氏螺旋体进行免疫荧光标记。
主要结果
- 成功地将烈厄氏螺旋体微注射到蜱虫肠道中。
- 通过免疫荧光展示了病原体的有效定位。
- 结果使用共聚焦显微镜进行可视化。
- 该方法显著缩短了蜱虫感染的时间。
结论
- 微注射技术是蜱虫感染的可行替代方法。
- 免疫荧光允许精确定位病原体。
- 这种方法可以促进莱姆病传播的进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid and controlled infection of tick vectors with Borrelia burgdorferi enables efficient study of pathogen-vector interactions critical for Lyme disease research. This microinjection approach reduces infection timelines from weeks to hours, supporting high-throughput screening and mechanistic de-risking in early discovery. The method provides reproducible pathogen delivery, enhancing predictive confidence in target validation and assay development workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Borrelia burgdorferi-tick gut interactions to validate therapeutic targets involved in pathogen persistence and transmission.
- Operational Value: Delivers standardized pathogen loads across tick cohorts, reducing variability in infection models and improving assay reproducibility.
- Predictive Value: Supports functional target de-risking by allowing controlled exposure to pathogen strains, including those attenuated in murine models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates infected tick tissues suitable for downstream immunofluorescence and confocal imaging assays to quantify pathogen localization and burden.
- Operational Value: Produces quantifiable, microscopy-ready outputs that enable standardization of pathogen detection readouts across screening campaigns.
- Scalability: Facilitates preparation of large numbers of uniformly infected ticks, supporting assay reproducibility and platform reuse in vector-based screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides a disease-relevant system for studying Borrelia burgdorferi localization in the tick gut, bridging in vitro findings to vector-based pathophysiology.
- Mechanistic De-risking: Enables visualization of pathogen distribution within tick tissues, informing hypotheses about tissue-specific virulence factors and transmission mechanisms.
- Preclinical Model Refinement: Supports risk-adjusted advancement decisions by delivering consistent pathogen exposure for evaluating intervention efficacy in tick-borne disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation by enabling rapid generation of infected tick vectors and standardized pathogen localization readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of pathogen-vector interactions by delivering controlled quantities of Borrelia burgdorferi to the tick gut for mechanistic interrogation.
- Screening: Produces standardized, infected tick tissues suitable for quantitative immunofluorescence assays, enhancing reproducibility in pathogen detection workflows.
- Analytics: Generates confocal microscopy-based readouts of pathogen localization and burden, enabling comparative analysis across experimental conditions and interventions.
- Translational Research: Connects in vitro pathogen culture to tick tissue localization, supporting biomarker alignment and pathophysiological relevance in vector-borne disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for infecting ticks with diverse biological agents, including antibodies and RNAi reagents, extending utility beyond Borrelia burgdorferi studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in pathogen-vector interactions through localized pathogen detection.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of tick infection models, reducing time and resource investment compared to natural feeding methods.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency in early discovery by providing rapid, standardized pathogen exposure models for target de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of Lyme disease research initiatives through reliable, high-fidelity infection models that reduce biological variability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection techniques, tick handling, and confocal immunofluorescence microscopy.
- Depends on glass capillary needle preparation, microinjector instrumentation, and fluorescence microscopy infrastructure.
- Necessitates standardization of injection parameters and gut dissection protocols across teams to ensure consistent pathogen delivery and localization readouts.
- Adaptation to different tick species or pathogen strains may require optimization of needle size, injection pressure, and bacterial concentration.
- Practical limitations include the technical skill required for successful microinjection and gut dissection, as well as the need for biosafety level two containment when handling human pathogens.
