评估颅面发育过程中外胚层上皮的信号特性

本实验的总体目标是通过将供体胚胎的外胚层移植到鸡胚正在发育的上颌部位，从而构建嵌合胚胎。该过程首先需切除供体的外胚层以用于移植，随后对受体部位进行处理，为移植做好准备。

该操作的最后一步是将供体组织放置于受体部位，并将移植物固定在适当位置。最终可获得结果显示供体外胚层的特异性移植成功，通过分子和形态学分析，可以确定供体外胚层的功能。该方法有助于回答发育生物学中的关键问题，例如鉴定各种组织在形态发生过程中的作用。

本实验操作将由本实验室的高级研究员Diane博士进行演示。在开始此操作之前，请准备好培养基，并确保所有必需的溶液均已备妥且处于正确的温度。然后，在佩戴适当的护目镜的情况下，将微毛细管在酒精火焰上拉制成细尖状。

通过将钨针在丙烷喷灯的火焰中灼烧，以制备玻璃针。在鸡蛋末端贴上一片胶带，开始从蛋壳中提取供体胚胎。然后用解剖针的尖端在胶带中心刺一个小孔。

将一个10毫升注射器和18号皮下注射针插入孔中，从蛋内抽出1毫升白蛋白。然后使用解剖针在蛋壳顶部打一个小孔，并用第二块胶带覆盖此孔。

使用两把镊子在卵膜上剪出一个圆形开口。夹住胚胎并将其放入盛有冰冻 PBS 的培养皿中清洗。去除胚胎头部后，将其放入含有室温无血清 DMEM 的组织培养皿中。

用镊子夹住头部，将培养皿置于解剖显微镜下。使用弹簧剪将上颌和龙骨从头部其余部分粗略解剖下来。然后使用装有锋利剃刀刀片的刀片夹，将额鼻突从上颌上修剪下来。

使用移液器将额鼻突转移至含有足量 PBS 中 diss 溶液的 30 毫米培养皿中，冰上孵育 20 分钟。孵育结束后，吸除 dispase 溶液，注意不要扰动组织。随后用含有 1% BSA 的 DMEM 完全覆盖组织。

为终止消化，将组织转移至新的培养皿中。随后在解剖显微镜下操作，使用未磨尖的钨针固定组织，再用磨尖的钨针进行处理。

将外胚层与其他组织剥离分开。制备完成后，将移植物组织置于含BSA的DMEM中，并在冰上保存，直至宿主准备就绪进行移植。采用先前已演示的方法，在鸡胚蛋上开窗。

用两把镊子将含有胚胎的卵置于解剖显微镜下。夹住 IGN 膜和羊膜，轻轻撕开形成一个小孔，以暴露宿主胚胎。用一把镊子夹住右眼，同时固定头部并施加压力，使头部旋转。

使用持针器和针头去除受体皮肤以容纳移植物。在含有已制备移植物的培养皿中加入两微升中性红。用玻璃移液管将移植物转移至受体。

将移植物放置在去除外胚层的位置。在移植物的每个角插入一根玻璃针，以固定移植物位置。移植完成后，用胶带将窗口紧密封闭。

将胚胎放回培养箱中，直至达到分析所需的发育阶段。此图像显示的是用抗Q-C-P-N-A鹌鹑特异性抗体染色的鹌鹑-鸡尿囊组织。移植物组织位于两个箭头之间。在来自小鼠-鸡嵌合体的宿主组织中未见QCPN染色迹象。同样，移植物组织位于此处C图中两个箭头之间，该图显示了与Sonic B2重复序列特异性探针进行的原位杂交结果。

通过镜像第一类基因发现，sign B2的表达局限于嵌合体中的宿主部分，此处显示的图像为经三色染色的鹌鹑-鸡嵌合体镜像，三色染色使胶原和骨骼呈现蓝色。上颌骨骼的重复出现，如箭头所示。该图像显示的是另一个经三色染色的鼠-鸡嵌合体镜像。

可见上颌骨骼出现重复。该图像显示了在嵌合体小鼠-鸡胚胎的间充质中，通过放射性C双杂交技术检测到正常的BMP7表达，此处所示组织来源于小鼠-鸡嵌合体。可以观察到，如箭头所示，在移植物邻近的间充质中诱导出了BMP7的表达。

观看本视频后，您应能充分理解如何操作鸡胚以评估调控面部和鼻部突起发育的机制。