聚焦离子束刻蚀与脑组织扫描电子显微镜观察
2011年7月6日
本方案描述了如何在聚焦离子束扫描电子显微镜中对树脂包埋的脑组织进行三维制备与成像。
本实验的目的是利用聚焦离子束与扫描电子显微镜，对脑组织特定区域进行连续成像。该过程首先将脑组织切成薄片，经染色后包埋于树脂中；第二步是从包埋的脑组织切片中切割出目标区域，并将其固定在空白树脂块上。
第三步是使用超薄切片机修整树脂块，并利用显微镜的离子束仅隔离出待成像的区域。最后一步是使用离子束对树脂块的一个表面进行连续成像，在每次成像前用离子束逐次去除薄层。最终可获得显示感兴趣区域连续切面的图像结果。
图像序列可自动采集，所得数据集通常具有各向同性的体素，因此可在堆栈中从任意角度观察图像结构。与传统的连续切片透射电子显微镜技术相比，该技术的主要优势在于能够实现更高的Z轴分辨率。同时，相较于电子断层扫描技术，它能够在最佳分辨率下对树脂包埋样品的更大体积进行成像。
从麻醉并灌注固定的 大鼠 中取出脑组织开始实验操作。将脑组织置于塑料模具中的温热 5% 琼脂糖中包埋，在琼脂糖凝固前将脑组织调整至正确角度，然后将内含脑组织的琼脂糖块固定在振动切片机的样品托上。使用振动切片机切割 80 微米厚的冠状切片，根据需要切割足够数量的切片以包含目标区域。
接下来将样品放入20毫升玻璃保温瓶中。每瓶最多放置10个切片。用0.1摩尔K coate缓冲液对样品进行三次冲洗，每次五分钟。
然后用含1.5%氰化钾和1%四氧化锇的0.1摩尔K coate缓冲液对样品染色30分钟。接着用含1%四氧化锇的0.1摩尔K coate缓冲液继续染色30分钟。随后用双蒸水冲洗一次，持续3分钟，再用双蒸水中含1%醋酸铝的溶液染色30分钟。
接下来，用双蒸水冲洗切片5分钟，然后将切片依次浸入浓度递增的梯度酒精中脱水，每次更换酒精后作用2分钟。下一步是将切片浸入由Duran树脂与酒精混合而成、树脂浓度逐步增加的溶液中，每次更换溶液后作用30分钟。起始比例为50%乙醇与50%树脂，随后为30%乙醇与70%树脂，再后为10%乙醇与90%树脂，最后将切片置于100%树脂中作用30分钟。
然后用100%新鲜的Duran树脂替换原有培养基，在滚轴混合器上缓慢振荡一小时。包埋完成后，使用木质牙签将切片转移至预先涂有模具分离剂的玻璃载玻片上。
尽可能在载玻片上放置较多的切片，但注意不要过于密集。确保在显微镜载玻片之间也放置身份标识标签。将载玻片置于65°C的烘箱中孵育24小时。
第二天，从烘箱中取出样品。将刀片轻轻插入玻璃载玻片之间，用手指夹住树脂层，将其从载玻片间取出。在流动水下轻轻冲洗样品。
为去除可能存在的模具分离剂，将样本置于解剖显微镜下，使用透射照明和低倍物镜进行观察。用细针标记出目标区域。使用剃须刀片在目标区域周围切割出一个约三毫米乘三毫米的小方块。
使用丙烯酸胶将小的树脂块粘附到空白树脂块的顶部。接着，将树脂块夹入超薄切片机的样品 holder 中。通过连接的体视显微镜观察，用剃刀片修块，围绕目标区域修剪，直至仅剩下一个微小的金字塔形材料。
使用固定在超薄切片机上的玻璃刀，以与样品块顶面成一定角度的方式切去靠近目标区域的样品块边缘。进一步修整样品块，使目标区域能够相对于样品块表面的尺寸被精确定位。将样品块从超薄切片机上取下，置于透射光学显微镜下观察。
拍摄目标区域。使用珠宝锯配合碳导电漆，将修整好的样品块从剩余的树脂 stub 上切割下来。将样品块粘附到扫描电镜样品台，并调整方向，使待成像的一面朝向外侧边缘。
胶水干燥后，将样品转移至半月板真空蒸发系统，用一层厚度超过20纳米的金进行镀膜。树脂包埋的组织块现已准备好用于聚焦离子束扫描电子显微镜成像。将样品连同样品台以低倍率插入显微镜，利用二次电子成像调整组织块方向，使待成像区域及组织块侧面正对电子束。
操作者应调整样品块的方向，使待成像的表面与切削电子束平行。使用13至27纳安的离子束电流，在30千伏条件下，使电子束与此表面呈54度角。
从待成像区域的正面去除一条狭窄的树脂带。接着，切换至背散射成像模式，以观察覆盖在目标区域上方的切削面。利用先前拍摄的光学显微镜参考图像以及切削面的图像，结合显微镜的气体注入系统，定位样品块上需要进行切削和成像的精确区域。
使用700皮安的电流，在目标区域上方的块状样品表面沉积一层约一微米厚的碳或金属保护层。最后，对将要采集最终图像的样品区域进行铣削。让铣削电子束完全铣削该成像表面，直至表面不再可见任何铣削伪影。
选择用于面部连续成像的显微镜参数。典型参数为电压在1.2至2千伏之间，像素尺寸在4至20纳米之间。像素驻留时间应约为10微秒，以便铣削表面并获取一幅图像的总时间低于2分钟。
让显微镜静置至少两个小时，以消除任何热变化的影响。随后开始铣削和成像过程，以获取目标区域的连续图像。该图显示了块面的反差衬度背散射图像，展示了包裹脑组织某区域内的超微结构。
所有膜结构以及大型大分子结构均清晰可见。该图像由总共 1,600 张图像组成，图像采集间距为 5 纳米，从而形成具有各向同性体素的图像序列。该序列可在任意平面成像，且分辨率保持相同。
通过观看本视频，您应能充分了解如何制备脑组织样本，以用于聚焦离子束扫描电子显微镜的连续成像。
概述
本方案描述了使用聚焦离子束扫描电子显微镜对树脂包埋的脑组织进行三维制备和成像的方法。该方法可实现对特定脑区的高分辨率成像。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 成像技术
- 组织学
背景
- 聚焦离子束扫描电子显微镜相较于传统成像方法具有优势。
- 它能提供更高的Z轴分辨率，并可对树脂包埋的大体积样本进行成像。
- 该技术特别适用于研究脑组织的结构。
- 连续成像可实现对目标区域的全面分析。
研究目的
- 采集脑组织的连续图像，以进行详细的结构分析。
- 展示一种可提高成像分辨率和成像体积能力的方法。
- 促进在三维背景下对特定脑区的研究。
使用的方法
- 脑组织的解剖及树脂包埋。
- 脑切片的连续切片与染色。
- 用于成像的树脂块修块与制片。
- 采用聚焦离子束扫描电子显微镜进行成像。
主要结果
- 成功获取感兴趣区域的连续图像。
- 通过各向同性体素实现了高分辨率成像。
- 展示了从多个角度可视化结构的能力。
- 结果表明，相较于传统成像方法有显著提升。
结论
- 该方案为成像树脂包埋的脑组织提供了一种可靠的方法。
- 聚焦离子束扫描电子显微镜技术适用于精细结构研究。
- 该技术可增进我们对脑组织结构的理解。
常见问题
行业重要性概述
聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB/SEM）能够以小至4 nm的各向同性体素对脑组织进行高分辨率三维成像，支持对超微结构的详细分析。该技术通过提供有关细胞结构和病理的机制性见解，增强了神经科学药物研发中靶点验证的可靠性。该方法允许多角度观察组织结构，避免切片伪影，从而提高了临床前模型的预测可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过详细可视化细胞超微结构和大分子复合物，实现对治疗假设的深入探究。
- 操作价值：通过揭示天然组织环境中结构靶点，支持生物学风险评估。
- 预测价值：通过允许从图像堆栈内的任意视角分析组织，提高靶点验证的可信度。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：生成标准化、可重复的图像数据集，适用于定量形态测量分析。
- 可扩展性：能够在树脂包埋样品的最佳分辨率下，对较电子断层成像更大的体积进行成像。
- 平台可重复使用：生成连续图像堆栈，可用于针对多个靶标或通路的重新分析。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过各向同性体素分辨率，在从发现到临床前验证的整个过程中保持结构保真度。
- 机制性风险降低：阐明脑组织中的结构-功能关系，为靶点选择提供依据。
- 基于风险评估的推进：通过提供与疾病相关系统的高保真结构数据，支持决策推进或终止项目。
流程与工作流整合
FIB/SEM 融入了从早期靶点验证到临床前成像的发现全过程，能够进行结构分析，为先导化合物的鉴定和机制研究提供依据。
- 发现生物学：通过在完整组织体积中可视化亚细胞结构，支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供定量的、各向同性的三维数据集，实现不同条件下结构表型的可靠比较。
- 分析：提供纳米级分辨率的连续成像，允许对组织结构进行精确的形态测量和统计分析。
- 转化研究：通过一致的高分辨率脑组织成像，将发现阶段的结构研究成果与临床前模型相连接。
- 企业级复用：建立可重复使用的成像能力，用于长期研究治疗靶点结合及组织反应。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低脑组织研究中的机制模糊性，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过自动化的连续切片与成像工作流程，确保实验的可重复性与标准化。
- 战略价值：实现高分辨率下的大体积成像，减少对多种互补技术的依赖，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：提供关于靶点结合与组织病理的详细结构数据，助力基于风险调整的优先级决策。
实施注意事项
- 需要具备组织学、树脂包埋和电子显微镜技术方面的专业知识。
- 依赖于配备气体注入和镀膜系统的聚焦离子束扫描电子显微镜的使用条件。
- 需要跨团队在样品制备、染色和包埋方案方面进行标准化。
- 在将该方法应用于不同脑区或疾病模型时，需考虑适应性调整。
- 存在实际限制，例如较长的处理时间以及成像前需要进行导电镀膜。
