Name: 腹股沟淋巴结的活体显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-04T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 学习活体显微镜技术观察小鼠腹股沟淋巴结微血管结构，通过制作皮肤瓣和清除脂肪组织实现实时成像。该方法适用于免疫学和血管生物学研究，可评估血管功能变化。

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本工作由加拿大卫生研究院、加拿大创新基金会、不列颠哥伦比亚大学血液研究中心以及北不列颠哥伦比亚大学资助。

1. 试剂准备
<ol>
<li>实验过程中所需的所有试剂应在开始手术操作前预先配制。请注意，所有溶液均采用无菌技术制备。</li>
<li>生理盐水溶液（PSS）最好分为两种组分配制：基础盐溶液和碳酸氢钠溶液。将这两种溶液均配制成20倍浓度，并于4°C保存。20倍浓度的碳酸氢钠溶液为360.0 mM NaHCO₃。3 （84.01 g/mol）以及20倍浓度的基础盐溶液为2638.0 mM NaCl（58.44 g/mol）、94.0 mM KCl（74.56 g/mol）、40.0 mM CaCl2•2H2O（147.02 g/mol）和 23.4 mM MgSO₄4•7H2O（246.48 g/mol）。溶液应使用dH₂O配制。2O 和化学品应逐个加入，并在加入下一种化学品之前搅拌至溶液澄清</li>
<li>通过等体积混合碳酸氢钠溶液和基础盐溶液，并稀释至1X浓度，制备2L PSS（配制2份2L PSS时，将各100mL的碳酸氢钠溶液和基础盐溶液加入去离子水中并定容）2O</li>
<li>将装有PSS和PSS的2L容量瓶置于37°C水浴中。用5% CO₂平衡溶液2 / 手术开始前，用氮气平衡1小时。</li>
<li>血管活性化学物质（例如：去甲肾上腺素、乙酰胆碱、硝普钠）最好用dH2O配制成1 M浓度，分装为100 μl等份，于-20 °C保存。</li> 
</ol>
2. 动物准备
<ol>
<li>称量小鼠体重，并通过腹腔注射给予戊巴比妥钠初始剂量（90 mg/kg）。在操作过程中，需持续通过夹趾反应和仔细观察呼吸频率来监测麻醉深度。根据需要追加戊巴比妥钠（20 mg/kg）以维持麻醉状态。麻醉的手术平面应依照北不列颠哥伦比亚大学动物护理与使用委员会（ACUC）批准的动物护理方案中规定的联邦和机构法规予以维持。</li>
<li>使用剃毛器去除腹部及侧腹/髋部区域的毛发，再用酒精棉片擦拭，并用胶带轻粘以清除残留的松散毛发。由于本实验为终末性操作，此处理步骤已足够。</li>
<li>将小鼠仰卧置于透明手术板上，并用胶带将每只脚掌固定于板上。通过外部加热灯维持体温，并使用直肠温度计进行监测，以防止因麻醉导致低体温。</li> 
</ol>
3. 手术步骤
<ol>
<li>在整个手术过程中，确保暴露的组织始终用平衡并预热的PSS溶液进行表面灌注。同时，必须避免手术器械接触目标血管，或在操作淋巴结周围的脂肪组织和结缔组织时对血管施加过大压力而造成损伤。</li>
<li>将小鼠置于解剖显微镜下，在腹腔腹侧中线处做一切口，并将皮肤向小鼠脊柱方向牵开。</li>
<li>当皮肤被充分牵开、淋巴结清晰可见时，将皮肤固定在透明Sylgard 184基座上。</li>
<li>去除覆盖在淋巴结周围区域的薄层结缔组织。</li>
<li>清除覆盖并包围淋巴结的脂肪组织，直至显露出微血管床。主要的动脉段位于淋巴结旁侧，通常被小静脉覆盖。整个手术过程约需30分钟。</li>
</ol>
4. 成像与血管分析
<ol>
<li>当目标血管段在解剖显微镜下暴露后，将其固定于活体显微镜上。注意在整个实验过程中，动物始终置于透明手术板上，并放置于活体显微镜下。体温通过加热灯维持，并如手术部分所述，经直肠温度计测量。麻醉深度亦按照2.1节所述在整个实验过程中持续监测。</li>
<li>安装灌流和吸引管路。PSS 灌流由储液瓶通过重力供给，流入经水浴夹套加热的储液器（水浴夹套由循环水浴加热并循环供水），并以 5% CO₂ 预饱和2 平衡氮气，并以10 ml/min的流速通过滴注管持续灌流PSS。应使用吸液管持续将灌流后的PSS从标本周围吸走。注意，在实验前需彻底清洁吸液管和水浴夹套，并在每次实验后妥善保存，以确保下次实验前的无菌状态。</li>
<li>检查灌流PSS的温度。调节循环水浴的温度和/或PSS灌流速率，使标本周围的温度达到约37°C。</li>
<li>让血管在PSS中平衡至少60分钟，并使用视频测径器量化血管直径。通常应在多个时间点（例如40、50和60分钟）测定血管直径，以确保血管已达到稳定状态。</li> 
<li>使用平滑肌特异性激动剂（例如去氧肾上腺素，PE）和内皮细胞特异性激动剂（例如乙酰胆碱，ACh）评估血管的健康状态。激动剂的浓度应根据具体激动剂进行调整，但对于PE和ACh，应通过累积添加（10⁻⁵ M至10⁻⁹ M）至灌流液中，逐级测定血管反应。每次激动剂作用后需用PSS充分洗涤（通常为30分钟），直至血管恢复至静息直径，再进行下一次给药。</li>
<li>在评估血管健康状况后，可进行后续的血管活性药物实验、荧光标记以及细胞示踪实验。</li>
<li>实验结束后，给予动物过量的戊巴比妥钠。随后观察动物对脚趾夹捏是否无反应，并确认无呼吸运动或心跳。在此情况下，继之以颈椎脱位处死。</li> 
</ol>
5. 代表性结果：
经过平衡期后，制备样本应呈现出清晰的图像，能够辨识出供应腹股沟淋巴结的微动脉和微静脉。血管周围应仅有少量脂肪细胞，以便清晰观察微动脉和微静脉的管壁，从而准确叠加视频测径工具以计算血管直径。成功制备的关键在于：微动脉管腔内应有丰富的血流通过，且血管具有明显的张力（即微动脉能够分别对平滑肌和内皮特异性激动剂产生收缩和舒张反应）。
<img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig1.jpg" alt="显微镜下的植物组织；细胞结构、维管组织、木质部、韧皮部、生物学研究。" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图1"> 图1. 腹股沟淋巴结小动脉（红色箭头）的活体显微镜图像，该小动脉向淋巴结供血，淋巴结已与生理盐水溶液平衡，并与主静脉（绿色箭头）并行走行。
<img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig2.jpg" alt="血管收缩百分比与苯肾上腺素浓度关系图；剂量-反应；数据分析；药理学。" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 2"> 图 2. 通过逐步增加生理盐水中苯肾上腺素（PE）浓度（从 10-9M 至 10-5M）灌流，观察到正常的血管活性反应。明显的血管收缩提示微动脉中平滑肌功能正常。
<img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig3.jpg" alt="乙酰胆碱浓度与血管扩张关系的剂量-反应曲线图，显示呈S形曲线的数据。" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图3"> 图3. 通过逐步增加生理盐水中乙酰胆碱（ACh）浓度（从10-9M至10-5M）所诱导的正常血管活性反应。明显的血管扩张提示微动脉中存在正常的内皮功能。

<ol><li>Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arteriolar+network+architecture+and+vasomotor+function+with+ageing+in+mouse+gluteus+maximus+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle.</a> J Physiol. 561, 535-545 (2004).</li>
<li>Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+expression+and+conducted+vasodilation+along+arteriolar+endothelium+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).</li>
<li>Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+inhibits+conducted+vasodilation+through+endothelium-derived+NO+production+in+arterioles+of+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle.</a> Faseb J. 18, 280-286 (2004).</li>
<li>Smeda, J. S., Payne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+autoregulatory+and+myogenic+function+in+the+cerebrovasculature+of+Dahl+salt-sensitive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats.</a> Stroke. 34, 1484-1490 (2003).</li>
<li>de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+anatomy+of+the+hamster+retractor+muscle+with+regard+to+its+microvascular+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer.</a> Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).</li>
<li>Domeier, T. L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromechanical+and+pharmacomechanical+signalling+pathways+for+conducted+vasodilatation+along+endothelium+of+hamster+feed+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries.</a> J Physiol. 579, 175-186 (2007).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

腹股沟淋巴结的活体显微成像技术可实现对淋巴结微血管系统的可视化观察 体内因此，该方法可实现直接、实时的观察。淋巴结微血管系统的成像提供了一个独特的位置，可用于研究免疫反应与血管系统之间的相互作用。利用该制备方法，可针对性地聚焦于免疫反应、血管系统的改变，或二者之间的相互作用。
与所有实验方法一样，标准活体显微镜技术既有优势，也存在局限性1,2,3,4,5,6,7标准体外显微技术（IVM），例如本文所述的制备方法，易于进行修改，作者此前已证明可通过引入荧光示踪染料或标记的细胞群体，实现落射荧光显微镜观察1,2,3,4,5,6,7尽管标准的IVM无法提供双光子显微镜或血管造影所能实现的三维成像与追踪功能，但仍可在二维层面实现细胞追踪，从而观察并量化细胞间以及细胞与血管系统之间的相互作用，并结合 体内 给药后使用荧光抗体进行染色，可用于实时获取蛋白质/标志物表达的数据1,2,3,4,5,6,7.
值得注意的是，其他成像技术通常需要静态环境以获取图像，常需夹闭手术区域或在平坦的标本上加盖盖玻片。这在很大程度上甚至完全限制了对样本主动灌注血管或其他介质以评估血管完整性与生理功能等操作，也限制了在体内显微镜（IVM）标本中开展其他技术的应用，例如传导性血管舒张实验2,3,4,6,7。此外，标准的IVM技术不要求标本完全平坦，也不受动物呼吸等运动的影响1,2,3,4,5,6,7。这使得标准IVM技术可用于更多类型的手术区域，并具有更高的可重复性。本文所述的腹股沟淋巴结标本即为一例。鉴于淋巴结的大小和形状，若不损伤组织则无法将其制备成平坦状态，且其位置会因动物呼吸而产生显著运动。此类问题在其他方法中难以克服，但采用本文所述的标准IVM标本制备方法则可轻松应对。
总之，上述制备方法可与多种其他生化、血管和/或免疫学技术联合使用，例如转移活化的或标记的细胞亚群、诱导缺氧状态，以及血管介质的过表达或耗竭。然而，额外的应用取决于初始制备物的健康状态。因此，必须始终检测被成像和评估的血管系统的健康状况。获得健康制备物的关键要点包括：确保制备物在体温条件下持续用平衡的PSS灌注，并在手术过程中尽量减少对手术区域的接触和机械刺激。

<a href="https://app.jove.com/t/6652">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/2551">10.3791/2551</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/2551">Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node</a>. The Authors&#160;and Discussion&#160;sections were&#160;updated.

Erratum: Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

<table><tbody><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硝普钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>去氧肾上腺素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙酰胆碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>七水合氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

腹股沟淋巴结的活体显微成像

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

遍布全身的淋巴结（LN）是免疫系统的重要组成部分。它们是诱导适应性免疫应答以及效应细胞发育的场所，因此在抵抗病原体入侵和维持机体健康方面发挥关键作用。研究中淋巴结的选择取决于其可及性及所需的研究模型；其中，腹股沟淋巴结位置适宜，非常适合用于皮肤和生殖道黏膜感染等具有生物学意义的模型研究1。
腹股沟淋巴结（LN）与其他所有淋巴结一样，具有丰富的微血管网络为其提供血液供应。通常情况下，该微血管网络包括淋巴结的主要供血小动脉，该小动脉随后分支并供应高内皮微静脉（HEVs）。HEVs 的结构特化，可在稳态和感染期间促进免疫细胞向淋巴结内的迁移。在上述两种情况下，HEVs 如何调控免疫细胞进入淋巴结，是当前深入研究的领域。淋巴结供血小动脉对 HEVs 具有直接的上游调控作用，同时也是富含营养物质和免疫细胞的血液进入淋巴结的主要来源。此外，供血小动脉的变化被认为在促进适应性免疫应答的启动中发挥重要作用1。淋巴结微血管系统在维持淋巴结最佳血液供应以及调控免疫细胞流入方面具有显著重要性，这些因素是淋巴结正常功能及后续免疫应答的关键组成部分1。
研究淋巴结微血管的能力 体内 对于阐明免疫系统与LN内微血管系统之间如何相互作用并彼此影响至关重要。在此，我们介绍一种方法 体内 腹股沟淋巴结成像。我们重点关注淋巴结微血管系统的成像，特别强调确保研究健康血管的方法、长时间维持活体血管成像的能力，以及血管程度的量化分析。同时介绍了通过微血管灌注血管活性药物的方法，以及追踪和量化细胞迁移的潜力。
腹股沟淋巴结的活体显微镜检查可直接评估微血管功能，并实时观察免疫细胞、淋巴结与微循环之间的直接相互作用。该技术有望与其他多种免疫学技术、荧光细胞标记方法相结合，并可进行调整以研究其他淋巴结的血管系统。

一种用于腹股沟淋巴结（LN）活体显微观察的技术方案被概述。该技术可实现对淋巴结的实时、 体内 在稳态和感染期间对淋巴结微血管系统及结构的研究。该技术可适用于细胞迁移研究以及其他淋巴结部位的分析。

淋巴结（LN）遍布全身，是免疫系统的重要组成部分。它们是适应性免疫应答诱导的场所……

本实验的总体目标是活体可视化并评估小鼠腹股沟淋巴结的供血动脉。首先通过精细解剖小鼠腹股沟区域覆盖腹股沟淋巴结的皮肤，制备皮瓣；随后分离覆盖在淋巴结区域上方的结缔组织，以实现上述目标。接下来，必须去除周围的脂肪组织，以暴露淋巴结的供血动脉血管系统。最后，通过活体显微镜技术P观察和评估淋巴结血管系统的变化。尽管如此，今天您将看到的制备样本为腹股沟淋巴结微循环。该手术技术也可用于其他组织的制备，例如骨骼肌以及脑组织。通常情况下，初学者在操作此技术时会面临两个主要困难。其一，是因为操作对象是活体动物；其二，是因为手术操作区域非常小，任何对血管本身或周围组织的干扰都可能产生负面影响，从而损害实验的顺利进行。因此，对该技术进行直观的演示对于成功实施至关重要。该技术涉及多个复杂的步骤，仅通过文字描述很难准确掌握实际操作要领。正确实施该技术的关键在于直观观察，以确保操作准确无误，并取得良好效果。首先对小鼠进行麻醉，并剃除手术区域的毛发。具体细节请参见文本稿件。然后可将小鼠以仰卧位固定于透明手术板上。用胶带将小鼠的每个脚垫固定在板上。实验前一天，根据制造商的说明配制thes guard 180 4。然后，使用标准的一次性培养皿作为模具，将混合物倒入约四分之一英寸深，静置过夜使其固化。将thes guard从培养皿中取出，并放置在手术板上。将脱毛并麻醉的小鼠置于解剖显微镜下。使用5号不锈钢镊子和直剪刀、弹簧剪，在腹腔腹侧表面沿中线做切口。然后将中线切口向四肢方向斜向延伸，并将皮肤向脊柱方向牵开。当腹股沟淋巴结清晰可见后，使用不锈钢昆虫针和环氧涂层不锈钢镊子将回缩的皮肤固定在180 4基座雪茄上。向该区域添加生理盐水溶液或PSS。接下来，去除覆盖在淋巴结周围区域的薄层结缔组织。用镊子小心夹起小块结缔组织，并从淋巴结周围剥离。使用弹簧剪刀清除覆盖并包围淋巴结的脂肪组织，直至暴露微血管床。在此步骤中，必须小心谨慎，避免手术器械接触目标血管，或在操作周围组织时因用力过大而损伤血管。清除淋巴结周围的脂肪组织时，应先松解结缔组织，用镊子夹住脂肪组织，然后轻柔地将其移除，直至视野清晰。一旦去除结缔组织和脂肪组织，即可观察到邻近淋巴结的主要动脉段及其上方伴行的静脉。在体视显微镜下暴露感兴趣的血管节段后，将其固定在活体显微镜上。设置灌流和吸引装置。在该操作步骤期间，必须始终用平衡好的PSS溶液对暴露的组织进行灌流。通过重力作用实现生理盐溶液（PSS）的灌流。将溶液从初始储液罐导入经水浴加热的储液罐，该储液罐由含5%二氧化碳的氮气平衡气体进行灌注，随后以每分钟10毫升的速率经滴管流入。应使用吸液管，将其置于皮瓣底部，持续将灌流后的PSS从标本处吸走。随后应检查并调节循环水浴的温度以及PSS灌流速率，以达到约36摄氏度的最佳温度。在整个制备过程中，让血管在PSS中平衡至少60分钟。使用直肠温度计监测动物体温，防止低体温，并提供外部加热灯保温。在PSS平衡期间，测量血管直径。使用视频测径器在多个时间点进行测量，以确保血管达到稳定状态；稳定状态的定义是血管直径在 20 分钟内保持在 ±5 微米范围内的恒定值。直径测量数据通过 Chart Lab 软件记录在计算机上。在平衡期结束后，使用平滑肌特异性激动剂（如去氧肾上腺素）评估血管的健康状况，此处以去氧肾上腺素为例。将激动剂加入到suse中。每次应评估八种激动剂，在每次给予激动剂之间，激动剂的累积浓度按对数递增。每次给予激动剂后，应使用PSS进行30分钟的洗涤期，或持续至血管恢复至静息直径。以下是腹股沟淋巴结在平衡期后的代表性结果。用生理盐水灌注动脉可获得清晰的图像，能够识别出由红色箭头指示的供血动脉和由绿色箭头指示的引流静脉，二者共同为腹股沟淋巴结供血。该图显示了腹股沟淋巴结供血动脉对去氧肾上腺素逐步加入生理盐水中的典型血管活性反应。从10⁻⁹摩尔到10⁻⁵摩尔的浓度范围内，明显的血管收缩现象提示动脉中平滑肌功能正常。本图显示了在生理盐水中逐步累积添加乙酰胆碱后典型的血管活性反应，浓度范围为10⁻⁹摩尔至10⁻⁵摩尔。明显的血管舒张现象提示动脉中存在正常的内皮功能。在进行此项操作时，需牢记的关键要点之一是尽量减少对血管及其周围区域的干扰，以最大限度地提高实验成功率。在完成此步骤后，可引入其他方法，例如荧光技术，以进一步探究其他细胞功能，如细胞迁移。该技术发展之后，为连接免疫学与血管生物学领域、开创血管免疫学这一新领域铺平了道路。

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