克隆形成含量:贴壁细胞

大家好，我叫Lum，目前在Carianne博士的指导下，于贝伊迪心脏与糖尿病研究所攻读博士学位。Carianne博士是表观基因组医学实验室的负责人。在本视频中，我将演示一种名为克隆形成存活实验（Clonogenic Survival Assay）的操作流程。这是一种已有50年历史的技术，可用于评估不同处理方式（如辐射或化学试剂暴露）对细胞增殖能力的影响。

同源生存实验是辐射生物学中的一项核心技术，用于评估不同细胞系的辐射敏感性，并检验各种辐射防护或辐射增敏化合物的效果。当使用贴壁细胞系时，该冷冻生存实验包括三个阶段：首先，对单层贴壁细胞进行处理。

其次，制备单细胞悬液，并接种已知数量的细胞至标记的培养皿中；第三，在孵育一段时间后进行染色、计数并统计形成的克隆。在本视频中，我将使用永生化的人源支气管上皮细胞，来演示如何通过多克隆形成实验测定天然抗氧化剂的放射防护特性。实验前，在每个含有5毫升培养基的1225 cm²培养瓶中接种细胞，使实验当天每瓶细胞数量达到100万个。

将药物以不同浓度分别加入已标记的各烧瓶中，每瓶含五毫升培养基，终体积为50微升，以达到所需的浓度；本实验中使用五种不同浓度，并设一例溶剂对照组，即磷酸盐缓冲液（PBS）。加入药物后，细胞在适用于该细胞系的条件下孵育一小时。孵育结束后，除对照组外，其余各组均接受选定剂量的辐照，本实验中采用剂量为4 Gy，由铯源产生的γ射线提供。

照射后，弃去培养基，每瓶加入两毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤五分钟。弃去PBS后，每瓶加入两毫升0.05%胰蛋白酶，以使贴壁细胞从培养瓶中脱落。随后每瓶加入五毫升含10%胎牛血清的DMEM培养基，以终止胰蛋白酶的消化作用。

随后将筋膜的全部内容物转移至已标记的10毫升离心管中。操作完成后，将这些离心管以离心机离心5分钟，之后小心弃去上清液，注意不要扰动沉淀的细胞团，然后向每根离心管中加入5毫升培养基。还需计算每个样本的细胞浓度，并确定为达到所需最终细胞浓度时每个样本所需的体积，以便将细胞接种至每个样本5个培养皿，每培养皿含5毫升培养基。

例如，对于对照组，每个培养皿接种100个细胞，因此对于浓度较高的样品，需计算每25毫升含有500个细胞所需的体积；为尽量减少使用低于100微升体积时产生的误差，可进行10倍稀释或100倍系列稀释。然后将先前计算好的体积加入到一个Falcon管中，每份样品对应含有25毫升培养基的Falcon管。现在可将样品转移至预先标记好的培养皿中，每皿加入5毫升，以便于操作和转运。

将培养皿存放于一个大型、无菌或已消毒的容器中。随后将培养皿置于加湿培养箱内，在适当条件下培养八天。若在八天后使用角质形成细胞，需小心地从培养箱中取出培养皿，并在生物安全柜内逐一平铺放置。

操作时需小心轻柔，以免扰动已形成的菌落。打开皿盖后，向每个培养皿中加入 5 ml 0.9% 生理盐水进行冲洗。将移液器吸头对准培养皿的角落加入液体，避免接触皿底，以防意外刮落菌落。

五分钟后，小心吸出盐水。现在用三毫升的4%固定液固定集落，必须更换封条以避免蒸发。15分钟至半小时后，吸出固定液并妥善处理。

现在可使用0.1%结晶紫对菌落进行染色，每个培养皿中加入五毫升，半小时至一小时后盖上皿盖。随后用蒸馏水洗去染料，将培养皿倒置并过夜晾干。此时菌落已可进行计数。

可使用解剖显微镜手动计数菌落。任何包含50个或更多细胞的细胞簇均被视为一个菌落。至此，我们完成了同基因型存活实验的演示。

该实验方法相较于其他技术的主要优势在于其极高的灵敏度，即使在细胞杀伤达到六个对数级后，仍能检测到大范围内的细胞存活情况。这种高灵敏度是通过接种较大量的细胞来实现的。该实验还可轻松用于其他目的，例如检测细胞毒性。

感谢观看。