单粒子电子显微镜外切体综合重建，使用随机的锥形倾斜方法

以下实验的总体目标是利用随机锥形倾斜法获得外泌体复合物的三维结构。首先，在载有微孔碳膜的载网上沉积一层薄碳膜，以形成蛋白质复合物及染色剂的支撑基质；第二步是将样品和染色剂施加到载网上，从而使样品包埋于重金属盐中。

随后进行电子显微镜观察，以获取样品显微照片的倾斜对。最终，通过使用随机锥形倾斜法进行图像分析，得到显示外泌体复合物三维结构的结果。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为随机锥形倾斜法的样品制备有时较为困难，且后续的图像处理流程也具有挑战性。

该方法的演示至关重要，因为如果不通过图示展示样品评估过程，分级和样品制备步骤将难以掌握。随机锥形倾斜法的原理要求在电子显微镜内对同一区域的样品拍摄一对显微照片：一张是在样品未倾斜状态下拍摄，另一张则是在样品倾斜50至70度角度下拍摄。通过计算机将数字化的显微照片成对并列放置，并在此图示中选取来自相同颗粒的图像。

这些图像以三维坐标中的数字标记。未倾斜颗粒的图像与其对应的倾斜颗粒图像通过倾斜轴的方向和倾斜角度相互关联。通过对未倾斜颗粒图像进行对齐，利用填充了方位空间的多个倾斜颗粒图像，可将倾斜颗粒的图像带至其相应的位置，从而使用反投影算法重构分子的三维结构。首先制备网格，通过向一个100毫升的玻璃烧杯中加入0.45克聚乙烯醇缩甲醛树脂和90毫升氯仿，配制0.5%的Formvar溶液。

在通风橱中，用铝箔覆盖烧杯并溶解电木酚醛树脂。使用小型搅拌子和磁力搅拌器，树脂大约需要15分钟溶解。同时，用甲醇和无尘纸清洁预先清洗过的显微镜玻璃片。

待虫胶树脂完全溶解于氯仿后，在溶液表面加入1毫升50%甘油。通过调节所加甘油的体积，可影响载碳膜上孔洞的密度。

将超声波探头尖端浸入溶液中，深度约为一英寸，以最大功率超声处理一分钟，使甘油形成液滴并乳化于溶液中。延长超声时间将导致多孔碳中的孔径变小。

此步骤后，溶液会变得浑浊。超声处理后立即将洁净的玻璃片垂直浸入乳液中，一秒钟后取出，并用滤纸擦拭玻片底部，以在玻片表面形成一层薄的塑料膜。

氯仿挥发后，在光学显微镜下检查薄膜上孔洞的密度和大小。此处描述的制备条件应在400目网格的每个方格内产生10至20个孔洞，孔径介于3至4微米之间。待玻璃载片干燥后，沿载片表面切割塑料薄膜的边缘。

将载玻片垂直浸入水中，使薄膜漂浮在蒸馏水表面。在斜射光下以掠射角度观察水面上的薄膜。将400目铜网逐个放置在薄膜上，铜网光滑面朝下。

用一张纸拾取带有网格的塑料膜。将纸翻转并使其干燥。在培养皿中，将纸浸泡于甲醇中以去除孔中残留的甘油，然后让纸自然晾干。

使用碳蒸发仪在载网上镀一层碳膜，厚度约为 20 纳米。通过控制蒸发时间来调节所需厚度。可通过与已知厚度碳层的灰色进行比较，根据碳膜的灰度判断其厚度。

将碳支持膜铜网浸入玻璃培养皿中的氯仿内半小时，以去除火棉胶膜，随后将铜网干燥，即可制备出自制穿孔碳膜铜网。接着，在新解理的云母表面蒸发一层约五纳米厚的碳薄膜。然后，将穿孔碳膜铜网小心地置于滤纸上，并置于蒸馏水下方。

在自制装置中，将云母表面的薄碳层漂浮到水面上，并缓慢沉积到载网的碳膜上。用滤纸捞取载有载网的样品，使其自然干燥。在通风橱中，通过配制新鲜的2%醋酸铀酰溶液，开始对外泌体复合物进行负染色。

如书面步骤所述，用一片铝箔覆盖溶液管，以避免光照，该溶液必须在同一天使用。使用辉光放电仪对全碳支持膜网格进行辉光放电处理，使其表面覆盖一层薄碳。接下来，将一块洁净的滤纸置于实验台面上，用移液器在滤纸表面滴加三滴50微升的醋酸铀染色液。使用稀释缓冲液将外泌体复合物稀释至浓度约为50纳摩尔，然后用移液器取4微升稀释后的蛋白样品，滴加到经辉光放电处理的网格上。

将样品在载网上静置一分钟，然后用镊子夹取滤纸吸去残留溶液。立即将载网翻转至第一滴染液上，前后移动约10秒钟，冲洗载网。每次冲洗后，对后续三个染液滴重复此过程；最后一次冲洗后，让染液在载网上再保留一分钟。

然后用一张滤纸吸去染色液。保持网格表面有一层薄薄的染色液，并将网格置于通风橱中自然干燥。将样品网格放入样品 holder 中，然后将 holder 置于 FEI TE nine 12 电子显微镜中。

在低倍率下检查样品网格，以找到染色效果最佳的方格。理想的方格应显示约十几个孔洞，孔洞尺寸约为一至两微米，并含有深色染色区域。打开 FEI 用户界面的低剂量模式，并在低剂量模式下校准搜索焦面和曝光位置。

将搜索设为1.5米相机长度的分束模式。将焦距设为150 K放大倍数，并将曝光设为50 K放大倍数，曝光时间测量为1秒。通常，在搜索和曝光模式下均使用网格上可识别的特征来进行对准。

在搜索模式下找到染色良好的孔位并保存其位置。拍摄该方格的CCD图像。将样品倾斜至55度，再拍摄另一张图像。

比较两张图片，确定两张显微照片中配对的孔洞。将样品台倾斜角度恢复至零度。使用低剂量套件，在高倍率下以约负0.7微米的欠焦量，对搜索模式中识别出的每个孔洞拍摄图像。

拍摄完所有孔洞的图像后，使用相同的放大倍数将载物台倾斜至55度。对倾斜的样品进行显微照相，离焦量约为负1.2微米。根据低倍率显微照片中的图像特征，利用自制的多孔碳膜网格的不规则图案，识别出对应的倾斜成对显微照片。

为了帮助相关性分析，应选择具有均匀分布颗粒且颗粒周围无晕圈的显微照片倾转对。那些颗粒周围有明显染色晕圈的显微照片应予以剔除，不用于数据处理。从实验流程中的程序设置开始。

将使用 Eman 软件包中的 process 2D 进行图像处理。为更改图像格式，需使用 iMagic 五软件包进行 2D 对齐，并使用 spider 软件包。为执行 3D 重构与优化，需将 Gatan 数字图像 DM3 格式转换为 spider 图像格式。

使用 2D 处理命令选取粒子对。利用 spider 程序包中分发的网页程序，该程序会通过 spider 脚本自动保存所选粒子的坐标，并将所有选定粒子框出。该脚本会保存倾斜与未倾斜的粒子堆栈。

将未倾斜的颗粒（UN tilted particles）转换为IMAG五格式。在IMAG五中，使用EM二EM程序的带通滤波器，并通过InCorp prep命令对未倾斜的颗粒进行滤波和掩模处理，然后使用center命令对带通掩模后的颗粒进行居中。在IMAG五中，通过批处理脚本自动执行IMAG五程序，迭代地对颗粒进行对齐和分类，以获得均一的类别。

接下来，在 IMAGIC-5 中使用 class 命令中的 MSA 名称生成颗粒的类别查找表，并使用 header 命令生成每个颗粒在对齐过程中的平移和旋转值的绘图文件。在 IMAGIC-5 中，使用 EM2EM 程序将对齐后的颗粒转换为 SPIDER 格式。然后将类别的查找表转换为 SPIDER 文档文件。

每个颗粒的对齐平移和旋转值也会被转换为SPIDER文档文件，对倾斜颗粒进行带通滤波、掩膜和居中处理，方法与IMAG5中对未倾斜颗粒的处理相同，并生成用于居中倾斜颗粒的新数据集。利用IMAG5生成的多参考对齐文档以及由网络程序生成的DCB文件，创建角度文档文件。在SPIDER中使用反投影脚本，为每个类别平均值生成一个初始模型。

最后，使用 SPIDER 脚本对所有未倾斜的颗粒进行初始体积的投影优化，通过 RCT 获得最终体积。已获得约 50 个外泌体的重构结果。这些体积数据由对应于 50 个未倾斜颗粒类别中每个颗粒的倾斜颗粒生成。

利用 spider 软件包中实现的反投影方法，以这些体积结构作为初始模型进行投影匹配优化，最终生成了分辨率约为 18 Å 的外泌体三维结构。在获得该分辨率的三维图谱后，可将复合物不同部分的原子模型拟合到该三维图谱中。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用随机圆锥倾斜技术（RCT）进行三维重构，包括从制备高质量的样品网格，到获取成对的显微图像，直至通过图像分析技术获得三维重构结果。除本视频所述的实验方案外，图像分析中还有多种方法可用于获得最终的三维重构结构。

获得可靠且准确重建的最关键步骤是使用制备良好的样本进行操作。