原位Xenografting人类荧光素酶标记的恶性外周神经鞘瘤细胞在体内测试候选治疗药物

一种可靠荧光素酶标记的人类恶性外周神经鞘肿瘤细胞移植到免疫缺陷小鼠坐骨神经的方法是描述。利用生物发光成像显示肿瘤移植和动物为研究组随机分离的标准进行了适当的建立进行了讨论。

该程序的总体目标是确定候选治疗剂是否有效抑制移植到免疫缺陷小鼠坐骨神经中的 M-P-N-S-T 细胞的生长。这是通过首先从组织培养瓶中取出肿瘤细胞，清洗它们并以适当的浓度悬浮它们来实现的。手术的第二步是手术暴露坐骨神经，然后向神经注射 5， 000 个细胞。

下一步是使用体内基于光的成像确定移植的成功，将 CIN 随机分配到研究组并开始使用候选治疗剂进行治疗。该程序的最后一步是在移植后 30 天收集肿瘤并分析候选治疗剂对肿瘤的影响。最终，可以获得结果，显示治疗剂是否通过诸如比较肿瘤重量、通过 KI 67 免疫染色观察相对增殖速率以及用隧道测定评估对照和治疗小鼠的肿瘤细胞死亡水平等方法减少肿瘤生长。

与皮下移植等现有方法相比，这项技术的主要优点是它模拟了正常的微环境，这更好地模拟了 M-P-N-S-T 生长，证明这项技术将是我实验室的技术人员 Amy Turk。在嫁接前一天准备非裸免疫缺陷小鼠。使用剪刀剃掉在加热垫上工作的麻醉老鼠的毛发，以保持体温。

使用化学脱毛剂去除任何残留的毛发。去除所有毛发后，将鼠标放在隔离笼中的加热垫上，无需床上用品，直到完全恢复。在嫁接当天，将细胞以 3000 RPM 离心 5 分钟。

小心地取出 snat，并将细胞沉淀重悬于不含 pur 霉素的 DMEM 10 中，最终浓度为每 3 微升第三个细胞的 5 倍 10 倍。将细胞放在冰上，直到准备好使用。首先，将麻醉的动物放在加热垫上，并在每只眼睛上涂抹眼药膏。

将带有唯一标识符号的耳标夹在每只鼠标的右耳上。为了在整个研究过程中便于识别，请将动物放在肚子上并张开后腿。用无菌窗帘盖住鼠标，并露出将发生嫁接的手术窗。

用棉签涂抹器将 Betadine 涂抹在手术部位，从侧面中心开始，逐渐向外螺旋状延伸至手术窗的边缘。然后以相同的方式将 70% 乙醇涂抹到手术部位。连续施用 Betadine 后施用乙醇再重复两次。

从冰中取出细胞，轻轻涡旋或轻弹试管以重悬沉淀的细胞。使用移液管去除 3.2 μL 细胞悬液，并将其弹出到一块 Paraform 上。将 3 微升细胞悬液拉入 10 微升 Hamilton 注射器中。

配备 33 号针头。将细胞和含有注射器的细胞放在冰上，直到准备好使用。使用配备 22 号手术刀刀片的 4 号手术刀手柄，在股骨下方平行于股骨的侧腹皮肤上切开。

用手术夹打开皮肤切口，露出下面的肌肉。用一把尖锐的剪刀钝化，穿过沿着腿部长度延伸的筋膜，露出位于白色线性结构下的坐骨神经，该结构大约在显微镜下工作的粗线粗细。使用一对尖锐的弯曲镊子小心地解剖神经下方，将其从下面的肌肉中松开。

将镊子留在原位，以保持神经升高和隔离 小心地将汉密尔顿注射器的针头插入神经，尽量保持注射角度与神经平行，以免刺穿到底部。一旦针头正确定位在神经中，放松镊子产生的张力，并在 45 到 60 秒内缓慢注射细胞。缓慢注射对于防止肿瘤细胞反冲洗导致其丢失至关重要。

成功注射所有细胞后，缓慢抽出针头以尽量减少注射材料的损失。注射完成后，取下手术夹和镊子。然后小心地将神经放回原来的位置。

用 vet 粘合手术胶水闭合切口，用镊子将其固定在一起约 20 秒，让胶水干燥。将动物放入没有垫料的加热笼子中，直到它完全恢复。监控鼠标的健康状况。

将每日小鼠从研究中取出。如果肿瘤负荷超过动物正常体重的 10% 或体重减轻超过 20%为了确定手术的成功，请在移植后 1 天和 3 天进行生物发光成像。向小鼠注射 2.5 毫克 Lucifer，并将麻醉的动物放在加热的成像平台上。

注射底物后 10 分钟检测肿瘤表达的萤火虫荧光素酶的光发射。使用 Xeno Gen 的软件将图像采集时间设置为 1 秒到 10 分钟的范围。接下来，拍摄老鼠的黑白照片 伪彩色.

生物发光的缩放与这些图像叠加，以提供发光强度的度量。要符合纳入临床前试验队列的资格，小鼠必须在移植后 1 天和 3 天具有可检测的生物发光信号，并且信号强度必须在第 1 天和第 3 天之间增加。这里显示的是裸鼠中正确建立的原位异种移植物嫁接后 1 到 18 天观察到的典型生物发光进行性增加。

注意在不同小鼠的感兴趣区域内检测到的信号的相似性。移植后 10 天和 18 天的重新成像显示，个体小鼠移植部位的生物发光信号逐渐增加。移植后 1 至 24 天观察到的生物发光信号的定量表明，尽管这些信号逐渐增加，但在研究期的后期，肿瘤生长显着加速。

鉴于 M pns ts 的侵袭性生长，移植的肿瘤细胞通常会突破神经的正常屏障并侵入邻近组织。这张移植部位的显微照片显示了肿瘤生长和局灶性侵袭到相邻骨骼肌一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在 10 分钟内在一只小鼠身上完成。