Name: 高效的聚乙二醇（PEG）介导的转化苔小立碗藓 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 54 s
Description: 学习使用PEG介导法高效转化小立碗藓原生质体的实验技术。该方法通过甘露醇洗涤和选择性培养，可在约三小时内完成转化，为基因功能研究提供可靠工具。

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L.V. 由美国国家科学基金会（NSF，项目编号 IOS 1002837）资助

1. 制备原生质体
<ol>
<li>向培养皿中加入 9 mL 8% 甘露醇。</li>
<li>用刮铲将来自 2–3 块 PPNH4 培养基的 7 天龄苔藓转移至含甘露醇的培养皿中。</li>
<li>向培养皿中加入 3 mL 2% Driselase（Sigma D9515-25G）。</li>
<li>将培养皿在室温下轻轻振荡孵育 1 小时。</li>
<li>用 100 μm 孔径滤网（BD Falcon 352350）过滤原生质体悬液。</li>
<li>将滤过的悬液在 250 g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
<li>用 500 μL 8% 甘露醇非常轻柔地重悬原生质体。</li>
<li>在培养管中加入 9.5 mL 8% 甘露醇，确保原生质体完全悬浮。</li>
<li>重复过滤和重悬步骤（1.6、1.7 和 1.8）再进行两次。</li>
<li>取 10 μL 原生质体溶液，用血细胞计数板计数原生质体数量。</li>
<li>将血细胞计数板中 16 个方格区域内的原生质体数量乘以 10,000，得到每 mL 原生质体的数量（见图 1）。</li>
</ol>
2. 转化
<ol>
<li>将原生质体悬浮液在250 g下离心5分钟，弃上清液。</li>
<li>用MMg溶液重悬原生质体，浓度为每毫升160万个原生质体。</li>
<li>将原生质体悬浮液在室温下孵育20分钟。</li>
<li>向含有60 μg DNA的培养管中加入600 μL原生质体悬浮液，轻轻旋转混匀。</li>
<li>向原生质体与DNA的混合物中加入700 μL PEG/Ca溶液，轻轻旋转至整个混合物均匀。</li>
<li>将混合物在室温下孵育30分钟。</li>
<li>在等待期间，用玻璃纸（直径80 mm，A.A. Packaging Limited, UK）覆盖PRM-B平板；使玻璃纸在平板表面至少水合5分钟。</li>
<li>用刮铲去除玻璃纸与平板之间夹带的气泡。</li>
<li>用3 mL W5溶液稀释混合物。</li>
<li>将混合物在250 g下离心5分钟，弃上清液。</li>
<li>将原生质体重悬于2 mL已融化的PRM-T中（在加入原生质体前，该溶液可在42°C保持液态），每张覆盖玻璃纸的PRM-B平板接种1 mL重悬的原生质体。用Micropore胶带（3M, Health Care）包裹平板，置于25°C培养箱中培养。</li>
<li>或者，可将原生质体重悬于1 mL液体铺板培养基中，取0.5 mL接种至覆盖玻璃纸的PRM-B平板。此方法可加快再生速度，但再生植株数量较少。</li>
<li>培养箱设定为16小时光照、8小时黑暗的光周期。</li>
<li>转化后第4天，将玻璃纸转移至新鲜的选择培养基平板上。</li>
</ol>
3. 代表性结果：
转化的一个示例如图2所示。本示例中使用的DNA为携带潮霉素抗性表达盒的7.8 kb超螺旋质粒。为拍摄照片，接种的原生质体数量减少至50%。图片是在植株转移至筛选培养基两周后拍摄的。转化效率在DNA浓度达到60 μg时不受影响，更高浓度的DNA则会对转化效率产生不利影响。实验数据表明，该方法在较宽范围的DNA用量下均能获得稳定一致的结果。该方法还能高效地产生稳定转化子，如表1所示；每微克线性化DNA可获得约4个稳定转化子，这一效率远高于此前报道的结果14。
我们还通过转化携带荧光蛋白基因作为标记的环状质粒，检测了热激对转化效率的影响。在室温孵育10分钟后（在步骤2.6内），将混合物于45°C水浴中热激3分钟。热激后立即将混合物转移至室温水浴中继续孵育17分钟。转化后22小时记录结果。有或无热激处理所获得的转化子比例非常接近（约25%），但我们观察到热激对原生质体的活力产生了不利影响（数据未显示）。
<img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig1.jpg" alt="用于粒径分析的颗粒网格显微镜图像，100 μm比例尺，网格校准方法。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 血细胞计数板中原生质体的观察。 红色方框标示出原生质体计数所需的区域。注意计数原生质体时所用的16个方格（见步骤1.11）；图像显示共计数到24个原生质体（240,000 个细胞/mL）。
<img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig2.jpg" alt="琼脂平板上细菌菌落生长情况；比较研究；实验结果；微生物学分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 转化后18天的瞬时转化子照片。 原生质体用指定量的环状质粒进行转化。A：15μg；B：30μg；C：60μg；D：120μg。
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>DNA 量 (μg)</td>
 <td>转化效率 (转化子/μg DNA)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15，超螺旋质粒</td>
 <td>120±24</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>30，超螺旋质粒</td>
 <td>145±54</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60，超螺旋质粒</td>
 <td>121±60</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>120，超螺旋质粒</td>
 <td>71±38</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60，线性化质粒</td>
 <td>4±1</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1. 不同DNA量下的转化效率。

<ol><li>Abel, S., Theologis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transformation+of+Arabidopsis+leaf+protoplasts%3A+a+versatile+experimental+system+to+study+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a versatile experimental system to study gene expression.</a> Plant J. 5, 421-427 (1994).</li>
<li>Wood, A. J., Oliver, M. J., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bryophytes+as+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bryologist%22%5BJournal%5D)">Bryophytes as model systems.</a> Bryologist. 103, 128-133 (2000).</li>
<li>Schaefer, D. G., Zrÿd, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant J. 11, 1195-1206 (1997).</li>
<li>Schaefer, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in Physcomitrella patens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 4, 143-150 (2001).</li>
<li>Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+determining+the+efficiency+of+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Nucleic Acids Res. 33, e173-e173 (2005).</li>
<li>Cove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The moss Physcomitrella patens.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 339-358 (2005).</li>
<li>Kamisugi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+gene+targeting+in+Physcomitrella+patens%3A+homologous+recombination%2C+concatenation+and+multiple+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The mechanism of gene targeting in Physcomitrella patens: homologous recombination, concatenation and multiple integration.</a> Nucleic Acids Res. 34, 6205-6215 (2006).</li>
<li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+formin-mediated+actin-filament+elongation+is+essential+for+polarized+plant+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rapid formin-mediated actin-filament elongation is essential for polarized plant cell growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2009).</li>
<li>Sawahel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+foreign+DNA+into+Physcomitrella+protonemal+tissue+by+using+the+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transfer of foreign DNA into Physcomitrella protonemal tissue by using the gene gun.</a> Plant Mol. Biol. 10, 315-316 (1992).</li>
<li>Schaefer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transformation+of+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Stable transformation of the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Gen. Genet. 226, 418-424 (1991).</li>
<li>Cho, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+bombardment+mediated+transformation+and+GFP+expression+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Particle bombardment mediated transformation and GFP expression in the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Cells. 9, 14-19 (1999).</li>
<li>Ashton, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bryophyte+Physcomitrella+patens+replicates+extrachromosomal+transgenic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements.</a> New Phytol. 146, 391-402 (2000).</li>
<li>Hohe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+and+highly+standardized+transformation+procedure+allows+efficient+production+of+single+and+multiple+targeted+gene-knockouts+in+a+moss%2C+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">An improved and highly standardized transformation procedure allows efficient production of single and multiple targeted gene-knockouts in a moss, Physcomitrella patens.</a> Curr. Genet. 44, 339-347 (2004).</li>
<li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+is+essential+for+tip+growth+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Profilin is essential for tip growth in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant Cell. 19, 3705-3722 (2007).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文介绍的方法可实现将 DNA 简便且稳定地转化到Physcomitrella patens原生质体中。该方法最初是为Arabidopsis1开发的，但本文证明其在结构更简单且进化上不同的植物Physcomitrella patens的原生质体中同样具有良好的效果。因此，该方法经过少量优化后可适用于其他植物物种。可能的优化调整包括 MMg 溶液中的原生质体浓度、在 MMg 溶液及 PEG/Ca 溶液中的孵育时间等。在常规实验中，我们选择使用 60 μg DNA，因为转化子数量随 DNA 浓度增加而呈线性上升，直至达到该用量（表 1）。单次 60 μg DNA 转化可获得约 7000 个瞬时转化子或 200 个稳定转化子，从而便于对大量植株群体进行后续筛选与分析。
转化后的原生质体可使用液体铺板培养基或PRM-T进行铺板。尽管使用液体铺板培养基时再生效率较低，但当原生质体被超螺旋质粒转化时，我们选择此方法。如表1所示，使用超螺旋质粒DNA进行的转化可产生更多的转化子，因此即使使用液体铺板培养基，仍能获得大量植株。此外，使用液体铺板培养基铺板原生质体可实现更快的再生，这对于涉及瞬时表型的实验（如RNAi敲低实验9,15）尤为重要。另外，由于无需顶层琼脂，便于后续对植株进行免疫染色和RT-PCR分析9,15。

<table><tbody><tr><td>PPNH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>1.84 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;原生质体&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 3.4 mM Ca(NO₃)₂&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 1 mM MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 2.72 mM 酒石酸二铵&lt;br/&gt; 54 &amp;#x03BC;M FeSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 9.93 &amp;#x03BC;M H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 1.97 &amp;#x03BC;M MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 0.23 &amp;#x03BC;M CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 0.19 &amp;#x03BC;M ZnSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 0.22 &amp;#x03BC;M CuSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 0.10 &amp;#x03BC;M Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 0.168 &amp;#x03BC;M KI&lt;br/&gt; 添加0.7%琼脂以制备固体培养基。</td></tr><tr><td>PRM-B</td><td></td><td></td><td>PPNH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 用6%甘露醇和0.8%琼脂配制。加入10 mL 1 M CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 在倒平板前定容至1 L。 </td></tr><tr><td>PRM-T</td><td></td><td></td><td>PPNH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 用6%甘露醇和0.6%琼脂配制。加入0.5 mL 1M CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 使用前加至 50 mL。</td></tr><tr><td>液体铺板培养基</td><td></td><td></td><td>PPNH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 用不含琼脂的8.5%甘露醇溶液，加入0.5 mL 1M CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 使用前加至 50 mL。</td></tr><tr><td>2% 纤维素酶Driselase</td><td></td><td></td><td>将 4 g Driselase (Sigma D9515-25G) 加入 200 mL 8% 甘露醇中，室温下轻轻搅拌 30 分钟，4 ℃ 孵育 30 分钟&amp;deg;C，在室温下轻轻搅拌5分钟。以2,500 g离心10分钟，弃去沉淀。用0.22 &amp;#x03BC;m，并分装为10 mL等份冷冻保存。使用前于室温水浴中解冻。</td></tr><tr><td>MMg</td><td></td><td></td><td>0.4 M 甘露醇&lt;br/&gt; 15 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 4 mM MES（pH 5.7）</td></tr><tr><td>PEG/Ca</td><td></td><td></td><td>4 g PEG4000&lt;br/&gt; 3 mL H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2.5 mL 0.8 M 甘露醇&lt;br/&gt; 1 mL 1M CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>W5</td><td></td><td></td><td>154 mM NaCl&lt;br/&gt; 125 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 5 mM KCl&lt;br/&gt; 2 mM MES（pH 5.7） </td></tr></tbody></table>

高效的聚乙二醇（peg）介导的苔藓physcomitrella patens转化方法

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

本文介绍了一种简单且高效的Physcomitrella patens原生质体转化方法。该方法改编自Physcomitrella原丝体原生质体和Arabidopsis叶肉原生质体转化的已有方案1。由于Physcomitrella patens具有高效的有丝分裂同源重组能力，近年来已成为重要的模式生物系统2。这种特性使其能够实现高频的基因靶向3-9，而这一现象在其他模式植物如Arabidopsis中并不存在。为了充分利用该系统，我们需要一种有效且简便的方法将DNA导入苔藓细胞。目前转化该苔藓最常用的方法是基因枪法（微粒轰击）10和聚乙二醇（PEG）介导的DNA吸收法11。尽管基因枪法可获得较高的转化效率12，但许多实验室难以获得基因枪设备，且该方法的实验流程较难标准化。相比之下，PEG介导的转化无需特殊仪器，任何具备无菌操作台的实验室均可开展。本文展示了一种简单且高效极高的苔藓原生质体转化方法。该方法每微克DNA可产生超过120个瞬时转化子，优于此前报道的最高效方案13。由于其操作简便、效率高且可重复性强，该方法既适用于需要大量转化子的研究项目，也适用于常规转化实验。

本文介绍了一种简单高效的Physcomitrella patens原生质体转化方法。该方法改编自Physcomitrella原丝体原生质体和Arabidopsis叶肉原生质体转化的实验方案1。

高效的聚乙二醇（PEG）介导的苔藓Physcomitrella patens转化方法

一种简单高效的转基因方法用于转化小立碗藓（Physcomitrella patens）原生质体。该方法改编自小立碗藓（Physocmitrella ...）的相关实验方案

本实验的总体目标是转化 SCO 米氏原生质体。首先用 Drizly 处理植物材料以进行消化，随后用甘露醇洗涤原生质体以去除 Drizly，最后将原生质体与 DNA 和聚乙二醇（PEG）共同孵育。最后，将转化后的原生质体接种到培养皿上并进行培养。最终可以获得结果，通过荧光显微镜观察到表达荧光标记蛋白的转化原生质体。本实验操作将由我实验室的博士后Y lu进行演示。该技术的主要优点在于其高效性，并能稳定地产生表达目标蛋白的原生质体。分离苔藓原生质体时，首先用刮铲将9毫升8%甘露醇加入培养皿中。将来自两到三个PP NH4平板、培养5至7天的苔藓放入甘露醇溶液中。有关本步骤及其他试剂的配方，请参见随附的书面实验方案。接着，加入3毫升2% Drizly，在室温下轻轻振荡孵育1小时。将混合物通过100微米筛网过滤，以获得绿色均匀的悬浮液。然后以250 ×g离心5分钟。小心弃去上清液。将原生质体重悬于500微升8%甘露醇溶液中。然后加入额外的9.5毫升8%甘露醇溶液。确保原生质体充分悬浮。再次以 250 G 离心五分钟，重复洗涤步骤两次。弃去上清液，并将原生质体重悬，首次重悬于 500 微升中。然后使用血细胞计数板，取9.5毫升8%的甘露醇。对10微升原生质体悬液进行计数，以将DNA转化至分离的原生质体中。首先，将原生质体混合物在250 ×g下离心5分钟。去除上清液，将原生质体以每毫升160万个的密度重悬于MMG溶液中。将悬液在室温下孵育20分钟。随后，将600微升原生质体溶液加入含有60微克DNA的培养管中。振荡混匀。轻轻加入 700 µL PEG 钙溶液并混匀。在此期间，将样品在室温下充分孵育 30 分钟。用玻璃纸覆盖 PRMB 平板。然后用三毫升 W5 溶液稀释悬浮液，在 250 ×g 条件下离心五分钟。去除 PEG 后，将原生质体重悬于两毫升 PRMT 溶液中，每张覆盖有玻璃纸的 PRMB 平板接种一毫升。将平板置于 25 摄氏度的培养箱中培养。最后，在转化后的第四天，将羊皮纸膜转移到新鲜的选择培养基平板上。该图显示了由原生质体再生的18天龄植株示例，这些原生质体使用携带潮霉素抗性表达盒的15微克超螺旋质粒DNA进行转化。此处，将30微克相同的超螺旋质粒DNA转入原生质体中。本样品中转化了60微克的格子状DNA。最后，这些植株由原生质体再生而来，这些原生质体被转化了120微克携带潮霉素抗性盒的相同超螺旋质粒DNA。转化效率不受高达60微克DNA浓度的影响。然而，过高的DNA浓度会对该实验步骤产生不利影响。数据表明，该方法在较宽范围的DNA用量内均可获得稳定一致的结果，每学期进行一次即可。若操作得当，该技术可在三小时内完成。通过此操作流程，还可进行瞬时RNA干扰和基因敲除等其他方法，以回答有关基因功能的更多问题。

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