单粒子电子显微镜外切体综合重建，使用随机的锥形倾斜方法
March 28th, 2011
本文介绍了一种标准的方法来获得一个生物大分子的三维（3D）重建使用负染色电子显微镜（EM）的。在这个协议中，我们将解释如何使用随机的锥形倾斜重建方法（RCT）的决议中等酿酒酵母外切体复杂的三维结构。
以下实验的总体目标是使用随机圆锥倾斜法获得外泌体复合物的三维结构。这是通过首先在圣碳网格上沉积一层薄薄的碳膜来实现的，作为第二步，作为蛋白质复合物和染色剂的支撑底物。将标本和染色剂涂在网格上，网格将标本埋入重金属盐中。
然后进行电子显微镜检查以获得样品的倾斜对显微照片。最后，通过使用随机锥形倾斜法进行图像分析，获得了显示外泌体复合物三维结构的结果。通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为有时为随机锥形倾斜法准备标本很困难，而且 View 之后的图像处理程序也很困难。
这种方法的演示至关重要，因为如果没有样品评估的插图，很难学习等级和样品制备步骤。随机锥形倾斜法的原理要求在电子显微镜内拍摄样品相同区域的一对显微照片。一张照片是标本未倾斜的位置拍摄的，另一张照片是标本倾斜 50 到 70 度的角度使用计算机，将数字化的显微照片对并排放置，并在此图中选择来自相同颗粒的图像。
这些图像由三维坐标中的数字标记。未倾斜颗粒及其倾斜伙伴的图像通过倾斜轴的方向和倾斜角度相互关联。未倾斜粒子图像的对齐使用充满方位角的倾斜粒子的多个图像将倾斜粒子的图像带到相应的 aMule 位置，可以使用反向投影算法重建分子的三维结构，首先制造网格，通过添加 0.5 克聚乙烯醇基形式树脂制备 0.5% 的 VAR 溶液， 将 90 毫升氯仿加入 100 毫升玻璃烧杯中。
在通风橱中，用铝箔盖住烧杯并溶解 var 树脂形式。使用小搅拌棒和磁力搅拌，树脂大约需要 15 分钟才能溶解。同时，用甲醇和 Kim 湿巾清洁预清洁的显微镜载玻片。
形成 var 树脂后完全溶解。在氯仿中，向溶液表面加入 1 毫升 50% 甘油。调整添加甘油的体积会影响圣碳中孔的密度。
将超声波的尖端倾斜到溶液中。在大约 1 英寸的深度处，使用最大功率进行超声处理 1 分钟，这将以我们的溶液形式形成甘油液滴乳液。较长的超声处理会导致圣碳上的孔尺寸变小。
此步骤后，溶液变为乳白色。超声浸渍后，干净的玻璃立即垂直滑入乳化液中。用一秒钟的时间，将它们取出并用滤纸吸干载玻片的底部，在载玻片表面形成一层薄塑料膜。
氯仿蒸发后，在光学显微镜下检查薄膜上孔的密度和大小。此处描述的制备条件应在 400 目网格的每个正方形上产生 10 到 20 个孔，直径在 3 到 4 微米之间。载玻片干燥后，在载玻片表面切下塑料薄膜的边缘。
通过将玻片垂直浸入水中，将薄膜漂浮在蒸馏水表面。水面上的薄膜可以在光反射的掠射角下观察到。将 400 目铜网格一个接一个地放在薄膜上，网格光滑的表面朝下。
用一张纸捡起上面有网格的塑料薄膜。翻转纸张并晾干。在培养皿中，将纸张浸泡在甲醇中，以去除孔中残留的甘油，然后让纸张自然干燥。
使用碳蒸发器在网格上涂上一层碳，厚度约为 20 纳米。使用蒸发时间来控制所需的厚度。厚度可以通过碳的灰色与已知厚度碳层的灰色进行比较来确定。
用氯仿将碳分层网格浸泡在玻璃培养皿中半小时以去除 var form var 去除，然后干燥网格，得到自制的圣碳网格。接下来，将一层约 5 纳米厚的碳薄层蒸发到新切割的云母表面上。然后小心地将圣碳网格放在蒸馏水下的一张滤纸上。
在自制设备中，将云母表面的薄碳漂浮到水面上，然后慢慢沉积在圣碳网格上。拿起上面有网格的滤纸，让它晾干。在通风橱中，通过制备新鲜的 2% 小便池甲酸盐溶液开始对外泌体复合物进行负染色。
如书面程序所述，用一块铝箔盖住溶液管 为防止光线照射，溶液必须使用相同的使用。使用辉光放电装置在全碳网格上释放一个薄碳。接下来，将一块干净的香水放在工作台上，移液管将三滴 50 微升的小便池甲酸盐染色溶液滴在渗透剂上，将外泌体复合物稀释至约 50 纳摩尔的浓度，使用稀释缓冲液移液管将 4 微升稀释的蛋白质稀释，直到辉光放电网格。
让样品在网格上停留 1 分钟，然后用镊子用一张滤纸吸干残留溶液。立即在第一个污渍液滴上翻转网格，并来回移动网格数次，持续约 10 秒钟。最后一次冲洗后，对三个污渍液滴中的每一个重复此过程，让污渍在网格上再停留一分钟。
然后用一张滤纸吸干污渍。在网格表面保留一层薄薄的染色溶液，并让网格在通风橱中干燥。将样品网格放入样品架中，然后将样品架放入 FEI TE 9 12 电子显微镜中。
以低放大倍率检查样品网格，以找到最佳染色方块。一个好的正方形似乎有十几个孔，尺寸约为 1 到 2 微米，其中有深色染色区域。打开 FEI 用户界面的低剂量模式，并在低剂量模式下对齐搜索焦点和曝光位置。
将搜索设置为相机长度为 1.5 米的分数模式。将焦点设为 150 K 放大倍率，并将曝光设为 50 K 放大倍率，测得的曝光时间为 1 秒。通常，在搜索和曝光模式下，网格上的可识别特征用于执行对齐。
在搜索模式下找到染色良好的孔并保存位置。拍摄正方形的 CCD 照片。将标本倾斜 55 度并拍摄另一张照片。
比较两张图片并确定两张显微照片中的成对孔。将载物台向后倾斜至零度。使用低剂量套件以高放大倍率拍摄搜索模式中识别的每个孔的照片，散焦约为负 0.7 微米。
拍完所有孔的照片后，使用相同的放大倍率将载物台倾斜 55 度。拍摄倾斜标本的显微照片，散焦约为负 1.2 微米。使用自制圣碳网格的不规则图案，根据低倍显微照片中的图案识别相应的倾斜显微照片对。
为了帮助相关性，选择颗粒分布均匀且颗粒周围没有光晕的显微照片倾斜对。那些周围有明显污渍光晕的显微照片应该被丢弃来处理数据。从程序设置开始 在此过程中。
将使用 Eman 软件包中的 process 2D 演示图像处理。要更改图像格式，iMagic five 包进行 2D 对齐，spider 包。要执行 3D 重建和优化，请将 DM three Gatan 数字图像转换为蜘蛛图像格式。
使用 process 2D 命令，拾取粒子对。使用spider程序包中分发的web程序，程序会自动保存使用spider脚本的所有选定粒子的粒子框的坐标。该脚本将保存倾斜和未倾斜的粒子堆栈。
将 UN 倾斜粒子转换为 IMAG 5 格式。使用 EM 两个 EM 程序带通，使用 IMAG 5 中的 InCorp prep 命令过滤和遮罩 UN 倾斜的粒子，并使用 center 命令将带通遮罩的粒子居中。在 imag five 中，使用自动执行 IMAG five 程序的批处理脚本将粒子迭代对齐和分类为齐次类。
接下来，使用 IMAG 5 中的 MSA names in class 命令生成粒子的类查找表，使用 header 命令为每个粒子的对齐平移和旋转值生成一个绘图文件。在 iMagic five 中，使用 EM two EM 程序将对齐的粒子转换为蜘蛛格式。然后将类查找表更改为 spider 文档文件。
每个粒子的对齐平移和旋转值也被转换为蜘蛛文档文件带通滤波器，像 IMAG five 中未倾斜的粒子一样，对倾斜的粒子进行遮罩和居中，为中心倾斜的粒子生成一个新的数据集。从 IMAG 5 生成的多参考对齐文档和 Web 程序生成的 DCB 文件创建角度文档文件。在 spider 中使用反向投影脚本为每个类平均值获取一个初始模型。
最后，使用 spider 脚本对所有未倾斜的粒子执行初始体积的投影优化，以使用 RCT 获得最终体积。已经获得了大约 50 个外泌体的重建。体积由倾斜的粒子生成，这些粒子对应于 50 类未倾斜粒子中的每个粒子。
使用在蜘蛛包中实现的反向投影，然后执行投影匹配优化使用这些体积作为初始模型，并且显示的外泌体 3D 体积以大约 18 安克的额外分辨率生成，然后我们可以在 3D 图中躲避复合物不同部分的原子模型。观看本视频后，您应该对如何使用 RCT 进行三维重建有一个很好的了解，从生成良好的标本叙述性站立网格到点对点显微照片，最后使用图像分析技术获得重建。除了我们在这里描述的协议外，还有几种方法可以在图像分析中获得最终的重建。
获得可靠、正确的重建的最关键步骤是使用准备好的标本。
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概述
本文描述了一种使用负染色电子显微镜（EM）获取生物大分子三维（3D）重建的标准方法。重点是使用随机锥形倾斜重建方法（RCT）获得中等分辨率下的酵母外体复合物的3D结构。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物大分子
- 电子显微镜
- 结构生物学
背景
- 外体复合物对于RNA加工和降解至关重要。
- 负染色EM是一种广泛用于可视化大分子复合物的技术。
- 随机锥形倾斜重建允许从2D图像生成3D结构。
- 标本的制备对于成功成像至关重要。
研究目的
- 展示外体复合物3D重建的方法。
- 为电子显微镜技术的新手提供协议。
- 突出标本制备和图像处理中的挑战。
使用的方法
- 在碳网上沉积一层薄薄的碳膜。
- 将标本和染色剂应用到网格上，以将标本嵌入重金属盐中。
- 进行电子显微镜观察以捕捉倾斜对的显微图像。
- 使用随机锥形倾斜方法分析图像以重建3D结构。
主要结果
- 成功获取外体复合物的倾斜对。
- 在中等分辨率下重建了外体复合物的3D结构。
- 确定了标本制备中的挑战。
- 讨论了用于有效分析的图像处理技术。
结论
- 随机锥形倾斜方法对于大分子复合物的3D重建是有效的。
- 正确的标本制备对于获得高质量结果至关重要。
- 该协议可以帮助研究人员可视化生物学中的复杂结构。
常见问题
Executive Industry Relevance
Single particle electron microscopy (EM) reconstruction using the random conical tilt (RCT) method enables structural elucidation of large macromolecular complexes without the need for crystallization, addressing a key bottleneck in early discovery. This approach supports predictive confidence in target validation by providing 3D structural data from minimal sample quantities. Its integration into discovery pipelines enhances mechanistic understanding and informs risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of macromolecular complexes to clarify structural hypotheses.
- Supports functional target validation by revealing 3D architecture at medium resolution.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing structural context for complex assemblies.
- Improves predictive confidence for downstream biological interrogation.
Screening & Assay Development
- Prepares validated structural models for use in structure-guided screening campaigns.
- Standardizes specimen preparation and imaging workflows for reproducibility.
- Generates quantitative 3D outputs to benchmark assay performance.
- Enables reliable evaluation of molecular interactions in screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural data with disease-relevant complexes for translational continuity.
- Supports preclinical model development by informing on complex assembly and function.
- Provides mechanistic insights that guide risk-adjusted advancement decisions.
- Enhances predictive de-risking for candidate selection.
Pipeline & Workflow Integration
The RCT-based EM reconstruction method fits at the interface of early discovery and lead identification, providing foundational structural data for hypothesis testing and target validation.
- Discovery Biology: Delivers 3D reconstructions that clarify macromolecular organization and support hypothesis-driven research.
- Screening: Supplies reproducible structural templates for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Produces quantitative volumetric data and class averages for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages by aligning structural findings with functional models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for structural interrogation of diverse complexes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes specimen preparation and image processing for scalable implementation.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EM specimen preparation and image analysis workflows.
- Demands access to transmission electron microscopy and computational infrastructure for 3D reconstruction.
- Necessitates cross-team standardization of grid preparation and data processing protocols.
- Adaptation may be needed for complexes of varying size or symmetry.
- Resolution is limited for asymmetric or small complexes, as supported by the method's constraints.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:11
Principle of the Random Conical Tilt Method
2:10
Preparation of Holey Carbon Grids Covered with Thin Carbon
5:08
Negative Staining of the Exosome Complex
6:23
Electron Microscopy of the Exosome Complex
8:10
Image Processing of the Data
10:55
Representative Results for Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method
11:29
Conclusion
