Name: 原位Xenografting人类荧光素酶标记的恶性外周神经鞘瘤细胞在体内测试候选治疗药物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 了解原位异种移植荧光素酶标记的恶性外周神经鞘瘤细胞至免疫缺陷小鼠坐骨神经的方法，用于评估候选治疗药物对肿瘤生长的抑制效果。该方法结合生物发光成像技术实时监测肿瘤动态。

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本研究工作得到了美国国家神经疾病与卒中研究所（R01 NS048353，授予S.L.C.）、美国国家癌症研究所（R01 CA122804，授予S.L.C.；R01 CA134773，授予Kevin A. Roth和S.L.C.；CA13148-35，授予K.R.Z.）以及美国国防部（X81XWH-09-1-0086，授予S.L.C.）的支持。阿拉巴马大学伯明翰分校综合癌症中心小型动物影像共享设施的运行资金来自美国国家癌症研究所核心支持拨款（P30 CA13148-35；E. Partridge，项目负责人）。我们感谢阿拉巴马神经科学蓝图核心中心（P30 NS57098）和阿拉巴马大学伯明翰分校神经科学核心中心（P30 NS47466）提供的协助。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院或美国国防部的官方观点。

1. 非裸体免疫缺陷小鼠的初始准备（裸体品系无需此步骤）：
<ol>
 <li>所有操作均事先经阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）机构动物照护与使用委员会审查并批准，并由经过适当培训的人员执行。我们已成功使用三种免疫缺陷型小鼠品系进行这些实验：a) Foxchase远交型SCID小鼠（CB17/lcr-Prkdcscid/lcrCrl小鼠）；b) NIH III小鼠（NIHS-LystbgFoxn1nuBrkxid小鼠）；以及c) NOD-SCIDγ小鼠（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ小鼠）。据我们经验，原位异种移植瘤在NIH III小鼠和NOD-SCIDγ小鼠中的生长情况几乎相同，这两种小鼠均携带影响T细胞、B细胞和NK细胞功能的突变；本方案中移植后所需生长时间、治疗开始时间以及成像时间点均基于我们使用NOD-SCIDγ小鼠的实证结果确定。Foxchase远交型SCID小鼠因存在T细胞和B细胞功能缺陷，移植物生长通常较慢。</li>
 <li>为便于对大量非裸体免疫缺陷小鼠进行移植操作，我们在移植前一天下午去除手术部位的毛发。使用连接麻醉蒸发器并配有废气清除装置的异氟烷诱导舱对小鼠进行麻醉。在整个过程中，小鼠置于加热垫上以维持体温。使用电动剪毛器去除拟移植侧背部中段至后肢膝盖部位的毛发。残留的毛发需使用化学脱毛剂（例如Nair，特别是含芦荟成分适用于敏感皮肤的产品）仔细清除，耗时约5分钟。建议清除脱毛剂残留物，因其可能引起皮肤、眼睛及其他接触部位的刺激。本实验中不同时对双侧坐骨神经进行移植，以免双侧后肢功能受损，导致实验动物脱落。</li>
 <li>小鼠在无垫料的隔离笼中置于加热垫上恢复，以确保其不会受到其他更为清醒动物的伤害，同时防止其意外吸入垫料。当小鼠完全恢复活动能力且无任何嗜睡迹象时，可将其重新放回与其他小鼠共用的笼具中。</li>
</ol>
2. 移植当天 MPNST 细胞注射前的准备
<ol>
 <li>在此方案中，移植的细胞数量以及移植后肿瘤生长所需时间均为我们针对ST88-14细胞经实验确定的数值，ST88-14是一种源自NF1相关肿瘤的常用MPNST细胞系5用于移植的细胞已通过含有CMV-荧光素酶-IRES-嘌呤霉素表达盒的慢病毒载体进行转导，并通过生物发光成像筛选出稳定表达萤火虫荧光素酶的克隆6我们还进行了移植实验，使用了在CMV立即早期启动子调控下稳定转染表达萤火虫荧光素酶的质粒的MPNST细胞。但我们不推荐此方法，因为我们发现这些质粒载体在移植后容易发生表达沉默。</li>
 <li>ST88-14 细胞在添加 10% 胎牛血清的杜尔贝科最低必需培养基中培养， 10 μg/mL 链霉素和10 IU/mL青霉素（DMEM10）； 5 μg/ml 嘌呤霉素也被用于维持对慢病毒载体的选择性。我们在实验室中已将这些细胞传代培养至第50代，未观察到任何传代过程中细胞生长特性的变化。9 x 105 ST88-14 细胞接种于 T175 培养瓶中，培养 3 天，此时培养瓶细胞融合度约为 80%。移植 35 只小鼠需要一个 80% 融合度的 T175 培养瓶；在此密度下，ST88-14 细胞的平均收获量为 7.3 × 106 每T175培养瓶的细胞数。在收获用于移植的细胞前，必须严格避免细胞生长至汇合状态。我们发现，使用从汇合培养瓶中收获的细胞进行移植会导致更高的移植失败率，并常常延长 体内 移植物生长过程。</li>
 <li>ST88-14 细胞用室温 Hanks 平衡盐溶液洗涤一次。使用 Cell Stripper 细胞解离溶液在室温下处理 30 秒至 1 分钟，使细胞从培养瓶中脱落。加入 5 毫升 DMEM10（注意：嘌呤霉素 不 每使用1毫升细胞解离液，即加入该培养基中所含的相应成分。</li>
 <li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。5 × 103 ST88-14 细胞悬液 3 μL 每只小鼠将注射一定量的细胞。为确保整批小鼠移植所需，并额外预留移液误差的余量（例如，对于35只小鼠，通常准备足够40只小鼠移植的细胞数量），将细胞转移至无菌的1.5 mL离心管中。以3000 rpm离心5分钟。小心吸除上清液，将细胞沉淀重悬于DMEM10中（注意：嘌呤霉素） 不 （包含在此培养基中）至终浓度为 5 x 103 每细胞 3 μL将细胞置于冰上。</li>
</ol>
3. 移植方案
<ol>
 <li>将小鼠置于异氟烷蒸发器的诱导室中进行麻醉，直至其对脚趾夹捏刺激不再出现后肢回缩反应。将小鼠侧卧放置，并皮下注射0.05 mg/kg盐酸丁丙诺啡。随后通过鼻罩持续给予异氟烷以维持麻醉状态。请注意，本视频中使用的是已实施安乐死的小鼠以演示该操作过程；因此，用于输送异氟烷的管路在视频中不可见。</li>
 <li>为维持体温，在整个移植过程中将动物置于加热垫上操作。为防止角膜干燥，每只眼睛滴入少量眼科软膏（Puralube veterinary ointment）。由于在实验期间需要对每只小鼠进行唯一标识，因此在每只小鼠的右耳上夹上带有唯一识别编号的耳标。</li>
 <li>将动物俯卧放置，后肢分开。用无菌手术巾覆盖小鼠，仅暴露将进行移植的手术区域（侧腹部）。无菌手术巾应允许观察到动物头部，以确保鼻部仍处于鼻罩内，并便于监测呼吸及动物体表颜色。使用棉签蘸取聚维酮碘，从侧腹部中央开始，逐步螺旋向外涂抹至手术区域边缘。随后以同样方式用70%乙醇处理手术部位。聚维酮碘与乙醇的交替消毒重复进行两次。</li>
 <li>将细胞从冰上取出，轻轻涡旋或轻弹管壁以重悬已沉降的细胞。使用移液器吸取3.2 μL细胞悬液，并将其排至一片Parafilm上。通过吸取略多于所需体积并将悬液置于Parafilm表面，可确保悬液中无气泡，并准确获得3 μL用于注射。尽可能多地将细胞悬液吸入一支配备33号针头的10 μL Hamilton注射器中。轻弹注射器以排出气泡，并将多余悬液推出，精确调整至3 μL。将含细胞的注射器置于冰上保存，待用前保持低温；为确保针头无菌，避免其与冰或冰桶直接接触。可在冰面上覆盖一层Saran膜，防止注射器直接接触冰面。</li>
 <li>使用装有22号刀片的4号手术刀柄，在股骨下方紧邻处沿平行方向切开侧腹部皮肤；注意切口范围不得超过术前消毒区域的边界。用手术钳或手动撑开皮肤切口，暴露下方肌肉。可见沿腿部走向的一层筋膜平面；坐骨神经位于该筋膜下方，并处于两块由筋膜连接的肌肉之间。使用尖头剪刀钝性分离此筋膜，暴露坐骨神经，其外观呈白色线状结构，粗细约如粗线。</li>
 <li>使用一对尖头弯镊，小心地从神经下方钝性分离，使其与下方肌肉松解；此操作可抬高并隔离神经。将镊子保留在神经下方以维持其位置。小心将Hamilton注射器的针头插入神经内，尽量保持进针角度与神经走向平行，避免针头穿透神经底侧。针头应朝向远离脊柱的一端插入——我们发现，若将肿瘤细胞注入靠近脊柱方向的神经段，则移植的肿瘤细胞更接近脊髓。此种情况下，肿瘤细胞常侵入脊髓，导致动物因脊髓功能受损而提前退出实验组。</li>
 <li>当针头在神经内准确定位后，松开由镊子造成的神经张力，并在45–60秒内缓慢将细胞从注射器注入神经。此步骤必须缓慢进行，因为快速推出内容物会导致肿瘤细胞在注射部位周围“反流”并造成细胞丢失。所有细胞成功注入后，缓慢撤出针头，以最大限度减少注入物的流失。</li>
 <li>移除镊子，小心将神经复位至肌肉下方原位。使用Vetbond外科胶水闭合手术切口。用镊子夹合切口约20秒，使胶水充分干燥固化。</li>
 <li>将小鼠从异氟烷鼻罩中取出，单独置于无垫料的笼中恢复。该笼应放置于加热垫上方，直至动物完全苏醒。恢复笼的一部分不应置于加热垫上，以便动物在过热时可自行远离热源。移植后应定期评估动物是否存在啃咬手术部位、跛行或厌食等表现；这些症状可能提示动物仍存在疼痛，需给予适当镇痛药物。在熟练掌握本操作后，我们发现单日内可顺利完成30–40只小鼠的移植操作。</li>
</ol>
4. 移植物成功评估及随机分组至研究组
<ol>
 <li>生物发光成像用于评估移植手术的成功情况。我们使用IVIS-100系统（最初来自Xenogen，现为Calipers Inc.）检测肿瘤表达的萤火虫荧光素酶所产生的光信号，该信号来源于荧光素酶与其底物D-荧光素发生化学反应的结果。通过分析这些图像，可判断特定移植小鼠是否适合纳入治疗试验队列。在初步实验中，我们定量检测了可识别的生物发光信号，随后处死移植小鼠，取其肿瘤组织，并利用厂商提供的Living Image软件对感兴趣区域的生物发光信号与肿瘤重量进行相关性分析。这些研究显示，肿瘤移植物重量与生物发光信号之间存在线性相关关系，表明生物发光成像可作为临床前试验过程中评估异种移植瘤生长的合适替代指标。通常我们同时对5只小鼠进行成像。有关生物发光成像的更多技术细节此前已有发表7。</li>
 <li>为评估移植效果，在移植后第1天和第3天进行生物发光成像。小鼠经腹腔注射2.5 mg D-荧光素后10分钟，保持相同体位进行图像采集。成像过程中，小鼠维持在异氟烷麻醉状态下，并通过Xenogen成像仪内置加热板将体温保持在37°C。图像采集时间范围为2秒至10分钟；数据采集软件确保图像采集过程中无像素饱和现象。使用Xenogen公司专有软件测量肿瘤区域的光发射强度（相对光子数/秒）。光发射强度以伪彩色标度表示，并叠加于同时采集的小鼠黑白照片上。</li>
 <li>为符合纳入临床前试验队列的资格，小鼠必须在移植后第1天和第3天均能检测到生物发光信号，且第1至第3天之间的信号强度应有所增强。信号减弱或无变化的小鼠将被排除。此外，同一天移植的小鼠所检测到的信号强度应彼此在1个数量级范围内；若某只小鼠的生物发光信号比同日移植的其他小鼠低或高一个数量级以上，也应予以排除。</li>
 <li>一旦确定符合上述标准的小鼠，需将其随机分配至各治疗组。具体方法如下：首先将移植后第3天检测到的荧光素信号按强度从高到低排序，然后依此顺序将小鼠依次分配至各治疗组，再逆序分配，重复该过程直至所有小鼠完成分组。例如，若有4个治疗组（如安慰剂组及三种不同浓度的试验药物组），则分组顺序为1、2、3、4、4、3、2、1、1、2、3、4、4、3、2、1……以此类推。在开始治疗前，计算各组内每只小鼠的生物发光信号平均值，以确保各组起始信号的平均值尽可能接近。治疗用药自第3天开始给药。</li>
 <li>为评估治疗药物在治疗过程中对移植瘤生长的影响，自治疗开始后每周进行一次生物发光成像（即移植后第10、17、24、30天）。对于非裸体免疫缺陷小鼠，在每次成像前必须使用Nair再次去除新生毛发。这是因为毛发会阻挡生物发光信号，而毛色决定了信号损失的程度。例如，Swiss Webster小鼠的白色毛发可使生物发光信号强度降低18%8，而黑色毛发则可能导致信号衰减高达10倍9。还需指出的是，不能假设各治疗组间毛发再生情况一致，从而“标准化”各组间的信号衰减。因为治疗药物本身可能影响毛发生长。例如，我们观察到他莫昔芬治疗会抑制毛发再生，从而在与安慰剂组小鼠比较时，低估该药物对肿瘤生长的实际作用。</li>
 <li>使用ST88-14 MPNST细胞移植的小鼠，可在移植后维持30天。此时，肿瘤通常已生长至机构动物护理与使用委员会允许的最大尺寸，必须予以处死。在最后一次成像后，处死小鼠并采集用于进一步分析治疗效果所需的样本（如血液用于测定循环中的药物浓度，肿瘤组织用于称重、组织学检查、Ki67和TUNEL标记指数测定以及生化参数评估）。具体采集哪些样本取决于实验设计的需求。</li>
 <li>携带肿瘤的小鼠应每日监测，若出现疾病症状（如缺乏正常理毛行为和回避反应）、无法进食饮水，或肿瘤过大影响正常身体活动时，应立即终止实验。肿瘤负荷不得超过动物正常体重的10%。肿瘤重量占体重的百分比通过比较荷瘤动物与同龄同性别对照动物的体重来计算。不得允许恶病质发展至临床显著程度。荷瘤动物的体重减轻不得超过正常体重的20%。</li>
</ol>
5. 典型结果：
图1展示了在裸鼠（NIH III）体内成功建立的原位异种移植模型中，移植后1至18天内观察到的生物发光信号典型的进行性增强（A-C）。对移植后1至24天的生物发光信号进行定量分析显示，尽管信号呈持续增长趋势，但肿瘤生长在研究后期显著加速（图1D）。为了严格证实移植小鼠体内发生了肿瘤生长，我们常规性地采集坐骨神经；若观察到肿瘤已突破神经外膜并侵入邻近组织，则同时采集周围的软组织和骨骼肌。鉴于恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs）具有侵袭性生长特性，我们经常发现移植的肿瘤细胞已突破神经的正常屏障并侵入邻近组织（图1E）。我们还经常发现移植的MPNST细胞在神经内向移植物近端和远端剧烈迁移。
<img src="/files/ftp_upload/2558/2558fig1.jpg" alt="生物发光成像、肿瘤生长示意图及组织学组织样本分析" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 将荧光素酶标记的MPNST细胞原位移植到NIH III小鼠体内后1天的生物发光成像（A）。请注意，不同小鼠在感兴趣区域（ROI）内检测到的信号强度均在一个数量级范围内。移植后第10天（B）和第18天（C）的再次成像显示，各小鼠移植部位的生物发光信号随时间逐渐增强。（D）图表显示移植后1至24天内，移植部位检测到的相对光子数/秒呈进行性增加。（E）该小鼠移植部位的显微照片，显示肿瘤生长并局灶性侵入邻近骨骼肌。

<ol><li>Rosenberg, M. P., Bortner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+transgenic+and+knockout+animal+models+should+be+used+%28for+drug+efficacy+studies+in+cancer%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Met.+Rev%22%5BJournal%5D)">Why transgenic and knockout animal models should be used (for drug efficacy studies in cancer).</a> Cancer Met. Rev. 17, 295-299 (1999).</li>
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<li>Luker, G. D., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luciferase+real-time+bioluminescence+imaging+for+the+study+of+viral+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Luciferase real-time bioluminescence imaging for the study of viral pathogenesis.</a> Methods Mol. Biol. 292, 285-296 (2005).</li>
<li>Dahlberg, W. K., Little, J. B., Fletcher, J. A., Suit, H. D., Okunieff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiosensitivity+in+vitro+of+human+soft+tissue+sarcoma+cell+lines+and+skin+fibroblasts+derived+from+the+same+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiat.+Biol%22%5BJournal%5D)">Radiosensitivity in vitro of human soft tissue sarcoma cell lines and skin fibroblasts derived from the same patients.</a> Int. J. Radiat. Biol. 63, 191-198 (1993).</li>
<li>Badache, A., DeVries, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibrosarcoma-derived+Schwann+cells+overexpress+platelet-derived+growth+factor+%28PDGF%29+receptors+and+are+induced+to+proliferate+by+PDGF%5BTitle%5D)+AND+%22BB.+J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neurofibrosarcoma-derived Schwann cells overexpress platelet-derived growth factor (PDGF) receptors and are induced to proliferate by PDGF.</a> BB. J. Cell. Physiol. 177, 334-342 (1998).</li>
<li>Muir, D., Neubauer, D., Lim, I. T., Yachnis, A. T., Wallace, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenic+properties+of+neurofibromin-deficient+neurofibroma+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tumorigenic properties of neurofibromin-deficient neurofibroma Schwann cells.</a> Am. J. Pathol. 158, 501-513 (2001).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文介绍的详细原位异种移植方法是我们使用ST88-14 MPNST细胞系建立的，该细胞系在NF1相关周围神经鞘膜瘤研究中被广泛使用。然而，该方法也可轻松适用于其他MPNST细胞系的临床前研究。例如，我们已成功对STS-26T10细胞（源自散发性MPNST的细胞系）和T265-2c11细胞（源自NF1相关MPNST的细胞系）进行了原位异种移植，其效果与ST88-14细胞相当。
需要指出的是，本文所述ST88-14细胞原位异种移植的确切条件不能直接套用于其他恶性周围神经鞘瘤（MPNST）细胞系的移植。相反，该方法的关键参数必须针对每个细胞系通过实验确定。这些参数包括最初移植的MPNST细胞数量、允许移植物生长的时间，以及在较小程度上的肿瘤细胞注射体积。为确定新细胞系的这些参数，我们对每组5只小鼠进行移植，接种细胞数量范围为103至5 × 106个，并在每一数量级内检测两个细胞浓度（即103个细胞、5 × 103个细胞、104个细胞、5 × 104个细胞，依此类推）。较大数量的肿瘤细胞（&gt;106）需使用较大体积注射；我们发现最多可注射5 mL体积，而不会导致细胞从移植神经中流失。此外，我们发现每5 mL注射体积中最多只能包含5 × 106个肿瘤细胞，因为更高密度的悬液在剪切力作用下更容易导致肿瘤细胞死亡。我们持续观察这些小鼠，直至每组中至少有3只动物出现可触及的肿瘤，此时终止该组实验，并通过组织学检查确认移植物的生长情况。显然，达到该状态所需时间会因注射细胞数量不同而有所差异；通常情况下，我们希望选择一种细胞浓度，使其在30–60天内达到最大允许的肿瘤生长水平。若肿瘤生长过快，则可能在实验终止前难以实现有效的治疗浓度，和/或影响在整个实验过程中获取足够数量的生物发光成像数据点；而超过60天的时间进程会使实验参数调整变得复杂，并不必要地延长计划中的实验周期。
最后需要指出的是，我们已将该原位异种移植方法应用于ST88-14细胞移植至NIH III小鼠，以证明他莫昔芬的治疗有效性6。有关我们常规用于评估候选治疗药物对原位异种移植物作用的方法的详细描述，可参见该论文。此外已有研究证实，神经纤维瘤细胞可成功移植至外周神经12，提示通过适当改进，本方案所述操作步骤可用于针对神经纤维瘤的候选治疗药物的临床前试验。

<table><tbody><tr><td>Foxchase远交系SCID小鼠</td><td>查尔斯河实验室</td><td>#236</td><td></td></tr><tr><td>NIH III 小鼠</td><td>Taconic</td><td>#NIHBNX</td><td></td></tr><tr><td>NOD-SCID&amp;#947; 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>#005557</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-056-cl</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond 外科胶水</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>汉密尔顿注射器</td><td>汉密尔顿公司</td><td>#80030</td><td>10 &amp;#x03BC;L 体积</td></tr><tr><td>Hamilton 注射器针头</td><td>汉密尔顿公司</td><td>#7803-05</td><td>33 Ga.，0.5 英寸，PT4（定制）</td></tr><tr><td>耳标</td><td>国家耳标带和耳标公司</td><td>1005-1</td><td></td></tr><tr><td>眼用软膏</td><td>德克拉</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr></tbody></table>

人源荧光素酶标记的恶性周围神经鞘瘤细胞原位异种移植 体内 候选治疗药物的测试

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

尽管 体外 筛选是初步鉴定候选治疗药物的关键步骤，但必须在合适的动物模型中对药物抑制肿瘤生长的能力进行严格评估。用于此目的的最佳动物模型类型目前仍存在广泛争议。一些证据表明，在转基因小鼠中研究药物对肿瘤作用的临床前试验更能预测临床结果。1因此，候选治疗药物通常在这些模型中进行测试。然而，许多肿瘤类型尚无可用的转基因模型。此外，转基因模型常存在其他局限性，例如对小鼠肿瘤在多大程度上能模拟人类对应肿瘤的担忧、肿瘤表型外显不完全，以及无法预测肿瘤发生时间等。
因此，如果缺乏合适的转基因肿瘤模型，许多研究人员会采用异种移植模型（将人类肿瘤细胞移植到免疫缺陷小鼠体内）进行临床前试验。即使存在转基因模型，也常常与异种移植模型联合使用，因为后者有助于快速确定治疗剂量范围。此外，这种联合策略能够比较药物在转基因肿瘤和真正的人类肿瘤细胞中的疗效。传统上，异种移植通常通过将肿瘤细胞注射至皮下（异位异种移植）来实现。该技术操作快速、可重复性强、相对经济，并可在治疗期间持续定量监测肿瘤生长2。然而，皮下空间并非大多数肿瘤的正常微环境，因此由于缺乏器官特异性的宿主组织和肿瘤基因表达等因素，异位异种移植所得结果可能具有误导性。因此，已有强烈建议应以原位异种移植（即将人类肿瘤细胞移植至其来源组织）取代或补充异位移植研究2。遗憾的是，这一建议的实施常受到限制，因为目前尚缺乏针对许多肿瘤类型的原位异种移植技术方法。
恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs）是一种高度侵袭性的肉瘤，可散发出现，也可与1型神经纤维瘤病相关3，最常发生于坐骨神经4。本文介绍了一种技术上简便的方法，即将萤光素酶标记的人MPNST细胞原位异种移植到免疫缺陷小鼠的坐骨神经中。我们还讨论了如何评估每只动物移植手术的成功情况，并据此进行后续的非偏倚随机分组。

本文描述了一种将荧光素酶标记的人恶性外周神经鞘瘤细胞稳定移植到免疫缺陷小鼠坐骨神经中的方法。同时讨论了利用生物发光成像技术验证肿瘤移植物成功建立的标准，以及将动物随机分入研究组别的依据。

尽管体外筛选对于候选治疗药物的初步鉴定至关重要，但对药物能力的严格评估仍需……

本实验的总体目标是确定候选治疗药物是否能有效抑制移植到免疫缺陷小鼠坐骨神经中的 M-P-N-S-T 细胞的生长。首先从组织培养瓶中取出肿瘤细胞，洗涤并重悬于适当浓度的溶液中，以完成该检测。实验的第二步是通过手术暴露坐骨神经，随后向神经内注射 5,000 个细胞。下一步是通过活体光学成像技术评估移植的成功情况，将CIN随机分配至不同研究组，并开始使用候选治疗药物进行治疗。该实验流程的最后一步是在移植后30天收集肿瘤，分析候选治疗药物对肿瘤的作用效果。最终可获得结果，通过比较肿瘤重量、利用KI67免疫染色观察细胞增殖的相对速率，以及通过TUNEL检测评估对照组和治疗组小鼠肿瘤细胞死亡水平等方法，判断该治疗药物是否抑制了肿瘤生长。与现有的皮下移植等方法相比，该技术的主要优势在于能够模拟正常的微环境，从而更真实地反映M-P-N-S-T的生长特性。演示该技术的人员将为本实验室的技术员Amy Turk。在移植前一天准备好无胸腺免疫缺陷小鼠。使用剪毛器对麻醉后的小鼠进行剃毛操作，小鼠应置于加热垫上以维持体温。使用化学脱毛剂去除残留的毛发。待所有毛发完全去除后，将小鼠置于无垫料的隔离笼中的加热垫上，直至其完全恢复。在移植当天，将细胞以3000 RPM离心五分钟。小心移除上清，并将细胞沉淀重悬于不含嘌呤霉素的 DMEM 10 培养基中，调整细胞终浓度为每 3 微升含 5 × 10³ 个细胞。将细胞置于冰上保存，待用。开始实验时，将麻醉后的动物放置于加热垫上，并在每只眼睛上涂抹眼药膏。将带有唯一标识编号的耳标夹在每只小鼠的右耳上。为便于在研究过程中识别，将动物俯卧放置并展开其后肢。用无菌巾覆盖小鼠，并暴露将进行移植手术的术区窗口。使用棉签蘸取碘伏，从侧腹部手术区域的中心开始，逐渐向外螺旋式涂抹至手术窗口的边缘。随后以同样方式在手术区域涂抹70%乙醇。重复进行碘伏后接乙醇的连续涂抹，共再重复两次。将细胞从冰上取出，轻轻涡旋或轻弹管壁以重悬已沉淀的细胞。用移液器吸取 3.2 µL 细胞悬液，滴加到一块对苯二甲醛（paraform）上。用一支 10 µL Hamilton 注射器吸取 3 µL 细胞悬液。使用33号针头。将细胞及含细胞的注射器置于冰上，直至准备使用。使用4号手术刀柄，安装22号手术刀片，在股骨下方且与之平行的 flank 皮肤处做一切口。用手术钳打开皮肤切口，暴露下方的肌肉。使用尖头剪刀钝性分离沿腿部纵行的筋膜，暴露位于显微镜下呈粗线状、约粗线厚度的白色结构下方的坐骨神经。使用尖头弯镊小心地在神经下方进行分离，将其从深层肌肉组织中松解出来。保持镊子位置不变，以小心地抬高并隔离神经。将 Hamilton 注射器的针头插入神经，尽量保持注射角度与神经平行，以免刺穿至神经另一侧。当针头在神经内正确就位后，放松镊子产生的张力，并在 45 至 60 秒内缓慢注射细胞。缓慢注射至关重要，可防止肿瘤细胞反流而导致细胞丢失。所有细胞成功注射后，缓慢撤出针头，以尽量减少注射物质的流失。注射完成后，移除手术钳和镊子，然后小心地将神经放回其原始位置。使用 Vet Bond 外科手术胶水闭合切口，并用镊子夹住约 20 秒，使胶水充分干燥。将动物放入无垫料的加热笼中，直至其完全恢复。密切监测小鼠的健康状况。每日将小鼠从研究中移除。如果肿瘤负荷超过动物正常体重的10%，或体重减轻超过20%，则需进行评估。为确定手术效果，应在移植后第1天和第3天进行生物发光成像。向小鼠注射2.5毫克荧光素（Lucifer），然后将麻醉后的动物置于加热的成像平台上。注射底物10分钟后，可检测到肿瘤表达的萤火虫荧光素酶发出的光。使用Xeno Gen公司的软件，将图像采集时间设置为1秒至10分钟不等。随后，拍摄小鼠的黑白照片并进行伪彩处理。生物发光的强度标尺叠加在这些图像上，以提供发光强度的衡量标准。小鼠若要被纳入临床前试验队列，必须在移植后第一天和第三天均能检测到生物发光信号，且信号强度在第一天至第三天之间必须有所增加。此处显示的是在裸鼠体内成功建立的原位异种移植模型中，移植后第1天至第18天观察到的典型的生物发光逐渐增强情况。注意在不同小鼠的兴趣区域中检测到的信号具有相似性。移植后10天和18天的重新成像显示，个体小鼠移植部位的生物发光信号随时间逐渐增强。对移植后1至24天观察到的生物发光信号进行定量分析表明，尽管这些信号呈进行性增加，但肿瘤生长在研究后期显著加速。鉴于 M pns ts 细胞的侵袭性生长特性，移植的肿瘤细胞常突破神经的正常屏障并侵入邻近组织。此移植部位的显微照片显示了肿瘤的生长以及向邻近骨骼肌的局灶性侵袭。一旦掌握该技术，操作熟练者可在 10 分钟内完成一只小鼠的手术。

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医学

原位Xenografting人类荧光素酶标记的恶性外周神经鞘瘤细胞在体内测试候选治疗药物

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了解原位异种移植荧光素酶标记的恶性外周神经鞘瘤细胞至免疫缺陷小鼠坐骨神经的方法，用于评估候选治疗药物对肿瘤生长的抑制效果。该方法结合生物发光成像技术实时监测肿瘤动态。

人源荧光素酶标记的恶性周围神经鞘瘤细胞原位异种移植体内候选治疗药物的测试

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人源荧光素酶标记的恶性周围神经鞘瘤细胞原位异种移植 体内 候选治疗药物的测试

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