聚焦离子束刻蚀与脑组织扫描电子显微镜观察

本实验的目的是利用聚焦离子束与扫描电子显微镜，对脑组织特定区域进行连续图像采集。该过程首先将脑组织切成薄片，经染色后进行树脂包埋。第二步是从包埋的脑组织切片中切割出目标区域，并将其固定在空白树脂块上。

第三步是使用超薄切片机修整树脂块，并利用显微镜的离子束仅隔离出待成像区域。最后一步是使用离子束对树脂块的一个表面进行连续成像，在每次成像前用离子束逐次去除薄层。最终可获得显示感兴趣区域连续切面的图像结果。

图像序列可自动采集，所得数据集通常具有各向同性的体素，因此可在堆栈中从任意角度观察图像结构。与传统的连续切片透射电子显微镜技术相比，该技术的主要优势在于能够实现更高的Z轴分辨率。同时，相较于电子断层扫描技术，它能够在最佳分辨率下对更大体积的树脂包埋样品进行成像。

该操作首先从经灌流麻醉的大鼠中解剖出固定好的脑组织。将脑组织置于塑料模具中的温热5%琼脂糖中，于琼脂糖凝固前将脑组织调整至正确角度，随后将内含脑组织的琼脂糖块固定在振动切片机的样品托上。以80微米厚度切取冠状面切片，根据需要切出足够数量的切片以包含目标区域。

接下来将样品放入20毫升玻璃绝缘小瓶中。每瓶最多放置10个切片。用0.1摩尔K coate缓冲液对样品进行三次冲洗，每次五分钟。

然后用含1.5%氰化钾和1%四氧化锇的0.1摩尔K coate缓冲液对样品染色30分钟。接着用含1%四氧化锇的0.1摩尔K coate缓冲液继续染色30分钟。随后用双蒸水漂洗一次，持续3分钟，再用双蒸水中1%醋酸铝染色30分钟。

接下来，用双蒸水冲洗切片5分钟，然后将切片依次浸入浓度递增的梯度酒精中脱水，每次更换酒精后孵育2分钟。下一步是将切片浸入由Duran树脂与酒精混合而成、树脂浓度逐步增加的溶液中，每次更换溶液后孵育30分钟。起始比例为50%乙醇与50%树脂，随后为30%乙醇与70%树脂，再随后为10%乙醇与90%树脂，最后将切片置于100%树脂中孵育30分钟。

然后用100%新鲜的Duran树脂替换介质，在滚轴混合器上缓慢振荡一小时。包埋后，使用木质鸡尾酒棒将切片转移至预先涂有模具分离剂的玻璃载玻片上。

尽可能在载玻片上放置较多的切片，但注意不要过于密集。确保在显微镜载玻片之间也放置身份标识标签。将载玻片置于65摄氏度的烘箱中孵育24小时。

第二天，将样品从烘箱中取出。用剃刀片轻轻插入玻璃载玻片之间，并用手指夹住树脂层，将其从载玻片间取出。在流动水下轻轻冲洗样品。

为去除可能存在的模具分离剂，将样本置于解剖显微镜下，使用透射照明和低倍物镜进行观察。用细针标记出感兴趣区域。使用剃须刀片在感兴趣区域周围切割一个约三毫米乘三毫米的小方块。

使用丙烯酸胶将小块树脂粘附到空白树脂块的顶部。接着，将树脂块夹入超薄切片机的样品 holder 中。通过连接的体视显微镜观察，用剃刀片修切目标区域周围，直至仅剩一个微小的金字塔形材料。

使用固定在超薄切片机上的玻璃刀，以与样品块顶面成一定角度的方式切去靠近目标区域的样品块边缘。进一步修整样品块，使目标区域能够相对于样品块表面的尺寸被精确定位。将样品块从超薄切片机上取下，并置于透射光学显微镜下观察。

拍摄目标区域。使用珠宝锯配合碳涂料，将修整好的样品块从剩余的树脂 stub 上切割下来。将切割下来的样品块粘附到 SEM 样品台，并调整方向，使待成像的一面朝向外侧边缘。

待胶水干燥后，将样品转移至半月板真空蒸发系统，用一层厚度超过20纳米的金进行镀膜。树脂包埋的组织块现已准备就绪，可置于聚焦离子束扫描电子显微镜中进行成像。将样品连同样品台插入显微镜中，在低倍率下使用二次电子成像，调整组织块方向，使待成像区域及组织块侧面正对电子束。

操作者应调整样品块的方向，使待成像的表面与切削电子束平行。使用13至27纳安的离子束电流，在30千伏条件下，使电子束与该表面呈54度角。

从待成像区域的正面去除一条狭窄的树脂带。接着，切换至背散射成像模式，以观察覆盖在目标区域上方的切削面。利用先前拍摄的光学显微镜参考图像以及切削面的图像，结合显微镜的气体注入系统，定位样品块上需要进行切削和成像的精确区域。

使用700皮安的电流，在目标区域上方的块状样品表面沉积一层约一微米厚的碳或金属保护层。最后，对将要获取最终图像的样品区域进行铣削。让铣削电子束完全铣削该成像表面，直至表面看不到任何铣削伪影为止。

选择用于面部连续成像的显微镜参数。典型参数为电压在1.2至2千伏之间，像素尺寸在4至20纳米之间。像素驻留时间应约为10微秒，以便铣削表面并获取一幅图像的总时间低于两分钟。

让显微镜静置至少两个小时，以消除任何热变化的影响。随后开始铣削和成像过程，以获取感兴趣区域的连续图像。该图显示了块面的反差衬度背散射图像，展示了包裹脑组织某区域内的超微结构。

所有膜结构以及大型大分子结构均清晰可见。该图像由总共 1,600 张图像组成，图像采集间距为 5 纳米，从而形成具有各向同性体素的图像序列。该序列可在任意平面上以相同分辨率进行成像。

通过观看本视频，您应能充分了解如何制备脑组织样本，以用于聚焦离子束扫描电子显微镜的连续成像。