腹股沟淋巴结的活体显微成像

本实验的总体目标是活体可视化并评估小鼠腹股沟淋巴结的供血动脉。首先通过精细解剖小鼠腹股沟区域覆盖腹股沟淋巴结的皮肤，制备皮瓣；随后分离覆盖在淋巴结区域上方的结缔组织，以实现上述目标。

接下来，必须去除周围的脂肪组织，以暴露淋巴结的供血动脉血管系统。最后，通过活体显微镜技术P观察和评估淋巴结血管系统的变化。尽管如此，今天您将看到的制备样本为腹股沟淋巴结微循环。该手术技术也可用于其他组织的制备，例如骨骼肌以及脑组织。

通常情况下，初学者在操作此技术时会面临两个主要困难。其一，是因为操作对象是活体动物；其二，是因为手术操作区域非常小，任何对血管本身或周围组织的干扰都可能产生负面影响，从而损害实验的顺利进行。因此，对该技术进行直观的演示对于成功实施至关重要。

该技术涉及多个复杂的步骤，仅通过文字描述很难准确掌握实际操作要领。正确实施该技术的关键在于直观观察，以确保操作准确无误，并取得良好效果。

首先对小鼠进行麻醉，并剃除手术区域的毛发。具体细节请参见文本稿件。然后可将小鼠以仰卧位固定于透明手术板上。

用胶带将小鼠的每个脚垫固定在板上。实验前一天，根据制造商的说明配制thes guard 180 4。然后，使用标准的一次性培养皿作为模具，将混合物倒入约四分之一英寸深，静置过夜使其固化。将thes guard从培养皿中取出，并放置在手术板上。

将脱毛并麻醉的小鼠置于解剖显微镜下。使用5号不锈钢镊子和直剪刀、弹簧剪，在腹腔腹侧表面沿中线做切口。然后将中线切口向四肢方向斜向延伸，并将皮肤向脊柱方向牵开。

当腹股沟淋巴结清晰可见后，使用不锈钢昆虫针和环氧涂层不锈钢镊子将回缩的皮肤固定在180 4基座雪茄上。向该区域添加生理盐水溶液或PSS。

接下来，去除覆盖在淋巴结周围区域的薄层结缔组织。用镊子小心夹起小块结缔组织，并从淋巴结周围剥离。使用弹簧剪刀清除覆盖并包围淋巴结的脂肪组织，直至暴露微血管床。

在此步骤中，必须小心谨慎，避免手术器械接触目标血管，或在操作周围组织时因用力过大而损伤血管。清除淋巴结周围的脂肪组织时，应先松解结缔组织，用镊子夹住脂肪组织，然后轻柔地将其移除，直至视野清晰。一旦去除结缔组织和脂肪组织，即可观察到邻近淋巴结的主要动脉段及其上方伴行的静脉。

在体视显微镜下暴露感兴趣的血管节段后，将其固定在活体显微镜上。设置灌流和吸引装置。在该操作步骤期间，必须始终用平衡好的PSS溶液对暴露的组织进行灌流。

通过重力作用实现生理盐溶液（PSS）的灌流。将溶液从初始储液罐导入经水浴加热的储液罐，该储液罐由含5%二氧化碳的氮气平衡气体进行灌注，随后以每分钟10毫升的速率经滴管流入。应使用吸液管，将其置于皮瓣底部，持续将灌流后的PSS从标本处吸走。随后应检查并调节循环水浴的温度以及PSS灌流速率，以达到约36摄氏度的最佳温度。

在整个制备过程中，让血管在PSS中平衡至少60分钟。使用直肠温度计监测动物体温，防止低体温，并提供外部加热灯保温。在PSS平衡期间，测量血管直径。

使用视频测径器在多个时间点进行测量，以确保血管达到稳定状态；稳定状态的定义是血管直径在 20 分钟内保持在 ±5 微米范围内的恒定值。直径测量数据通过 Chart Lab 软件记录在计算机上。在平衡期结束后，使用平滑肌特异性激动剂（如去氧肾上腺素）评估血管的健康状况，此处以去氧肾上腺素为例。

将激动剂加入到suse中。每次应评估八种激动剂，在每次给予激动剂之间，激动剂的累积浓度按对数递增。每次给予激动剂后，应使用PSS进行30分钟的洗涤期，或持续至血管恢复至静息直径。

以下是腹股沟淋巴结在平衡期后的代表性结果。用生理盐水灌注动脉可获得清晰的图像，能够识别出由红色箭头指示的供血动脉和由绿色箭头指示的引流静脉，二者共同为腹股沟淋巴结供血。该图显示了腹股沟淋巴结供血动脉对去氧肾上腺素逐步加入生理盐水中的典型血管活性反应。

从10⁻⁹摩尔到10⁻⁵摩尔的浓度范围内，明显的血管收缩现象提示动脉中平滑肌功能正常。本图显示了在生理盐水中逐步累积添加乙酰胆碱后典型的血管活性反应，浓度范围为10⁻⁹摩尔至10⁻⁵摩尔。

明显的血管舒张现象提示动脉中存在正常的内皮功能。在进行此项操作时，需牢记的关键要点之一是尽量减少对血管及其周围区域的干扰，以最大限度地提高实验成功率。在完成此步骤后，可引入其他方法，例如荧光技术，以进一步探究其他细胞功能，如细胞迁移。

该技术发展之后，为连接免疫学与血管生物学领域、开创血管免疫学这一新领域铺平了道路。