Name: 评估外胚层上皮细胞在颅面发育的信号属性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-24T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学习利用组织移植技术构建嵌合胚胎，研究颅面发育中外胚层上皮细胞的信号传导与模式形成特性。该方法通过分子和形态学分析揭示供体外胚层功能，为发育生物学研究提供重要技术手段。

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本工作由 R01-DE018234 和 R01-DE019638 项目资助。

1. 准备供体组织
<ol>
<li>准备培养基，磨制玻璃针，磨制钨针。</li>
<li>从蛋壳中取出胚胎，在冰上预冷的 PBS 中清洗。
<ol class="lalpha">
<li>使用 10 mL 注射器和 18 号针头，从蛋壳尖端吸取 1.0 mL 蛋白液。</li>
<li>用剪刀尖在蛋壳顶部开一个小孔，然后剪出一个圆形开口以暴露胚胎。</li>
</ol>
</li>
<li>去除头部，并将其置于 DMEM（无血清，室温）中。</li>
<li>从胚胎中解剖分离额鼻突组织（或其它供体部位，如上颌突或下颌突）。</li>
<li>在冰上用含 2.4 U/mL dispase 的 PBS 消化 20 分钟。</li>
<li>加入含 1% BSA 的 DMEM 覆盖组织，以终止消化反应。</li>
<li>使用磨制好的钨针分离外胚层、间充质和神经外胚层。</li>
<li>将移植物组织置于含 1% BSA 的 DMEM 中，冰上保存，直至受体准备就绪进行移植。</li>
</ol>
2. 准备受体
<ol>
<li>暴露胚胎
<ol class="lalpha">
<li>使用 10 mL 注射器和 18 号针头，从蛋壳的尖端吸取 1.0 mL 蛋白。</li>
<li>用剪刀尖在蛋壳顶部戳一个小孔，用胶带覆盖该孔，然后切割出一个圆形开口以暴露胚胎。</li>
</ol>
</li>
<li>使用两对镊子夹住羊膜，轻轻撕开以形成一个小孔。</li>
<li>用一对镊子夹住右眼并施加压力，以旋转头部。在固定头部的同时，使用钨针去除宿主外胚层，为移植组织留出空间。</li>
<li>使用玻璃移液管将移植组织转移到宿主体内。</li>
<li>将移植组织定位以替代已去除的外胚层。在移植组织的每个角插入一根玻璃针，以固定移植片。制作玻璃针时，将微毛细管在酒精火焰上拉制成细尖。</li>
<li>用胶带紧密封住开口，并将胚胎放回培养箱中，孵育适当时间以供后续分析。</li>
<li>另见：9</li>
</ol>
3. 典型结果：
为评估嵌合体，应收集胚胎并进行处理，以分析宿主与供体组织的分布情况。为检测鹌鹑细胞，可使用QcPN抗体进行免疫组织化学染色（详见： 3用于检测小鼠细胞时，采用） 原位 石蜡切片杂交被用于 6供体细胞应局限于上皮层，不应出现供体间充质组织的迹象（图1）。若在间充质中发现孤立的供体细胞，则提示存在污染的神经嵴细胞，这些细胞会影响面部发育的多个方面，从而干扰对形态学结果的任何解释（例如， 10)。一旦确认移植物技术不会混入间充质组织，即可采用进一步的形态学或分子学结果指标来评估嵌合体。就我们的目的而言，我们检测了异位软骨和骨骼的存在，这些结构对应于由移植组织诱导产生的上颌重复结构（图2），以及间充质组织对移植物外胚层所产生的分子变化（图3）。5,6.
<img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig1.jpg" alt="鹌鹑-小鼠-鸡杂交实验；显微镜图像显示 SINE B2 与 QCPN 标记物。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 嵌合体状态的评估 （A）使用抗-QcPN 染色检测鸡-鹌鹑嵌合体中的鹌鹑细胞。间充质中未见染色证据。（B） 原位 杂交技术用于检测小鼠-鸡嵌合体中 SINE B2 转录本的表达。表达局限于构成移植物的外胚层。
<img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig2.jpg" alt="胚胎发育比较；鹌鹑-鸡、小鼠-鸡；组织切片；解剖学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 三色染色显示上颌骨骼在（A）鹌鹑-鸡嵌合体和（B）小鼠-鸡嵌合体中的重复结构。
<img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig3.jpg" alt="鸡与小鼠-鸡嵌合体中Bmp7表达的显微镜图像；胚胎发育比较。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 外胚层调控间充质中的基因表达。（A）鸡胚胎间充质中正常的Bmp7表达（通过放射性原位杂交检测，阳性信号在Adobe Photoshop中伪彩为红色）。（B）在嵌合胚胎中，移植物附近（箭头）的间充质中诱导出Bmp7表达。

<ol><li>Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Neural+Crest+in+Patterning+of+Avian+Cranial+Skeletal%2C+Connective%2C+and+Muscle+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Role of the Neural Crest in Patterning of Avian Cranial Skeletal, Connective, and Muscle Tissues.</a> Developmental Biology. 96, 144-144 (1983).</li>
<li>Bronner-Fraser, M., Stern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Mesodermal+Tissues+on+Avian+Neural+Crest+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of Mesodermal Tissues on Avian Neural Crest Cell Migration.</a> Developmental Biology. 143, 213-213 (1991).</li>
<li>Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+can+form+cartilages+normally+derived+from+mesoderm+during+development+of+the+avian+head+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest can form cartilages normally derived from mesoderm during development of the avian head skeleton.</a> Developmental Biology. 208, 441-441 (1999).</li>
<li>Couly, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+Hox-negative+cephalic+neural+crest+cells+and+the+foregut+endoderm+in+patterning+the+facial+skeleton+in+the+vertebrate+head%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Interactions between Hox-negative cephalic neural crest cells and the foregut endoderm in patterning the facial skeleton in the vertebrate head.</a> Development. 129, 1061-1061 (2002).</li>
<li>Evans, D. J., Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+relations+between+avian+craniofacial+neural+crest+and+paraxial+mesoderm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Spatial relations between avian craniofacial neural crest and paraxial mesoderm cells.</a> Dev Dyn. , (2006).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zone+of+frontonasal+ectoderm+regulates+patterning+and+growth+in+the+face%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face.</a> Development. 130, 1749-1749 (2003).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+organization+of+the+frontonasal+ectodermal+zone+in+birds+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals.</a> Dev Biol. 325, 200-200 (2009).</li>
<li>Le Lièvre, C. S., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+derivatives+of+the+neural+crest%3A+analysis+of+chimaeric+quail+and+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 34, 125-125 (1975).</li>
<li>Bollag, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+repetitive+mouse+B2+element+to+identify+transplanted+mouse+cells+in+mouse-chick+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Use of a repetitive mouse B2 element to identify transplanted mouse cells in mouse-chick chimeras.</a> Exp Cell Res. 248, 75-75 (1999).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Eames, B. F., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quail-duck+chimeras+reveal+spatiotemporal+plasticity+in+molecular+and+histogenic+programs+of+cranial+feather+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quail-duck chimeras reveal spatiotemporal plasticity in molecular and histogenic programs of cranial feather development.</a> Development. 132, 1499-1499 (2005).</li>
<li>Odent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Sonic+hedgehog+%28SHH+%29+gene+during+early+human+development+and+phenotypic+expression+of+new+mutations+causing+holoprosencephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Expression of the Sonic hedgehog (SHH ) gene during early human development and phenotypic expression of new mutations causing holoprosencephaly.</a> Hum Mol Genet. 8, 1683-1683 (1999).</li>
<li>Szabo-Rogers, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+skeletogenic+patterning+roles+for+the+olfactory+pit%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel skeletogenic patterning roles for the olfactory pit.</a> Development. 136, 219-219 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

利用这种移植方法，我们得以确定外胚层含有调控上颌背腹极性和近远端延伸的信号信息。使用鹌鹑或小鼠外胚层时结果相似，且该组织中分子信号在多种物种间具有保守性6,11，表明这是脊椎动物中高度保守的信号中心。此外，其他研究者已采用类似技术检测头部表面外胚层不同区域的信号特性，发现外胚层中存在多个信号中心，参与面部形态发生过程12。该方法有助于进一步理解不同组织以及组织内区域差异在面部发育过程中的作用。最后，通过结合小鼠遗传学与禽类嵌合系统的优点，我们将能够阐明发育过程中上皮-间充质相互作用的分子介导因子，并揭示这些相互作用调控发育的机制。

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>TEKZR114</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>加州大学旧金山分校</td><td>CCFDA003</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>35x10 mm 培养皿</td><td>Falcon BD</td><td>1008</td><td></td></tr><tr><td>5号Dumont镊子</td><td>精细科学工具公司</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>精细科学工具公司</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪刀</td><td>精细科学工具公司</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>精细科学工具公司</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>钨针</td><td>精细科学工具公司</td><td>26000</td><td></td></tr><tr><td>微量毛细管</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-225-G</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪刀</td><td>精细科学工具公司</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>刀片架</td><td>精细科学工具公司</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>精细科学工具公司</td><td>10050-00</td><td></td></tr></tbody></table>

评估颅面发育过程中外胚层上皮的信号特性

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

鸟类胚胎易于获取的特性帮助实验胚胎学家理解了发育过程中细胞的命运以及调控脊椎动物图式形成和形态发生的组织相互作用（例如，1, 2, 3, 4）。在此，我们介绍一种利用这种可及性来检测面部发育过程中外胚层组织信号传导和图式形成特性的方法。在这些实验中，我们将覆盖在上颌区域的头部表面外胚层从鹌鹑或小鼠移植到鸡胚胎的相同区域或异位区域，从而构建鹌鹑-鸡5或小鼠-鸡6嵌合体。将鹌鹑组织作为供体移植入鸡胚胎的方法最初是为了利用鹌鹑细胞中存在而鸡细胞中不存在的核仁标记物，从而使研究者能够区分宿主与供体组织7。类似地，小鼠基因组中存在一种重复元件，并且广泛表达，这使我们能够在小鼠-鸡嵌合体中区分宿主和供体组织8。使用小鼠外胚层作为供体组织将极大拓展我们对这些组织相互作用的理解，因为这将使我们能够检测来自不同突变型胚胎的外胚层所具有的信号传导特性。

本文介绍了一种组织移植技术，旨在测试颅面发育过程中头部表面外胚层的信号传导和模式形成特性。

禽类胚胎易于获取的特性帮助实验胚胎学家理解了发育过程中细胞的命运以及组织在其中所起的作用……

本实验的总体目标是通过将供体胚胎的外胚层移植到鸡胚正在发育的上颌部位，从而构建嵌合胚胎。该过程首先需切除供体的外胚层以用于移植，随后对受体部位进行处理，为移植做好准备。该操作的最后一步是将供体组织放置于受体部位，并将移植物固定在适当位置。最终可获得结果显示供体外胚层的特异性移植成功，通过分子和形态学分析，可以确定供体外胚层的功能。该方法有助于回答发育生物学中的关键问题，例如鉴定各种组织在形态发生过程中的作用。本实验操作将由本实验室的高级研究员Diane博士进行演示。在开始此操作之前，请准备好培养基，并确保所有必需的溶液均已备妥且处于正确的温度。然后，在佩戴适当的护目镜的情况下，将微毛细管在酒精火焰上拉制成细尖状。通过将钨针在丙烷喷灯的火焰中灼烧，以制备玻璃针。在鸡蛋末端贴上一片胶带，开始从蛋壳中提取供体胚胎。然后用解剖针的尖端在胶带中心刺一个小孔。将一个10毫升注射器和18号皮下注射针插入孔中，从蛋内抽出1毫升白蛋白。然后使用解剖针在蛋壳顶部打一个小孔，并用第二块胶带覆盖此孔。使用两把镊子在卵膜上剪出一个圆形开口。夹住胚胎并将其放入盛有冰冻 PBS 的培养皿中清洗。去除胚胎头部后，将其放入含有室温无血清 DMEM 的组织培养皿中。用镊子夹住头部，将培养皿置于解剖显微镜下。使用弹簧剪将上颌和龙骨从头部其余部分粗略解剖下来。然后使用装有锋利剃刀刀片的刀片夹，将额鼻突从上颌上修剪下来。使用移液器将额鼻突转移至含有足量 PBS 中 diss 溶液的 30 毫米培养皿中，冰上孵育 20 分钟。孵育结束后，吸除 dispase 溶液，注意不要扰动组织。随后用含有 1% BSA 的 DMEM 完全覆盖组织。为终止消化，将组织转移至新的培养皿中。随后在解剖显微镜下操作，使用未磨尖的钨针固定组织，再用磨尖的钨针进行处理。将外胚层与其他组织剥离分开。制备完成后，将移植物组织置于含BSA的DMEM中，并在冰上保存，直至宿主准备就绪进行移植。采用先前已演示的方法，在鸡胚蛋上开窗。用两把镊子将含有胚胎的卵置于解剖显微镜下。夹住 IGN 膜和羊膜，轻轻撕开形成一个小孔，以暴露宿主胚胎。用一把镊子夹住右眼，同时固定头部并施加压力，使头部旋转。使用持针器和针头去除受体皮肤以容纳移植物。在含有已制备移植物的培养皿中加入两微升中性红。用玻璃移液管将移植物转移至受体。将移植物放置在去除外胚层的位置。在移植物的每个角插入一根玻璃针，以固定移植物位置。移植完成后，用胶带将窗口紧密封闭。将胚胎放回培养箱中，直至达到分析所需的发育阶段。此图像显示的是用抗Q-C-P-N-A鹌鹑特异性抗体染色的鹌鹑-鸡尿囊组织。移植物组织位于两个箭头之间。在来自小鼠-鸡嵌合体的宿主组织中未见QCPN染色迹象。同样，移植物组织位于此处C图中两个箭头之间，该图显示了与Sonic B2重复序列特异性探针进行的原位杂交结果。通过镜像第一类基因发现，sign B2的表达局限于嵌合体中的宿主部分，此处显示的图像为经三色染色的鹌鹑-鸡嵌合体镜像，三色染色使胶原和骨骼呈现蓝色。上颌骨骼的重复出现，如箭头所示。该图像显示的是另一个经三色染色的鼠-鸡嵌合体镜像。可见上颌骨骼出现重复。该图像显示了在嵌合体小鼠-鸡胚胎的间充质中，通过放射性C双杂交技术检测到正常的BMP7表达，此处所示组织来源于小鼠-鸡嵌合体。可以观察到，如箭头所示，在移植物邻近的间充质中诱导出了BMP7的表达。观看本视频后，您应能充分理解如何操作鸡胚以评估调控面部和鼻部突起发育的机制。

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