Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

该程序的总体目标是转化 SCO Metre 原生质体。这是通过首先用 Drizly 消化植物来实现的。接下来，用甘露醇洗涤原生质体以去除 drizly，然后与 DNA 和 peg 一起孵育。

最后，将转化的原生质体铺布到平板上并孵育。最终，可以获得结果。通过荧光显微镜显示表达荧光标记蛋白质的转化原生质体 演示该程序的是我实验室的博士后 Y lu。

该技术的主要优点是它有效且始终如一地产生表达目标蛋白质的原生质体 为了分离苔藓，原生质体首先使用刮刀将 5 到 7 天龄的苔藓从 2 到 3 个 PP NH 4 板中加入培养皿中 5 到 7 天大的苔藓放入甘露醇中。请参阅随附的书面方案，了解此试剂配方和其他试剂配方。接下来，加入 3 毫升 2% drizly，在室温下轻轻摇动孵育 1 小时。

通过 100 微米网孔过滤混合物，以获得绿色均匀的悬浮液。然后将滤液以 250 G 离心 5 分钟。非常轻柔地弃去上清液。

将原生质体重悬于 500 微升 8% 甘露醇中。然后再加入 9.5 毫升 8% 甘露醇。确保原生质体完全悬浮。

再次以 250 G 离心溶液 5 分钟，再执行两次洗涤步骤。丢弃上清液并复苏悬浮原生质体。首先在 500 微升中。

然后使用血细胞计数器加入 9.5 毫升 8% 甘露醇。计数 10 微升悬浮液中的原生质体数量，以将 DNA 转化为分离的原生质体。首先，将原生质体混合物以 250 G 离心 5 分钟。

去除上清液，以每毫升 160 万个的浓度重悬原生质体在 MMG 溶液中。将悬浮液在室温下孵育 20 分钟。接下来，将 600 微升 Protoplasts 溶液添加到含有 60 微克 DNA 的培养管中。摇。

轻轻加入 700 微升 PEG 钙溶液并摇匀。在此等待期间，将样品在室温下孵育 30 分钟。用玻璃纸覆盖 PRMB 板。

然后用 3 毫升 W 5 溶液稀释悬浮液，以 250 G 离心 5 分钟。为了去除 PEG 重悬液，两毫升 PRMT 板中的原生质体每个 PRMB 板 1 毫升，覆盖有玻璃纸。将板保持在 25 摄氏度的生长室中。

最后，转化后四天，将玻璃纸移到新的选择板上。该图显示了从原生质体再生的 18 日龄植物的实例，用 15 微克超卷曲血浆、DNA 转化，携带潮霉素抗性盒。在这里，将 30 μg 相同的超螺旋质粒 DNA 转化到原生质体中。

在该样品中转化了 60 μg 格子 DNA。最后，这些植物从原生质体中再生，原生质体用 120 μg 携带潮霉素抗性盒的相同超螺旋血浆 DNA 转化。转化效率不受高达 60 μg DNA 浓度的影响。

然而，较高浓度的 DNA 对该程序有害。数据表明，该方法在广泛的 DNA 量范围内提供一致的结果。如果执行得当，这项技术可以在三个小时内完成。

按照此程序，可以执行其他方法，如瞬时 RNAi 和基因敲除，以回答有关基因功能的其他问题。