Name: 单粒子电子显微镜外切体综合重建，使用随机的锥形倾斜方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: 学习使用随机锥形倾斜法对酿酒酵母外切体复合物进行负染电子显微镜三维重建。本方法涵盖样品制备、倾斜图像采集及图像处理流程，可获得中等分辨率的生物大分子结构。

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作者感谢加州大学伯克利分校Nogales实验室成员在建立初始方案过程中提供的帮助，以及耶鲁大学Wang实验室成员在完善全部方案过程中给予的支持。我们同时感谢耶鲁大学医学院冷冻电镜设施和高性能计算中心工作人员提供的协助。HW是史密斯家族奖获得者。

<ol><li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angular+reconstitution%3A+a+posteriori+assignment+of+projection+directions+for+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction.</a> Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).</li>
<li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+from+random+and+nonrandom+tilt+series%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc+Tech%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series.</a> J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).</li>
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<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+and+image+classification+-+powerful+tools+in+modern+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Negative staining and image classification - powerful tools in modern electron microscopy.</a> Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+image+processing+for+single+particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).</li>
<li>Heel, M. van, Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).</li>
<li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN%3A+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li>
<li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comput+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).</li>
<li>Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+yeast+Rrp44+exosome+complex+suggests+routes+of+RNA+recruitment+for+3%27+end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3' end processing.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).</li>
<li>Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+for+electron+microscopy+single-particle+analysis+using+Xmipp%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp.</a> Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).</li>
<li>Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+random+conical+tilt+and+orthogonal+tilt+data+collection+using+feature-based+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation.</a> J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文中，我们详细介绍了一种利用负染色电子显微镜技术对外泌体复合物进行样品制备及三维重构的实验方案。通过该方法，我们在无需任何先验结构信息的情况下，采用随机锥形倾斜法获得了外泌体的三维重构图像。随机锥形倾斜法并不要求样品必须均一，但后续的投影匹配精细优化步骤则需要样品具备均一性，才能实现高分辨率的重构结果。
对于负染样品，染色层的厚度对于实现随机锥形倾斜法至关重要。染色过薄会导致在高倾斜角度下分子出现黑色晕圈，从而在重构过程中引入伪影；染色过厚则会降低显微照片中颗粒的信噪比。我们所使用的覆盖有一层薄连续碳膜的载网（带孔碳膜）有助于更轻松地实现最佳染色条件。自制的带孔碳膜载网可用 commercially available 的 Quantifoil 或 C-flat 等商品化带孔载网替代。然而，自制带孔碳膜上不规则分布的孔洞可能有助于在低倍和高倍下对倾斜显微照片进行对齐。
在本实验方案中，应特别注意透射电子显微镜部分，其中必须仔细进行图像对齐，以获得倾斜与未倾斜显微照片的对应区域，并使倾斜与未倾斜显微照片之间的重叠区域最大化...

<table><tbody><tr><td>聚乙烯醇缩甲醛树脂</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63450-15-7</td><td></td></tr><tr><td>甲酸铀酰</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22451</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost 显微镜载玻片</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>4951F-001</td><td></td></tr><tr><td>400 目常规网格</td><td>SPI Supplies</td><td>3040C</td><td></td></tr><tr><td>碳镀膜仪 Auto 306</td><td>Edwards Lifesciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai-12 透射电子显微镜</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>辉光放电器</td><td>BAL-TEC</td><td></td><td>溅射镀膜仪 SCD 005</td></tr></tbody></table>

利用随机锥形倾斜法通过单颗粒电子显微镜重构外泌体复合物

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

单颗粒电子显微镜（EM）重构技术近年来已成为获取大分子复合物三维（3D）结构的常用工具。与X射线晶体学相比，该技术具有一些独特的优点。首先，单颗粒EM重构无需对蛋白质样品进行结晶，而结晶正是X射线晶体学中的瓶颈环节，尤其对于大分子复合物而言。其次，该技术不需要大量的蛋白质样品。相比晶体学通常所需的毫克级蛋白量，采用负染EM方法进行单颗粒EM重构仅需数微升纳摩尔浓度的蛋白质溶液。然而，尽管对于少数具有高对称性的大分子组装体可获得较高分辨率，但对于许多样品——尤其是缺乏对称性的样品——单颗粒EM通常只能达到相对较低的分辨率（低于1 nm）。此外，该技术还受限于所研究分子的大小，一般而言，负染样品的分子量下限约为100 kDa，冷冻水合样品约为300 kDa。
对于结构未知的新样品，我们通常使用重金属溶液通过负染色法将分子包埋。随后在透射电子显微镜下观察样品，获取分子的二维（2D）显微图像。理想情况下，蛋白质分子具有均一的三维（3D）结构，但在显微图像中呈现出不同的取向。这些显微图像被数字化，并在计算机中作为“单颗粒”进行处理。通过二维对齐和分类技术，将具有相同视角的均一分子聚类成不同类别。对各类别进行平均处理可增强分子二维形状的信号。在为颗粒分配适当的相对取向（欧拉角）后，即可将二维颗粒图像重构为三维虚拟体积。
在单颗粒三维重构中，一个关键步骤是正确确定每个单颗粒的取向。目前有多种方法可用于为每个颗粒分配视角，包括角重构法1和随机锥形倾斜（RCT）方法2。在本实验方案中，我们描述了利用负染电镜结合随机锥形倾斜法获得酵母外切体复合物三维结构的具体操作流程。需要指出的是，我们的电镜实验与图像处理流程遵循RCT的基本原理，但并非实施该方法的唯一途径。我们首先介绍如何将蛋白质样品嵌入厚度与蛋白质分子尺寸相当的甲酸铀酰层中，所用载网为带有连续超薄碳膜的多孔碳支持膜。随后将样品插入透射电子显微镜，采集未倾斜（0度）和倾斜（55度）的显微图像对，用于后续处理并获得酵母外切体的初始三维模型。为此，我们先进行随机锥形倾斜重构，再通过投影匹配优化方法3对初始三维模型进行精细优化。

本文介绍了一种利用负染电子显微镜（EM）获取生物大分子三维（3D）结构的标准化方法。在本实验方案中，我们详细说明了如何采用随机锥形倾斜重建法（RCT），在中等分辨率下获得酿酒酵母外切体复合物的三维结构。

单颗粒电子显微镜（EM）重构技术最近已成为获取大型复合物三维（3D）结构的一种常用工具……

以下实验的总体目标是利用随机锥形倾斜法获得外泌体复合物的三维结构。首先，在载网的孔碳膜上沉积一层薄碳膜，以制备用于蛋白质复合物及染色的支持基质；第二步是将样品和染色剂施加到载网上，从而使样品包埋于重金属盐中。随后进行电子显微镜观察，以获取样品显微照片的倾斜对。最终，通过使用随机锥形倾斜法进行图像分析，得到显示外泌体复合物三维结构的结果。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为随机锥形倾斜法的样品制备有时较为困难，且后续图像处理流程也具有挑战性。该方法的演示至关重要，因为如果不通过图示展示样品评估过程，分级和样品制备步骤将难以掌握。随机锥形倾斜法的原理要求在电子显微镜内对同一区域的样品拍摄一对显微照片：一张是在样品未倾斜状态下拍摄，另一张则在样品倾斜50至70度角时拍摄。通过计算机将数字化的显微照片成对并列放置，并在此图示中选取来自相同颗粒的图像。这些图像以三维坐标中的数字标记。未倾斜颗粒的图像与其倾斜配对图像通过倾斜轴的方向和倾斜角度相互关联。通过未倾斜颗粒图像的对齐，利用填充了方位空间的多个倾斜颗粒图像，将倾斜颗粒的图像带至其相应的asMule位置，从而可以使用反投影算法重构分子的三维结构。首先制备网格，通过将0.45克聚乙烯醇缩甲醛树脂和90毫升氯仿加入100毫升玻璃烧杯中，配制0.5%的form VAR溶液。在通风橱中，用铝箔覆盖烧杯并溶解电木酚醛树脂。使用小型搅拌子和磁力搅拌器，树脂大约需要15分钟溶解。同时，用甲醇和无尘纸清洁预先清洗过的显微镜玻片。待成形用树脂完全溶解于氯仿后，向溶液表面加入一毫升50%甘油。通过调节所加甘油的体积，可影响载碳膜上孔洞的密度。将超声波探头尖端插入溶液中。在约一英寸深度处，以最大功率超声处理一分钟，使甘油形成液滴并分散于溶液中形成乳液。延长超声时间将导致多孔碳中的孔径变小。此步骤后，溶液会变得浑浊。超声处理后立即将洁净的玻璃片垂直浸入乳液中，一秒钟后取出，并用滤纸擦拭玻片底部，以在玻片表面形成一层薄塑料膜。氯仿挥发后，在光学显微镜下检查薄膜上孔洞的密度和大小。此处所述的制备条件应在400目网格的每个方格内产生10至20个孔洞，孔径介于3至4微米之间。待玻璃载片干燥后，沿载片表面切割塑料薄膜的边缘。将载玻片垂直浸入水中，使薄膜漂浮在蒸馏水表面。在斜射光下以掠射角度观察水面上的薄膜。将400目铜网逐个放置在薄膜上，铜网光滑面朝下。使用一张纸拾取带有网格的塑料膜。将纸翻转并使其干燥。在培养皿中，用甲醇浸泡该纸以去除孔中残留的甘油，并让纸自然晾干。使用碳蒸发仪在载网上镀上一层厚度约为20纳米的碳膜。通过控制蒸发时间来调节所需厚度。可通过与已知厚度碳层的灰色进行比较，根据碳膜的灰色程度判断其厚度。将碳支持膜铜网浸入玻璃培养皿中的氯仿内半小时，以去除火棉胶，随后干燥铜网，即可制备出自制的穿孔碳膜铜网。接下来，在新解理的云母

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单粒子电子显微镜外切体综合重建，使用随机的锥形倾斜方法

本视频介绍了制备包埋外泌体超薄切片的技术。这些切片可进一步通过透射电子显微镜（TEM）进行染色和成像，以研究外泌体的结构特征。...

包埋外泌体的切片、染色及透射电镜成像：利用透射电镜观察外泌体结构特征的实验方案

胆汁是细胞外囊泡/外泌体的宝贵来源，其中可能含有重要的生物标志物。本方案提供了一种可靠的方法，用于从人胆汁中分离外泌体，以便进行后续分析，包括miRNA谱型分析。...

从人胆汁中分离和分析含微小RNA的外泌体

本文介绍了一种使用软件套件SPHIRE处理冷冻电镜图像的实验方案。该方案几乎适用于所有以接近原子级分辨率为目标的单颗粒电镜研究项目。...

使用 SPHIRE 从电子冷冻显微镜图像进行高分辨率单颗粒分析

本方案描述了进行透射电子显微镜观察所需的多种技术，包括负染色法、用于观察精细结构的超薄切片法，以及免疫金标记法以确定外泌体中特定蛋白质的位置。...

外泌体的透射电子显微镜样品制备与成像

冷冻电子显微镜中的单颗粒分析是用于高分辨率解析生物大分子复合物结构的主要技术之一。Scipion...

冷冻电镜与Scipion单颗粒分析

利用冷冻电镜（cryoEM）解析大分子复合物的结构已成为某些类别蛋白质和复合物的常规方法。本文概述了该流程（包括样品制备、筛选、数据采集与处理），并引导读者参考更详细的资源，以针对更具挑战性的样品调整相关变量。...

单颗粒冷冻电子显微镜：从样品到结构

直接随机光学重建显微镜（dSTORM）可用于突破光学显微镜的典型衍射极限，从而在纳米尺度下观察外泌体。该技术可在二维和三维条件下用于外泌体的表征。...

三维细胞外囊泡的直接随机光学重建显微镜成像

本文介绍了如何有效利用三种冷冻电镜处理平台——cryoSPARC v3、RELION-3 和 Scipion...

一种基于 cryoSPARC、RELION 和 Scipion 的稳健单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）处理流程

Septins 是细胞骨架蛋白。它们可与脂质膜相互作用，并能够在微米尺度上感知甚至产生膜曲率。本实验方案中，我们描述了自下而上的体外（in vitro）方法，用于分析膜形变、对曲率敏感的 septin 结合行为以及 septin...

自下而上法 体外 检测Septin超微结构组织、膜重塑及曲率敏感行为的方法

本方案描述了一种通用且易于实施的冷冻电镜实验中倾斜单颗粒数据采集方法。该方法对于因样品吸附于气液界面而导致优势取向偏差的样本，尤其有助于获得高质量的电镜三维结构图。...

使用 Leginon 进行样品台倾斜的单颗粒冷冻电镜数据采集

学习使用随机锥形倾斜法对酿酒酵母外切体复合物进行负染电子显微镜三维重建。本方法涵盖样品制备、倾斜图像采集及图像处理流程，可获得中等分辨率的生物大分子结构。

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