Name: 结扎冠状动脉内注射在小鼠模型梗死 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 学习小鼠心脏冠状动脉结扎与心肌内注射的显微外科技术，用于研究缺血再灌注损伤。该方法通过组织学和功能指标评估心脏损伤程度，为心血管疾病治疗研究提供重要实验基础。

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我谨向研究与研究生教育部门致以谢意，感谢他们为支持我的研究提供资金，同时感谢比较医学部门的监督与协助。我还要感谢生理学部门给予的支持与指导，以及我实验室的学生和技术人员提供的帮助。最后，我要感谢我的博士后导师Charles E. Murry博士，感谢他提供的培训机会，使我得以学习小鼠显微外科技术。

<ol>
	<li>将无菌外科器械（表1）和3英寸棉签置于无菌垫巾上。打开 bead 消毒器（Germinator 500）。</li>
	<li>对小鼠（年龄：>6周；体重：>18g）进行腹腔注射三溴乙醇（250mg/kg，剂量为20μl/g体重，作用时间约40分钟）以实施麻醉。</li>
	<li>当小鼠对脚趾夹捏无反应时，向其眼部涂抹无菌润滑剂（Tears Renewed）以防止角膜干燥，并在胸部左侧皮肤涂抹脱毛剂（如Nair）以去除毛发。</li>
	<li>用温水冲洗掉脱毛剂，并使用碘伏/酒精棉片对术区进行消毒。</li>
	<li>将小鼠置于固定在亚克力手术台上的温控恒温垫（Deltaphase isothermal pad）上。用胶带固定四肢，并将一根粗线水平置于上门齿下方，以固定上颌位置。</li>
	<li>将手术台垂直放置，并使用光纤光源直接照射颈部区域以实现经食管透照。需精确调整光源位置，使咽喉开口呈现为明亮的孔道，从而便于观察气管，以利于插入PE导管。</li>
	<li>将导管连接至呼吸机（通入95% O2/5% CO2），以提供持续正压通气（TOPO呼吸机；呼吸频率125次/分钟；峰值吸气压10–12 cmH2O；*注：参数设置因品系和性别而异1–3）。确认胸部同步起伏表明通气成功后，用胶带将连接处固定于垫巾上，以防术中导管脱落。</li>
	<li>使用有齿镊提起胸部皮肤，用安装在#3刀柄上的#10无菌手术刀片沿胸骨平行方向做1.5cm切口。</li>
	<li>使用弯头Vanna显微剪剪开胸大肌，并在肋间肌上剪出一个小孔。</li>
	<li>使用直头钝头显微剪剪断3根肋骨。</li>
	<li>使用9mm小儿眼科开睑器撑开肋骨。</li>
	<li>用弯头镊将心包从心脏表面轻轻提起，再用有齿镊小心撕开心包膜。</li>
	<li>使用Castroviejo持针器，将6mm锥形尖端3/8弧度针穿入8-0聚乙烯缝线，于左前降支冠状动脉下方（沿心脏长轴方向）与其垂直穿线。
		<ol>
			<li>若需建立可解除的临时结扎以实现定时再灌注，可在心脏上平行于冠状动脉放置一段无菌PE90管（长0.5–1cm）。先将缝线从冠状动脉下方穿过并打结固定于导管上。需要解除结扎时，松开结扎线即可。此操作可根据需要重复进行，并可调整缺血/再闭塞的时间4。根据实验持续时间和所用麻醉剂类型，可能需要追加麻醉。</li>
			<li>若需永久性闭塞，则直接将穿过冠状动脉下方的缝线打结固定。此时可见心肌变白及运动异常，随后剪除缝线的长端5–10。</li>
			<li>若需进行心肌内注射，使用带有30号无菌斜面针头的无菌Hamilton注射器，从结扎线右侧损伤区域上方的心脏基底部进针。将针头推进至损伤区域后稍回撤，使针尖斜面位于梗死边缘带附近。先注入部分注射液（2–3μl），保持针头不动；再将针头后退1–3mm，注入剩余液体。保持针头位置直至注射形成的隆起消散，然后拔出针头。若出现出血，用棉签轻轻按压穿刺点直至止血5–7。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>完成心肌操作后，取出肋骨牵开器，使用6-0 Surgipro缝线以2–3针褥式缝合法关闭胸腔。</li>
	<li>再以2–3针褥式缝合关闭胸大肌，在肌肉上滴加0.25%布比卡因与无菌生理盐水1:10稀释液1–3滴（0.1ml/25g小鼠），然后以2–3针褥式缝合关闭皮肤。</li>
	<li>将小鼠脱离呼吸机。确认出现节律性、快速而浅表的呼吸后，可拔除气管插管。</li>
	<li>向背部皮下注射0.5ml温热无菌生理盐水，并将小鼠置于笼内加热垫上，直至其恢复活动能力（至少1小时）。</li>
	<li>对于存活实验，将小鼠放回笼中并送回动物房直至预定处死时间。术后前两天，将湿润食物置于笼底以便取食（避免抬身取食引起疼痛），并每6–12小时给予一次布托啡诺。术后护理还包括术后第一周每日监测，以确认其活动能力、理毛行为和进食情况正常。</li>
	<li>手术器械用乙醇擦拭干净后，插入 bead 消毒器中，为下一次手术做准备。</li>
	<li>处死时，使用戊巴比妥钠（65mg/ml，55–65 mg/kg）对小鼠实施麻醉。待达到适当麻醉深度后，打开胸腔。</li>
	<li>在心脏仍在跳动时，使用装有23号针头的注射器，内含冷钾氯化物溶液（KCl，30mM）或2,3-丁二酮单肟（BDM；10mM），穿刺心室后基底部，缓慢将溶液注入心腔，直至心脏停搏于舒张期。</li>
	<li>取出心脏后，使用含PBS的注射器逆行灌注冲洗心脏，以清除残留血液。对于急性实验，在再灌注结束时，于原闭塞部位重新结扎LAD，并经主动脉注射含1%伊文思蓝的溶液。取出心脏后，将其横向切成三个等厚切片，浸入1% 2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（TTC）中孵育，随后进行形态计量学成像分析11。对于慢性实验，心脏则浸入固定液中，按常规流程处理、包埋。切片可进行组织学染色，并使用Scion、NIH Image J或Image Pro Plus软件进行形态计量学成像分析9,10,12。</li>
</ol>
代表性结果：
若操作得当，小鼠（雄性：8–10周龄，22–28 g；雌性：10–12周龄，20–26 g）的存活率如下：急性缺血/再灌注和缺血预处理实验中超过90%，永久性动脉结扎研究中超过85%，心肌内注射实验中约为80%。由于早期损伤更多表现为代谢改变而非结构变化，因此在缺血/再灌注和缺血预处理实验中，通过向主动脉灌注1%伊文思蓝染料来确定梗死面积，该染料可灌注非左前降支（LAD）供血的心肌区域（图1A）。心脏取出并沿横向平分后，将组织置于1% 2,3,5-三苯基四氮唑氯化物溶液中孵育，以测定梗死面积（图1B）。使用Scion或NIH图像分析软件测量各区域面积，可通过在相同放大倍数下拍摄的显微测微尺图像进行校准。这些数据用于计算风险区/左心室面积以及梗死面积/风险区面积比值11。不同品系小鼠可能存在体重和心脏大小的差异，因此在比较时应注意将这些指标归一化至心脏重量、体重或胫骨长度。
永久性动脉结扎会导致明显的结构改变，例如坏死、管壁变薄和心腔扩张。在永久性闭塞模型中（图2A），可通过Scion或NIH成像软件测量不同处理方法和/或时间对梗死面积及坏死程度的影响，具体参数包括相对于左心室的梗死范围、心腔面积、室间隔壁以及左心室游离壁厚度。采用苦味品红-亮绿（picrosirius red/fast green）胶原染色（图2B）可评估间质性纤维化，该指标与心壁僵硬度的功能指数密切相关8-10。图3显示了在永久性动脉结扎后，将6 µl溶液（伊文思蓝）注射至心脏边缘区后的分布情况。可见染料沿损伤方向扩散，同时向心肌基底部以及跨壁方向延伸。
<img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig1.jpg" alt="手术切除过程；A）肿瘤位置；B）切除后组织样本；医疗操作" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. A. 切除前向主动脉注射伊文思蓝。 该图像显示心脏灌注区域（被染色）和梗阻区域（未染色）。B. 急性缺血/再灌注损伤后伊文思蓝和TTC染色结果。这是一张代表性图像（20倍放大），显示蓝色染料分布情况，未梗阻区域被染成蓝色，代谢活性组织经TTC染色呈红色。坏死区域不着色，因此呈现苍白（已标出）。
<img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig2.jpg" alt="组织学横切面、心脏组织、染色切片，显示心室结构，比较分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. A. 苏木精-伊红染色。 这是一张代表性图像（20×），显示小鼠心肌梗死（MI）后第4天梗死区域横切面的H&amp;E染色结果（20×）。* 表示组织坏死，箭头指向肉芽组织，RV = 右心室，LV = 左心室。B. 天狼星红-快绿染色。 这是一张代表性图像（20×），显示小鼠心肌梗死（MI）后第4周心脏横切面的天狼星红/快绿染色结果。细胞质呈绿色，胶原纤维呈红色。
<img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig3.jpg" alt="心脏结扎实验结果；前壁、侧壁、心尖及横切面视图；缺血分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 经心肌内注射 6 µL 伊文思蓝染料后的染色分布情况。该图为冠状动脉结扎后立即在梗死边缘区进行 6 µL 心肌内注射伊文思蓝染料后，染料在整个心脏中全局性及透壁性分布的代表性图像（12×）。

本动物实验方案已获东卡罗来纳大学机构动物护理和使用委员会批准，并符合该委员会制定的指南和规定。

冠心病仍然是一个在流行病学和财政上具有重要意义的公共卫生问题。要将潜在治疗方法推进到临床应用，仍需进行大量的基础研究，以理解损伤和重塑过程的机制，以及这些治疗方法如何调节上述过程。啮齿类动物是最常用的模型，而目前可获得的大量基因修饰小鼠使该物种成为更具吸引力的模型。
尽管小鼠与其他物种之间存在差异，但使用小鼠模型仍具有诸多优势。借助简单的解剖显微镜或放大镜，并在光线充足的条件下，可清晰观察到血管结构（有关血管的大体解剖学详细信息，请参见 Salto-Tellez et al., 200413）。为降低术后死亡风险，避免切断大血管至关重要，因为一只25g小鼠的总血容量不足2ml14。若发生大量出血，可通过轻柔加压或精准电灼止血。
该方案也可通过多种方式进行修改。例如，可使用异氟烷、氯胺酮/赛拉嗪或戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉，具体选择应根据实验方案的持续时间而定15-18趾夹反射是评估麻醉深度最常用的指标。此外，为了提高长期存活率，一些研究者使用抗心律失常药物（如利多卡因）来降低致死性心律失常的发生率。19,20 然而，必须考虑到，最近已有研究表明，在急性模型中，此物质具有抗凋亡特性21此外，为减轻术后疼痛，可在手术后前48小时内给予布托啡诺等镇痛药。3,16,17,22,23为维持手术期间（尤其是较长时间的实验方案）的体温，通常使用直肠探头与加热垫串联，以替代等温垫。对于缺血/再灌注及/或缺血预处理或后处理：可调整阻断和再灌注的持续时间；对于永久性阻断，可通过改变结扎位置来调节梗死面积；对于心肌内注射（如细胞、蛋白），可进行1–3个注射位点，每次注射体积最多可达15 μl。24如果进行细胞注射，应使用针头的规格（通常为26-30号）5,25,26 应根据细胞大小进行选择，以确保针头内径足够大，避免剪切效应。为避免手术引发的炎症反应造成干扰，一些研究者已报道使用可操控的套索 离体 在术后任意时间点对闭胸小鼠心脏进行阻断和再灌注27-29。最近，Gao 等30 已表明，临时性和永久性阻断可在无需通气的情况下进行，一些实验室已开始使用超声进行闭胸心肌内注射25,31.
自1954年Johns和Olson首次发表证明在小鼠中结扎冠状动脉可行性的研究以来32许多其他研究者已采用此模型，并对其加以改进，以研究心肌损伤和重塑的各个方面3,33-45小鼠因其体型小、繁殖能力强以及购买和维护成本相对较低，在多种生理学和病理生理学研究中成为一种极具吸引力的实验工具。随着成像技术的微型化发展 体内 进展46-49，以及用于开展和分析大规模基因组学和蛋白质组学、药物筛选、基于细胞和/或蛋白质疗法的疗效，以及生物材料的方法50-64结合普遍性或组织特异性转基因小鼠及基因突变/基因敲除小鼠日益广泛的遗传操作手段，心肌梗死的小鼠模型无疑将继续成为评估急性心脏损伤及长期心室重构的重要工具。因此，能够可靠且可重复地开展这些实验具有无可置疑的价值。

<table><tbody><tr><td>长弯剪</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-159</td><td></td></tr><tr><td>显微解剖剪</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-161</td><td></td></tr><tr><td>镊子 &amp;#8211; 直型，1×2 齿</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-205</td><td></td></tr><tr><td>3 号手术刀柄</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-64</td><td>#10 无菌刀片</td></tr><tr><td>镊子 &amp;#8211; 半弧形带齿</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-19</td><td></td></tr><tr><td>组织剪</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-410</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo 持针钳</td><td>Miltex Inc.</td><td>18-1828</td><td></td></tr><tr><td>Cook 眼睑撑开器</td><td>Miltex Inc.</td><td>18-63</td><td></td></tr><tr><td>Surgipro II 8-0</td><td>Suture Express</td><td>VP-900-X</td><td></td></tr><tr><td>Prolene 6-0</td><td>Suture Express</td><td>8776</td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500 珠式灭菌器</td><td>Cellpoint Scientific</td><td>65369-1</td><td></td></tr><tr><td>Deltaphase 恒温垫</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 微量注射器 - 25&amp;mu;l</td><td>Hamilton Co</td><td>80430</td><td></td></tr><tr><td>30 号斜面针头</td><td>Hamilton Co</td><td>7803-07</td><td></td></tr><tr><td>呼吸机</td><td>Kent Scientific</td><td>TOPO</td><td></td></tr></tbody></table>

冠状动脉结扎与心肌内注射在小鼠心肌梗死模型中的应用

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

小鼠模型是研究心肌急性损伤和慢性重塑的宝贵工具。in vivo 条件下，随着对整体生物体或心肌进行的遗传修饰，以及多种生物和/或合成材料的出现，这些技术的任意组合有望减轻急性缺血性损伤的程度，并延缓因心肌重塑引发的心力衰竭进程。
本文介绍了可靠实施该显微手术所使用的方法与材料，以及用于暂时性（伴再灌注）或永久性冠状动脉闭塞研究和心肌内注射的相应改进。术中及实验结束时可观察到的心脏变化，结合组织学评估，将验证该方法的有效性。
简而言之，手术准备包括对小鼠进行麻醉，去除胸部毛发，然后对手术区域进行消毒。通过光纤光源经食管透照实现气管内插管。随后将导管连接至呼吸机。在胸部做一切口以暴露胸肌，并切开胸肌以观察肋骨。在缺血/再灌注研究中，将一段1 cm长的PE导管置于心脏上方，用于固定结扎线，从而可自定义阻塞与再灌注过程。对于心肌内注射，使用带有无菌30号斜面针头的汉密尔顿注射器。完成心肌操作后，依次关闭肋骨、胸肌和皮肤。在缝合皮肤前，向肌肉层施用0.25%布比卡因无菌生理盐水溶液，以实现局部阻滞镇痛。术后给予小鼠皮下生理盐水注射，并将其置于保温舱内，直至恢复胸卧位。随后将小鼠送回动物房，在标准条件下饲养，直至组织取材时间点。在处死时，对小鼠进行麻醉，用KCl或BDM使心脏停搏于舒张期，以生理盐水冲洗后浸入固定液中。之后按常规步骤进行组织处理、包埋、切片及组织学染色。
小鼠的非手术插管及所述显微外科操作使得该模型在学习和实现可重复性方面具有较高的技术难度。这些操作，加上在进行定时结扎阻断和再灌注或心肌内注射时难以保持操作的一致性，均可能影响动物存活率，因此优化操作流程并保持一致性至关重要。

在小鼠急性缺血/再灌注损伤和慢性重塑的研究中，涉及多种基因操作和/或心肌内注射基因、蛋白质、细胞和/或生物材料，这些操作随时间维度叠加进行。本视频展示了缺血/再灌注、永久性冠状动脉结扎以及心肌内注射研究的显微外科操作步骤。

小鼠模型是体内研究心肌急性损伤与慢性重塑的有力工具。随着基因修饰技术的发展……

以下实验的总体目标是演示在小鼠心脏上进行临时或永久性冠状动脉结扎以及心肌内注射的显微外科方法。首先准备并消毒手术区域，随后使用PE 90导管对小鼠进行气管插管，以便在开胸术期间提供正压通气。分离后，冠状动脉可进行暂时性或永久性阻断。此外，还可向心脏注射某种物质。通过组织学和形态计量学终点、组织及血清蛋白标志物以及功能指标，可获得反映心脏受损程度的结果。我的名字是TKA Rag，来自东卡罗来纳大学布罗迪医学院生理学系。本视频的目的是演示在小鼠心脏上进行临时性和永久性冠状动脉结扎，以及心肌内注射所用的显微外科手术操作。开始时，将无菌外科器械和三英寸棉签置于无菌垫布上。接下来打开珠式灭菌器，以便在每次手术之间对器械进行灭菌。为动物手术做准备时，将无菌润滑剂涂抹于麻醉小鼠的眼睛上。随后，使用脱毛剂（如nare）去除小鼠胸部左侧的毛发。彻底擦除脱毛膏，以避免化学灼伤或皮炎。将小鼠置于固定在亚克力板桌面上的Δ相等温垫上。用胶带固定每个肢体，并在上门齿下方放置粗线以固定上颌位置。用聚维酮碘擦拭手术部位，然后用酒精重复擦拭，共进行三次。使用光纤光源照亮颈部区域，以便在插入PE导管时观察气管。光照清晰后，小心地将导管经口腔插入。将管路连接至呼吸机以实施正压通气。一旦观察到胸壁运动与通气同步，即可用胶带将连接处固定在垫片上以保持稳定。手术过程中，使用有齿镊将皮肤从胸壁提起并拉开，沿胸骨平行方向做一条1.5厘米的皮肤切口。接下来，使用弯头Vana显微剪刀剪开胸肌，并在肋间肌上剪出一个小孔。牵开肌肉后，使用直头钝头显微剪刀剪断三根肋骨。使用牵开器将肋骨撑开。使用TRO Viejo持针器和带锥形针尖的缝合线，轻轻打开心包囊以暴露心脏，并在左前降支冠状动脉下方穿过一根聚乙烯缝线，用于临时结扎，该结扎可在设定时间后解除以实现定时再灌注。剪取一段0.5至1厘米长的PE 90管，将其放置于心脏表面，与冠状动脉平行，将穿过冠状动脉下方的缝线与这段管子一起结扎。在设定时间结束后，松开结扎线以允许再灌注；如需进行永久性闭塞，则不解除结扎。将穿过冠状动脉下方的结扎线打结，应观察到局部变白和运动异常。剪除缝线的长端以进行心肌内注射，将一根30号无菌针头插入结扎线右侧损伤区域上方的心脏基底部。将针头推进至损伤区域，然后稍加回撤，使针尖斜面大致位于边界区域。注入少量溶液，并保持针头位置不动。将注射器回撤一至三毫米，然后注入剩余溶液。将注射器保持在原位，直到溶液产生的血液消散。消散后，拔出针头。如果出现出血，用棉签轻轻按压穿刺部位，直至出血停止。心肌操作完成后，取出肋骨牵开器，用两到三针褥式缝线关闭胸腔。接着，用两到三针褥式缝线缝合胸大肌。在肌肉上滴加一至三滴0.25%的标记物无菌生理盐水溶液，然后使用额外的两到三针褥式缝线缝合皮肤。将小鼠从呼吸机上移开，并确保其呼吸节律正常，表现为快速而浅表的呼吸。向背部皮下空间注射 0.5 毫升温热的无菌生理盐水，并将小鼠置于含有加热垫的笼子中，直至其恢复活动能力。对于需存活的实验，小鼠被放回其原居住笼中，并送回动物房饲养，直至达到处死时间点。用乙醇擦拭手术器械使其清洁，并将其插入玻璃珠灭菌器中，以准备下一次手术。为收集用于分析的样本，需分离心脏，并用含有冷氯化钾或二三丁二酮单氧化物溶液的针头穿刺心室的后基底区域。缓慢将溶液注入心室腔内，直至心脏停搏于舒张期。取出心脏，并用磷酸盐缓冲液（PBS）灌注以清除残留血液。灌流完成后，将心脏浸入固定液中，随后按照常规步骤进行处理和包埋。通过染色可观察到临时结扎引起的心肌急性损伤。在本图中，蓝色染料分布于心脏的阻塞区域，而TTC染色则标记了具有代谢活性的存活心肌组织。红色区域为坏死区，不着色因而颜色较浅。可使用成像软件计算风险区面积占左心室面积的比例，以及梗死面积占风险区面积的比例。在此示例中，心肌梗死后第四天，将受损心脏在梗死区域进行横向切取，并用苏木精、血红素和伊红染色。星号表示组织坏死，而箭头指向用苦味酸染色的肉芽组织胶原。苦味酸品红-快绿染色可用于评估间质纤维化，其与心壁僵硬的功能指标相关。此图为小鼠心肌梗死后四周的心脏组织，其中细胞质呈绿色，胶原纤维呈红色。此系列图像显示了在永久性冠状动脉结扎后，将六微升伊文思蓝染料溶液注射到心脏边缘区域的分布情况。请注意，染料不仅向损伤方向扩散，同时也朝向心脏基底部以及跨壁方向扩散。对冠状动脉进行可视化并实现可靠的阻断非常具有挑战性，需要大量练习才能熟练掌握。在操作过程中，必须注意避免刺穿肺部，同时在手术操作中防止动物脱管。I.

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结扎冠状动脉内注射在小鼠模型梗死

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建立小鼠心肌梗死模型：小鼠左前降支冠状动脉永久性结扎手术操作流程

关键词：心肌梗死，小鼠模型，左前降支冠状动脉，永久性结扎，开胸手术，心肌缺血，动物模型，心血管疾病

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通过左前降支动脉结扎建立心肌缺血-再灌注损伤的小鼠模型

本文描述了一种在小鼠中建立心肌梗死的高可重复性模型，该模型仅需最少的侵入性操作。该模型易于实施，具有高重复性和高存活率。因此，该模型将减少实验所需的动物数量，符合3R原则（替代、优化和减少）的要求。...

小鼠心肌梗死诱导的微创手术操作

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小鼠左前降支冠状动脉结扎：一种改进且简化的心肌梗死模型

本文介绍了一种外科手术方法，用于实现小鼠左前降支冠状动脉的永久性结扎。该模型对于研究心肌梗死的病理生理学及其伴随的生物学过程具有重要意义。...

采用左前降支冠状动脉永久性结扎的小鼠心肌梗死模型

本文介绍了一种在小鼠中永久性结扎左冠状动脉的外科手术方法。该模型可用于研究心肌梗死后的心脏病理生理学变化及相关炎症反应。...

左冠状动脉结扎：一种小鼠心肌梗死的外科模型

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心肌内细胞递送：小鼠心脏中的观察

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冠状动脉结扎与心肌内注射在小鼠心肌梗死模型中的应用

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