Name: 高密度的自由移动，使用基于聚酰亚胺的微电极的小鼠的脑电图记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T21:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: 学习在小鼠模型中使用聚酰亚胺微电极阵列进行高密度脑电图记录的外科手术方法。该方案包括立体定向手术植入、术后恢复及数据采集分析，为神经科学研究提供高质量脑活动记录技术。

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由KIST基金（2E21510）、教育部国家荣誉科学家计划以及韩国国家研究基金会通过教育部、科技和知识经济部资助的脑科学原创技术研究计划（2010-0018944）支持。

1. 摘要
C57BL/6J - 129S4/SvJae 杂交小鼠（12~15 周龄）通过腹腔注射氯胺酮（120 mg/kg）和赛拉嗪（6 mg/kg）混合物进行麻醉。手术前通过夹捏尾巴或脚趾检查麻醉深度。小鼠固定于立体定位仪（David Kopf Instruments，型号 902，Calif，USA）。在利多卡因局部处理以减轻疼痛后，沿中线切开头皮约 25 mm，暴露颅骨。使用生理盐水浸湿的棉签擦拭颅骨表面残留物，以增强电极与颅骨的贴附性。标记前囟和后囟点，并调整至同一水平面。将基于聚酰亚胺的微电极阵列（PBM-array）放置，使其垂直中线与颅骨中线对齐。前囟点应位于第 5th PBM阵列前部的电极层。在颅骨边缘的空白区域使用两到三个微型螺钉，以牙科水泥固定电极位置。为支撑PBM阵列连接器，我们在头部中线位置放置一个支撑杆，并用牙科水泥覆盖固定。待水泥固化后，缝合切口皮肤，并给予至少5天的恢复期。恢复期间，小鼠单独饲养于笼中，自由获取食物和饮水。恢复后进行脑电图（EEG）记录。动物护理、手术及记录程序均遵循韩国实验动物护理法规1992年法案及机构动物护理与使用委员会（IACUC）相关指南。本文所用PBM阵列的制备方法如Choi et al.所述。1 请联系作者以获取视频中使用的相同PBM阵列。
2. 实验步骤
<ol>
<li>准备灭菌的手术器械和立体定位仪。</li>
<li>用麻醉剂（例如，腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪，剂量分别为120和60 mg/kg）对小鼠进行麻醉。手术前通过尾部或脚趾夹捏以检测麻醉深度。</li>
<li>将小鼠固定在立体定位仪上，将耳杆插入小鼠耳道并拧紧固定。可用生物相容性凝胶（如凡士林）覆盖眼睛，防止手术灯光导致眼睛干涩。用70%乙醇润湿小鼠头部后，剃除头部毛发。</li>
<li>用手术刀在头部切开约25 mm。建议在头皮下注射少量2%盐酸利多卡因。使用微型钳子（Fine Science Tools (USA), Inc., 18052-03, Calif, USA）夹住皮肤，以保持切口充分张开。</li>
<li>用生理盐水浸湿的棉签擦拭颅骨上残留的组织碎片，以增强PBM阵列与颅骨的贴合性。使用过氧化氢去除膜残留物同样有效。</li>
<li>在颅骨上找到前囟点（bregma）和后囟点（lambda），并用油性记号笔标记。将PBM阵列放置，使其垂直中线与颅骨中线对齐，如图1所示。将前囟点置于第5行的中间位置th 用一滴自来水润湿PBM阵列前部的表面。从内侧向外侧轻轻擦拭薄膜电极，以确保更好地贴合。为了帮助薄膜电极更紧密地贴附在颅骨上，应使其在颅骨上完全干燥。薄膜电极依靠范德华力固定在颅骨上。当需要重新定位电极时，需再加一滴自来水，以防止电极撕裂。 
<img src="/files/ftp_upload/2562/2562fig1.jpg" alt="电极定位；神经信号记录；脑活动分析；示意图；实验装置。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. （左）小鼠颅骨上的PBM阵列。PBM阵列的前后轴与前囟（BP）和后囟（LP）之间的连线对齐。（右）小鼠脑表面的假定电极位置。小鼠脑解剖结构源自布鲁克海文国家实验室提供的成年C57BL/6J小鼠脑三维MRI数字图谱数据库，电极位置根据立体定位测量结果标出。右侧图中标注了接地（G）和参考（Ref）电极。</li>
<li>在颅骨的开放区域标记至少三个位置，然后使用牙科钻在这些位置钻孔，用于固定支撑用的微型螺钉。这些微型螺钉起到支柱作用，为颅骨上的牙科水泥提供机械支撑。钻孔时需格外小心，由于小鼠颅骨较薄，钻孔过程中容易发生出血。若出现出血，应立即停止钻孔，并向孔内加入少量止血粉。</li>
<li>将牙科丙烯酸树脂水泥（Vertex-Dental，Vertex Self-Curing，荷兰）涂抹于PBM阵列、固定螺钉及颅骨其余部位表面。将牙科水泥调配至黏稠胶状状态。</li>
<li>将一根硬质棒作为支撑杆，使用强力胶（例如 Loctite，Henkel Loctite Corp，Dublin，Ireland）固定在头部中央。在连接器平面的背面贴上双面胶带。调整 PBM 阵列连接器的位置，使其与支撑杆的顶端对接。连接器与颅骨之间的垂直距离应大于 5 mm。使用强力胶将连接器平面与棒的顶端粘合，以增强粘附性。</li>
<li>确保牙科水泥完全固化，然后将牙科丙烯酸水泥涂覆于颅骨及连接器底面，以将连接器固定在颅骨上。</li>
<li>移除微型夹具。使用无菌缝合线缝合切开的皮肤。将小鼠从装置上取下。可额外涂抹牙科丙烯酸水泥以保护暴露的颅骨。在水泥周围及缝合的皮肤处涂抹抗生素（夫西地酸软膏，韩国东和药房）。</li>
<li>将小鼠置于无菌笼具中饲养，直至其恢复至原始体重（约5至7天）。建议在此期间不要引入同笼伙伴。</li>
<li>恢复后，使用轻量级印刷电路板（PCB）连接器将小鼠连接至多通道脑电图放大器系统（Synamps）的头盒2美国北卡罗来纳州）的独立笼具中。连接管路应小心处理，避免缠绕。</li>
<li>经过1小时的适应后，进行脑电图（EEG）记录。本实验使用Scan 4.4.（美国北卡罗来纳州）采集软件。图2显示了典型的小鼠EEG时间轨迹集合。建议同步记录视频，以便关联小鼠的行为表现。</li>
<li>获得的信号可通过 MATLAB（MathWorks，Natick，MA，USA）进行分析，以生成脑地形图。图 3 展示了小鼠脑 EEG 功率图的示例地形图。</li>
</ol>
3. 代表性结果
如果上述手术操作正确执行，将能够成功完成40通道小鼠脑电图记录，且无不良通道。下图显示了典型的原始脑电图轨迹及地形图。
<img src="/files/ftp_upload/2562/2562fig2.jpg" alt="脑电图波形图、脑电活动分析、时间序列数据、尖峰检测过程。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 注射γ-丁内酯（GBL，50 mg/kg，腹腔注射）诱导失神发作期间的脑电图（EEG）示例记录。红色条形表示失神发作期间的棘-慢波放电（SWDs）。横轴和纵轴分别表示时间和电压。通道编号遵循图1（右）中定义的导联组合。
<img src="/files/ftp_upload/2562/2562fig3.jpg" alt="脑活动热图对比：基线与棘慢波放电（SWDs）期间的功率水平由颜色梯度表示。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 拓扑图显示了2-6 Hz频段的功率分布。色标中的数值表示功率图的颜色尺度。在γ-丁内酯（GBL，50 mg/kg，腹腔注射）诱导产生棘慢波放电（SWDs）期间，大脑广泛额顶叶皮层区域的功率显著高于GBL注射前（基线）的功率水平。

<ol><li>Choi, J. H., Koch, K. P., Poppendieck, W., Lee, M., Shin, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+Electroencephalography+in+Freely+Moving+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">High resolution Electroencephalography in Freely Moving Mice.</a> J Neurophysiol. , Forthcoming.</li>
<li>Lee, M., Shin, H. S., Choi, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recording+of+brain+activity+and+functional+connectivity+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Conf+Proc+IEEE+Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recording of brain activity and functional connectivity in the mouse brain.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2934-2936 (2009).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文报道了在自由活动的小鼠中获取高密度脑电图（EEG）的手术与记录方法。该方法使我们能够从小鼠模型中获得功能性脑图谱，以研究自发节律性1,2或事件相关脑活动的分子机制。
获取PBM阵列中所有通道的信号是实现全脑图谱绘制的必要条件，然而为每个通道建立稳定接触非常具有挑战性。为了保持各通道与颅骨之间的稳定接触，以下操作步骤至关重要。首先，颅骨表面的任何组织碎屑都可能导致电极与颅骨分离，因此必须使用无菌棉签彻底清除所有组织碎屑，并将颅骨表面擦干。其次，PBM阵列依靠范德华力附着于颅骨表面，建议在放置PBM阵列前，在颅骨表面滴加一滴自来水以形成水膜，有助于增强贴附效果。第三，牙科水泥的黏稠度必须适中：若过于稀薄，可能在PBM阵列下方形成绝缘层；若过于浓稠，则牙科水泥会因自身重量而容易从颅骨上脱落。最后，应在颅骨上植入至少三个支撑用的微型螺钉，以使牙科水泥牢固地固定在颅骨上。这些微型螺钉能够支撑牙科水泥并稳固头戴装置，对于长期实验研究尤为关键。
由于PBM阵列的尺寸和重量，其应用将仅限于成年小鼠的慢性研究。根据我们的经验，体重超过25 g的小鼠适合使用。在进一步的应用中，可通过PBM阵列分支之间的空白区域引入次级电极，用于记录或刺激目的。

<table><tbody><tr><td>&amp;#947;丁内酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7629-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

基于聚酰亚胺的微电极对自由活动小鼠进行高密度脑电图记录

High-density EEG Recordings of the Freely Moving Mice using Polyimide-based Microelectrode

脑电图（EEG）反映了大规模神经元群体的平均电活动，广泛用作认知神经科学中无创脑功能监测工具，以及神经病学中癫痫和睡眠障碍的诊断工具。然而，EEG节律生成的潜在机制仍不明确。近年来引入的基于聚酰亚胺的高分辨率小鼠脑电微电极阵列（PBM-array）1，旨在利用小鼠模型丰富的遗传资源，探究复杂EEG生成过程中的神经生理学问题。将这种纳米制造的PBM-array应用于小鼠颅骨，是记录转基因小鼠大规模脑活动的有效工具，并有助于结合行为学识别特定EEG节律的神经关联。然而，PBM-array超薄的厚度和分叉结构使其在操作和植入过程中存在困难。本视频详细展示了PBM-array在小鼠颅骨上植入的准备与手术步骤，并提供了有助于研究人员成功完成植入的操作与手术技巧。

本文介绍了在小鼠颅骨上植入超薄聚酰亚胺基微电极阵列（PBM-array）以获取小鼠模型高密度脑电图（EEG）的手术步骤及操作要点。

脑电图（EEG）反映了大规模神经元群体的平均电活动，被广泛用于……

大家好，我是来自韩国科学技术院神经科学中心Gen Choice实验室的Mina Lee。今天我们将演示在基于多通道微电极阵列的大鼠模型中进行高密度脑电图记录的实验条件。该实验流程包括仪器准备、动物手术前处理以及立体定位手术操作。手术后，我们将进行脑电图记录，然后分析数据。现在开始吧。在开始手术前，先安装好立体定位仪并准备好所有所需的材料。环境应当保持清洁。准备进行手术的小鼠。今天我将使用一只17周龄的C57BL/6J × 129S4/SvJae杂交小鼠来演示手术过程。我们也可以使用体重超过25克的小鼠。通过腹腔注射含有每千克120毫克的氯胺酮和每千克6毫克的赛拉嗪的混合物来麻醉小鼠。轻轻捏住小鼠尾巴或脚趾，以确保小鼠已充分麻醉，可以进行手术。开始手术时，将动物固定在立体定位仪上。依次将耳杆插入小鼠的耳道并固定牢固。在其头部滴加一些甲醇，然后塑形其头部的毛发区域。注射后，从两眼之间至两耳之间的颅骨处做一个前后方向的切口。使用微型钳夹夹住小鼠皮肤，以保持切口张开。用灭菌的棉签清除颅骨上残留的任何组织或膜。将记号笔置于其头部上方。标记BMA lambda点。然后取下记号笔，使用一支旧的优质笔标记这些点。准确到位。将薄膜电极移至头部上方，并在颅骨上滴一滴 T 水。将BMA放置在多层最佳微电极阵列的安大略结构第五层的中央位置。使用柔软的棉签从内侧向外侧小心地擦拭薄膜。等待数分钟，直至其完全干燥。这有助于更好地定位。使用油性笔在剩余空间处标记三个点，这些点即为钻孔位置。钻孔时需格外小心，避免触碰颅骨内部。将三根灭菌线导向螺钉放置于颅骨上，并旋紧至牢固固定。配制一批浓度较高的液态精确齿科水泥，覆盖薄膜电极螺钉及颅骨其余部分。再制备一批，并用它完全覆盖电极。再次露出螺丝以固定电极。请记住，此人不应位于薄膜电极下方。将背面带有胶带的双号标志贴在连接器平面的背面。使用强力胶将一根硬质细棒作为绑带固定在颅骨中部。在本次实验中，我使用棉签切割端的尖端作为该细棒，调整连接器的位置使其向后移动，直至与切割位置的尖端接触。颅骨与连接器之间的距离应大于五毫米。在棉签末端涂抹强力胶，将连接器底面粘附其上。使用丙烯酸类骨水泥覆盖其余暴露区域。水泥固化后，取下夹具并搅动皮肤。将小鼠从耳廓处移开，并覆盖多余空间。使用丙烯酸牙科水泥，在水泥周围及缝合区域涂抹抗生素钠盐。将小鼠放入单独的笼子中，并给予五天的恢复期。将小鼠连接至脑电图（EEG）设备，进行电极点燃，并提供超过一小时的适应时间。一小时后开始脑电图记录，我们在小鼠模型中使用基于聚合物的微电极阵列获取了高密度脑电图数据。进行此操作时，重要的是要记住轻柔地处理薄膜电极，因为它仅有七微米厚。在调整电极位置时，需要一滴自来水。如果省略此步骤，电极容易发生翻转，同时需确保使用高黏度丙烯酸树脂制作的牙科材料不会渗透到薄膜下方。记录完成后，我们使用 meth lab 进行离线分析，绘制多种脑图谱，以清晰地可视化小鼠的脑部活动。这是注射 GBL 后的代表性多通道 EEG 信号。在左侧面板中，可以看到注射 GBL 后的代表性多通道 EEG 信号，右侧面板亦然。展示了脑地形图，包括平均功率时间延迟、平均峰值强度以及癫痫发作起始的平均概率图。以上就是全部内容。感谢观看。

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