Name: 聚焦离子束铣削和脑组织的扫描电子显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学习使用聚焦离子束扫描电子显微镜对树脂包埋脑组织进行连续切片成像的技术。该方法可实现高分辨率三维成像，帮助研究人员深入分析特定脑区的超微结构。

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1. 样品固定与树脂包埋
<ol>
<li>将新鲜组织和细胞样品在 pH 7.4 的 0.1 M 磷酸盐缓冲液中，用 2% 多聚甲醛和 2.5% 戊二醛固定至少 2 小时。样品厚度不得超过 0.150 mm，以确保固定剂充分渗透，且固定时间不应超过 12 小时。</li>
<li>将样品放入 20 ml 玻璃闪烁瓶中，用 0.1 M 卡可基酸盐缓冲液清洗三次，每次 5 分钟。</li>
<li>用含 1.5% (w/v) 亚铁氰化钾和 1% (w/v) 四氧化锇的 0.1 M 卡可基酸盐缓冲液（0.1 M，pH 7.4）染色 30 分钟。</li>
<li>用 0.1 M 卡可基酸盐缓冲液中的 1.0% (w/v) 四氧化锇染色 30 分钟。</li>
<li>用双蒸水冲洗一次，持续 3 分钟。</li>
<li>用双蒸水配制的 1% (w/v) 醋酸铀染色 30 分钟。</li>
<li>用双蒸水冲洗切片 5 分钟，然后依次通过梯度乙醇系列脱水，每次更换溶液后处理 2 分钟（50%、70%、90%、95% 各一次，100% 两次）。</li>
<li>将样品浸入杜氏树脂（Durcupan）与乙醇混合液中，树脂浓度逐步增加，每次更换后孵育 30 分钟，依次为：50%、70%、90%、95%，最后为 100% 杜氏树脂。</li>
<li>更换新鲜杜氏树脂，缓慢振荡 4 小时。</li>
<li>使用木制牙签将切片转移至涂有模具分离剂的玻璃载玻片上，置于 65°C 烤箱中 24 小时。</li>
</ol>
2. 为聚焦离子束/扫描电子显微镜制备样品
<ol start="11">
<li>将含有样品的树脂层从两片玻璃载玻片之间分离，并彻底清洗以去除任何模具分离剂。</li>
<li>使用配备低倍物镜的透射光显微镜，或具有透射照明的解剖显微镜，确定树脂切片中感兴趣的区域。</li> 
<li>使用剃刀刀片在感兴趣区域周围切割一个较小的方形（3 mm × 3 mm），并用丙烯酸胶将其粘附至空白树脂块的顶部（图1）。等待5分钟使胶水固化，然后进行下一步操作。</li>
<li>将树脂块夹入超薄切片机的样品 holder 中，并利用附带的体视显微镜，用剃刀刀片修切感兴趣区域周围，直至仅剩下一个微小的金字塔形材料。</li>
<li>进一步使用固定在超薄切片机上的玻璃刀修切树脂块，使感兴趣区域能够相对于块体表面的尺寸被精确定位（图1）。在靠近感兴趣区域的一侧切割树脂块边缘，使切口垂直穿过样品（图1和图2）。该切面即为成像面（图2）。</li> 
<li>将树脂块从超薄切片机中取出，并使用透射光显微镜拍摄块体内感兴趣区域的照片。</li>
<li>使用珠宝锯将修切后的树脂块从剩余的树脂基底上切下，以确保仅将一小块样品放入聚焦离子束/扫描电子显微镜（FIB/SEM）中。该树脂块的总高度不应超过5 mm。</li>
<li>用碳导电胶将树脂块粘附至铝制样品台，确保待成像的一侧位于最外缘（图1）。</li>
<li>待胶水干燥后，使用Cressington真空蒸发系统在树脂块表面镀上一层薄金（> 20 nm）。</li>
</ol>
3. 在聚焦离子束/扫描电子显微镜中的成像
<ol start="20">
<li>在低倍镜下，使用二次电子成像（5 kV，0.5 nAmp），调整样品块方向，使选定的兴趣区域及待成像的样品侧面朝向操作者（图2 c, d）。</li>
<li>调整样品块方向，使待成像的表面与切削离子束平行。此时电子束与该表面的夹角为54°（图2 b）。</li>
<li>使用30 kV电压、13–27 nAmps的离子束电流，从待成像区域前方去除一条狭窄的树脂带。</li>
<li>切换至背散射电子成像模式，以观察覆盖在兴趣区域上方的切削面。</li>
<li>结合光学显微镜参考图像（步骤16中获取）与切削面图像，定位样品块上需要进一步切削和成像的精确区域（图2）。</li>
<li>利用显微镜的气体注入系统，在兴趣区域上方的样品块表面沉积一层保护性碳层（或金属层），厚度约为1微米（图2）。</li>
<li>使用700皮安（picoAmps）的电流，精细切削最终将用于获取图像的样品区域。</li>
<li>持续使用离子束完全切削该成像面，直至表面不再可见切削伪影。通过在整个视野范围内观察连续图像的变化来判断是否完成充分切削。切削不足的表现为图像中出现垂直的白色条纹或“帘状”伪影。</li>
<li>让显微镜静置至少2小时，以使任何热效应充分消散。此举可降低成像过程中样品面漂移的风险，避免图像错位。</li>
<li>设置显微镜参数以进行连续成像。确保电子束电压足够低，仅对样品表面极浅层的材料进行成像，且该成像深度应远小于每次切削去除的表面厚度。典型的成像参数为1.2–2.0 kV电压，像素尺寸为4–20 nm。像素驻留时间应保持在约10 μsecs，以确保完成一次切削并获取一幅图像的总时间低于2分钟（图3）。</li>
</ol>
4. 成功的秘诀
步骤 1）确保样品厚度不超过 150 微米。这将有助于各种染料和树脂充分渗透到组织中。可在固定后立即使用振动切片机对样品进行切片以达到此厚度。该厚度适用于脑组织。其他类型的组织需进行测试，以确保固定和染色效果充分。
步骤 3）在加入该次级固定剂时，样品必须在溶液中均匀分散，而不能聚集在离心管的某一区域。这将确保样品得到最大程度的渗透，并减少在固定过程中样品发生变形。在加入溶液后，立即轻轻旋转离心管内的样品即可实现均匀分散。
步骤15）确保目标区域位于块状样品表面正下方（< 30 微米）。这将减少图像采集阶段离子束的研磨量。
步骤22）离子束的扫描时间需要足够长，以确保整个成像表面被完全铣削。铣削不足会在成像表面上表现为垂直向下的白色条纹或“帘状”伪影。
步骤26）最终铣削的表面必须大于成像区域的表面。这是因为铣削产生的树脂碎屑会从块体上被喷射出来，并重新沉积在块体表面附近。这种再沉积可能会侵入成像视野，因此需铣削比成像区域大得多的面积以避免此问题。对于宽度为20微米的成像窗口，铣削后的块体表面宽度应大于30微米。
步骤29）至关重要的是，电子束参数应确保图像由仅从样品块表面最表层几纳米范围内出射的电子生成。这可通过将电压降至2 kV以下，并确保没有电子穿透过深来实现。同时，在探测器上施加栅极电压，使只有能量最高的电子参与最终成像，也有助于实现这一目标。通常情况下，当成像电压为1.5 kV时，采用1.3 kV的栅极电压。
5. 代表性结果：
<img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig1.jpg" alt="神经科学样品制备，脑组织切片；微电极植入过程。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1. 树脂块的制备。a) 在体视显微镜下观察经树脂包埋的成年大鼠脑冠状切片（厚度为 80 微米）。图像清晰显示了可从该切片中切割出的不同脑区；b) 使用手术刀片进行切割。此处，从皮层切取一个 1 毫米见方的组织块，并 c) 粘附至空白树脂块上。d) 然后使用安装在超薄切片机上的玻璃刀修整树脂块，当修块至仅保留目标区域时（e），在包埋材料的前表面垂直方向切出一个台阶。f) 随后将整个修整后的区域从树脂块其余部分切下，并安装到铝质样品台上，准备进行金属镀膜及扫描电子显微镜成像。
<img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig2.jpg" alt="纳米结构静态平衡示意图及角度测量；采用电子显微镜进行分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 为聚焦离子束/扫描电子显微镜（FIB/SEM）成像制备块面。a) 和 b) 展示了样品块及其被铣削以形成成像面的边缘示意图（黑色双头箭头所示）。图中显示离子束（白色）与成像面平行，电子束（灰色）以54°角入射到成像面。 c) 为使用电子束并经二次电子成像所获得的样品块视图。在样品块的这一侧，一个较暗的区域（白色虚线框所示）显示了已被粗铣的部分表面（双头黑色箭头所示），以暴露出下方的样品。d) 当仅使用背散射电子对该区域成像时，可观察到嵌入的组织。此处，嵌入组织切片的全宽度由双头白色箭头标示。 c) 中的比例尺为100 µm。
<img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig3.jpg" alt="利用三维电子显微镜进行神经元结构分析；成像揭示了详细的细胞解剖结构。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 对脑组织体积进行成像，获得各向同性体素。a) 区域反差反转的背散射电子图像，显示大鼠脑组织区域内的超微结构。所有膜结构以及大型大分子结构均清晰可见。b) 在5 nm间距下共采集1600张图像，生成具有各向同性体素的图像堆栈。c) 该图像堆栈可在任意平面成像，并保持相同分辨率。本图展示了同一突触连接在xy平面和yz平面的成像结果。

<ol><li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).</li>
<li>Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam-scanning+electron+microscope%3A+exploring+large+volumes+of+atherosclerotic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue.</a> J Microsc. 235, 336-347 (2009).</li>
<li>Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+transient+blood+vessel+fusion+events+in+zebrafish+by+correlative+volume+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy.</a> PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

当目标区域不过大时，聚焦离子束/扫描电子显微镜（FIB/SEM）技术能够达到最佳效果。成像体积的上限取决于离子束及其在数小时内持续稳定铣削的区域范围。目前已有在约60 × 60微米面积上进行操作的实例，但以合适的图像分辨率对整个区域进行成像并不可行，主要受限于采集如此大图像所需的时间。例如，一幅4000 × 4000像素、像素驻留时间为10微秒的图像需要2分40秒才能完成采集；而对于60微米的视场，其像素尺寸仅为15 nm。在对细胞和组织的超微结构进行成像时，更小的像素尺寸更为合适，通常为4至10 nm/像素。若对60 × 60微米的区域以该分辨率成像，即使显微镜具备相应能力，采集时间也将长达10小时。基于上述原因，该显微镜最适合用于成像体积约为10 × 10 × 10微米，或完整细胞中的重要区域。对于经此方法染色对比良好的样品，此类成像可在48小时内轻松完成。
目前，该方案主要应用于脑组织以及贴壁在盖玻片上的各种培养哺乳动物细胞。然而，这种固定和染色步骤也可用于其他多种生物材料，包括植物材料，以获得对比度同样良好的图像序列。
因此，该技术的主要优势在于其能够以各向同性的体素对体积进行成像。此类图像堆栈允许利用堆栈中任意平面上的图像对三维体积进行分析。其优势在于使观察者能够从任意方向观察图像序列中的特征，从而提供更丰富的图像细节（图3）。

<table><tbody><tr><td>氰基丙烯酸酯胶水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜：Leica MZ8</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Durcupan 树脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIB/SEM 显微镜（Zeiss，NVision 40）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃组织学载玻片</td><td>Menzel-Glaser</td><td>AA00008032E</td><td></td></tr><tr><td>玻璃刀制备仪：Leica EM KMR2</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃闪烁瓶（20 ml）</td><td>EMS</td><td>72634</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>EMS</td><td>16222</td><td></td></tr><tr><td>珠宝商&amp;rsquo;s 锯</td><td>EMS</td><td>72010</td><td></td></tr><tr><td>模具分离剂</td><td>Glorex，瑞士</td><td>62407445</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>EMS</td><td>19110</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>EMS</td><td>RT 19208</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液用磷酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71642 和 71496</td><td></td></tr><tr><td>二甲胂酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20840</td><td></td></tr><tr><td>带金靶的溅射镀膜仪</td><td>Cressington Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱（TBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1378</td><td></td></tr><tr><td>超薄切片机：Leica UCT</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>EMS</td><td>RT 22451</td><td></td></tr></tbody></table>

聚焦离子束刻蚀与脑组织扫描电子显微镜观察

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

本方案描述了如何使用聚焦离子束/扫描电子显微镜（FIB/SEM）对脑组织等生物样品进行三维成像。样品首先用醛类固定，再使用四氧化锇和醋酸铀酰进行重金属染色。随后用酒精脱水，并浸入树脂中，然后使树脂硬化。利用光学显微镜和配备玻璃刀的超薄切片机，制备出包含靠近表面的目标区域的小块样品。将该样品块放入FIB/SEM中，用离子束沿样品块一侧靠近目标区域处粗略地铣削出一个垂直切面。利用背散射电子对下方结构成像，再用更精细的离子束铣削出一个较小的切面，并更仔细地观察表面，以确定需要成像和铣削的精确区域。随后设置显微镜参数，使该切面被反复铣削和成像，从而在样品块内部连续采集一系列图像。图像堆栈通常包含各向同性的体素，每个方向上的尺寸可小至4 nm。这种在任意成像平面内的图像质量，使用户能够在图像堆栈内以任意观察角度分析细胞的超微结构。

本方案描述了如何在聚焦离子束扫描电子显微镜中对树脂包埋的脑组织进行三维制备与成像。

本方案描述了如何利用聚焦离子束/扫描电子显微镜技术对生物样品（如脑组织）进行三维成像。

本实验的目的是利用聚焦离子束与扫描电子显微镜，对脑组织特定区域进行连续图像采集。该过程首先将脑组织切成薄片，经染色后进行树脂包埋。第二步是从包埋的脑组织切片中切割出目标区域，并将其固定在空白树脂块上。第三步是使用超薄切片机修整树脂块，并利用显微镜的离子束仅隔离出待成像区域。最后一步是使用离子束对树脂块的一个表面进行连续成像，在每次成像前用离子束逐次去除薄层。最终可获得显示感兴趣区域连续切面的图像结果。图像序列可自动采集，所得数据集通常具有各向同性的体素，因此可在堆栈中从任意角度观察图像结构。与传统的连续切片透射电子显微镜技术相比，该技术的主要优势在于能够实现更高的Z轴分辨率。同时，相较于电子断层扫描技术，它能够在最佳分辨率下对更大体积的树脂包埋样品进行成像。该操作首先从经灌流麻醉的大鼠中解剖出固定好的脑组织。将脑组织置于塑料模具中的温热5%琼脂糖中，于琼脂糖凝固前将脑组织调整至正确角度，随后将内含脑组织的琼脂糖块固定在振动切片机的样品托上。以80微米厚度切取冠状面切片，根据需要切出足够数量的切片以包含目标区域。接下来将样品放入20毫升玻璃绝缘小瓶中。每瓶最多放置10个切片。用0.1摩尔K coate缓冲液对样品进行三次冲洗，每次五分钟。然后用含1.5%氰化钾和1%四氧化锇的0.1摩尔K coate缓冲液对样品染色30分钟。接着用含1%四氧化锇的0.1摩尔K coate缓冲液继续染色30分钟。随后用双蒸水漂洗一次，持续3分钟，再用双蒸水中1%醋酸铝染色30分钟。接下来，用双蒸水冲洗切片5分钟，然后将切片依次浸入浓度递增的梯度酒精中脱水，每次更换酒精后孵育2分钟。下一步是将切片浸入由Duran树脂与酒精混合而成、树脂浓度逐步增加的溶液中，每次更换溶液后孵育30分钟。起始比例为50%乙醇与50%树脂，随后为30%乙醇与70%树脂，再随后为10%乙醇与90%树脂，最后将切片置于100%树脂中孵育30分钟。然后用100%新鲜的Duran树脂替换介质，在滚轴混合器上缓慢振荡一小时。包埋后，使用木质鸡尾酒棒将切片转移至预先涂有模具分离剂的玻璃载玻片上。尽可能在载玻片上放置较多的切片，但注意不要过于密集。确保在显微镜载玻片之间也放置身份标识标签。将载玻片置于65摄氏度的烘箱中孵育24小时。第二天，将样品从烘箱中取出。用剃刀片轻轻插入玻璃载玻片之间，并用手指夹住树脂层，将其从载玻片间取出。在流动水下轻轻冲洗样品。为去除可能存在的模具分离剂，将样本置于解剖显微镜下，使用透射照明和低倍物镜进行观察。用细针标记出感兴趣区域。使用剃须刀片在感兴趣区域周围切割一个约三毫米乘三毫米的小方块。使用丙烯酸胶将小块树脂粘附到空白树脂块的顶部。接着，将树脂块夹入超薄切片机的样品 holder 中。通过连接的体视显微镜观察，用剃刀片修切目标区域周围，直至仅剩一个微小的金字塔形材料。使用固定在超薄切片机上的玻璃刀，以与样品块顶面成一定角度的方式切去靠近目标区域的样品块边缘。进一步修整样品块，使目标区域能够相对于样品块表面的尺寸被精确定位。将样品块从超薄切片机上取下，并置于透射光学显微镜下观察。拍摄目标区域。使用珠宝锯配合碳涂料，将修整好的样品块从剩余的树脂 stub 上切割下来。将切割下来的样品块粘附到 SEM 样品台，并调整方向，使待成像的一面朝向外侧边缘。待胶水干燥后，将样品转移至半月板真空蒸发系统，用一层厚度超过20纳米的金进行镀膜。树脂包埋的组织块现已准备就绪，可置于聚焦离子束扫描电子显微镜中进行成像。将样品连同样品台插入显微镜中，在低倍率下使用二次电子成像，调整组织块方向，使待成像区域及组织块侧面正对电子束。操作者应调整样品块的方向，使待成像的表面与切削电子束平行。使用13至27纳安的离子束电流，在30千伏条件下，使电子束与该表面呈54度角。从待成像区域的正面去除一条狭窄的树脂带。接着，切换至背散射成像模式，以观察覆盖在目标区域上方的切削面。利用先前拍摄的光学显微镜参考图像以及切削面的图像，结合显微镜的气体注入系统，定位样品块上需要进行切削和成像的精确区域。使用700皮安的电流，在目标区域上方的块状样品表面沉积一层约一微米厚的碳或金属保护层。最后，对将要获取最终图像的样品区域进行铣削。让铣削电子束完全铣削该成像表面，直至表面看不到任何铣削伪影为止。选择用于面部连续成像的显微镜参数。典型参数为电压在1.2至2千伏之间，像素尺寸在4至20纳米之间。像素驻留时间应约为10微秒，以便铣削表面并获取一幅图像的总时间低于两分钟。让显微镜静置至少两个小时，以消除任何热变化的影响。随后开始铣削和成像过程，以获取感兴趣区域的连续图像。该图显示了块面的反差衬度背散射图像，展示了包裹脑组织某区域内的超微结构。所有膜结构以及大型大分子结构均清晰可见。该图像由总共 1,600 张图像组成，图像采集间距为 5 纳米，从而形成具有各向同性体素的图像序列。该序列可在任意平面上以相同分辨率进行成像。通过观看本视频，您应能充分了解如何制备脑组织样本，以用于聚焦离子束扫描电子显微镜的连续成像。

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