核酸微量定量的NanoDrop法

NanoDrop 样品保留系统是一种创新技术，利用液体固有的表面张力，在无需使用石英比色皿（QTS）或毛细管的情况下，将微量样品固定并测量于两个光学基座之间。仅需将一微升样品直接移取到下部光学表面之上。当闭合光谱仪臂时，上下光学基座之间即形成一个液柱。

由于表面张力形成垂直光路，该垂直光程可在测量过程中实时自动调整。缩短光程使得能够测量更高浓度的样品，从而有效避免了大多数核酸样品所需的稀释步骤。此外，样品保留系统通过快速清洁显著加快了实验进程，清洁过程仅需使用实验室擦拭纸擦拭光学表面即可。

今天我们将演示使用赛默飞世尔科技的微量仪器测定核酸浓度的两种方法。第一种方案是使用NanoDrop 2000C分光光度计进行直接核酸测量。第二种方案是使用NanoDrop 3300荧光分光光度计进行间接荧光核酸测量。

开始时，用移液器吸取两到三微升洁净的去离子水，滴加至微量分光光度计样品保留系统的下部光学表面，清洁上下光学表面。关闭杠杆臂，确保上部基座与去离子水接触。抬起杠杆臂，用洁净、干燥且无绒的实验室擦拭纸擦拭两个光学表面。

接下来，打开 NanoDrop 软件并选择核酸应用。使用经过校准的小体积移液器，向底部光学表面滴加一微升缓冲液，进行空白测量。放下杠杆臂，并在核酸应用中选择“空白”。

空白测量完成后，使用实验室擦拭纸清洁两个光学表面。与之前相同，选择待测样品对应的适当常数。接着，将一微升核酸样品滴加到下部光学基座上，并合上杠杆臂。

由于该测量与体积无关，样品只需覆盖两个光学表面之间的间隙即可。进行测量时，在应用软件中选择“测量”，软件将自动计算核酸浓度和纯度比值。样品测量完成后，需查看光谱输出结果。典型的核酸样品具有非常特征性的图谱。

样品质量较差的光谱特征包括波谷区域和260纳米峰处出现波长片段异常。与特定核酸分离技术相关的常见污染物来源包括苯酚、三醇和柱提取法。在苯酚-三醇提取过程中，220至240纳米范围内的异常光谱，以及260至280纳米区域的峰位偏移，可能提示残留试剂污染。

相反，柱式提取中残留的胍可能在230纳米附近产生一个峰，并使230纳米处的吸收谷向约240纳米方向偏移。为了准确评估样品纯度，应结合整体光谱质量来分析260/280和260/30的比值。纯的核酸通常其DNA的260/280比值约为1.8，RNA则约为2.0。

该比值取决于用于空白和样品测量的缓冲液的 pH 值和离子强度。Banana drop 3, 300 荧光分光光度计采用了与 NanoDrop 2000 C 分光光度计相同的专利微量样品保留系统。荧光测量仅需一微升样品即可完成，用户可从三种 LED 中选择一种作为激发光源，光源以水平方向照射样品。

随后，以90度垂直角度收集样品的荧光信号，并导入内置光谱仪。为演示利用NanoDrop 3进行高灵敏度微量核酸定量，采用Pico Green荧光试剂盒，首先将试剂盒标准品及所有核酸样品平衡至室温。荧光样品对光敏感，应保存在棕色管或用铝箔包裹的试管中。

为所有待测标准品和样品以及所需的Pico Green工作液准备足量的1×TE缓冲液。按照生产商说明书，用无核水稀释所提供的20×TE缓冲液，配制1×TE缓冲液。反应体系体积可介于200微升至10微升之间。

在此示例中，我们将准备 10 微升反应体系。接下来，配制系列稀释的双链 DNA 标准品以及无核酸酶的离心管或试管，以覆盖待测 DNA 样品的预期浓度范围。

将每种稀释后的双链DNA标准品各5 µL转移至单独标记的无核酸酶琥珀色或铝箔包裹的离心管中。然后将每种待测的双链DNA样品各5 µL分装至相应避光保护的离心管中。按照生产商说明书配制Pico Green工作液后，向每根含有双链DNA标准品或双链DNA样品的离心管中加入等体积的工作液（本例中为5 µL）。

取等体积的XTE缓冲液和Pico Green工作液混合。制备作为参比溶液的阴性对照。用移液器轻轻吹打混匀各管中的内容物，并在室温下孵育五分钟。

所有标准品和样品在测量前应平衡至相同温度，因为荧光信号受温度影响。首先准备仪器并进行测量时，需清洁样品保留系统的下表面和上表面，用移液器吸取两到三微升去离子水，滴加到下部光学表面附近。然后打开杠杆臂，用干净的无绒实验室擦拭纸吸干上部和下部基座。

继续操作前，确保表面无绒毛残留，因为绒毛在激发光源下可能产生荧光，从而干扰测量。打开仪器软件。

选择核酸应用，然后选择Pico Green双链DNA选项，将两微升1×TE缓冲液移液至下部基座。关闭杠杆臂，并在仪器软件界面中选择空白。空白测定完成后，用吸水纸吸干样品保留系统的两面空白溶液。

接下来，使用低吸附枪头通过轻柔吹打混匀参比溶液。取 2 µL 参比溶液加入下部基座，然后合上杠杆臂。在标准品选项卡下选择“参比”，并选择所需的单位。

单击“测量”以启动测量循环。测量循环完成后，打开杠杆臂，彻底吸干样品保留系统的表面。使用新的Eloqua对参考样品进行最多五次重复测量，每次重复使用一个全新的Eloqua。

对其他标准品重复上述步骤，以建立标准曲线。最多可使用七种标准品。软件设计为每种标准品最多可存储五个重复样本的数据。

将标准品的重复测量值取平均值，生成标准曲线，由此自动确定样品浓度。标准曲线完成后，选择“样品”标签页，输入相应的样品编号信息，并测量每个未知样品。有效的曲线表明已达到所需标准品的最低数量要求。

DNA 浓度将根据标准曲线自动确定。NanoDrop 微量检测仪器可通过直接 A260 测量法或间接荧光测定法来确定核酸浓度。NanoDrop 分光光度计还可通过直接 A280 吸光度或蛋白质比色法测定蛋白质浓度。