在光学透明的氧化铟锡电极上构建细胞图案

你好，我是Isha。我是Zen博士实验室的二年级研究生。我们现在位于加州大学戴维斯分校生物医学工程系。

今天，我将向您展示如何在组织工程与再生研究中，利用微加工的光学透明氧化铟锡电极控制肝细胞。为了在体外构建这种微环境，关键在于能够在空间和时间上将细胞在基底上进行分离。我们致力于设计出能够调控不同类型肝细胞位置的表面。

在今天的实验中，我们将利用表面修饰、微加工和电化学方法构建一种可从抗细胞黏附转变为促细胞黏附的表面。第一步是光刻。以下是该过程的操作流程图。

蓝色部分是玻璃基板，绿色部分是涂覆在玻璃基板上的氧化铟锡。首先，我们要在涂有氧化铟锡的玻璃基板上旋涂一层光刻胶（如图中红色部分所示）。然后，将样品通过掩膜暴露于紫外光下，曝光区域将在显影液中进行显影。

未被光刻胶保护的ITO区域将在ITO刻蚀过程中被去除。最后，所有残留的光刻胶将在丙酮中被完全去除，从而形成我们的ITO电极。以下是剩余三个步骤的流程图。

首先，我们将使用聚乙二醇氰酸酯（peg cylin）对整个表面进行修饰。这将使表面具有抗污性，从而阻止细胞或蛋白质的结合。接下来，我们将利用电化学方法，从之前制备的I型两个电极上特异性地去除聚乙二醇氰酸酯（peg cylin）。

最后，我们将成纤维细胞接种到表面，它们将仅选择性地结合到条带区域。现在我们已准备好开始实验。第一步是进行光刻，该步骤将在洁净室中完成。

接下来，我们进入洁净室。现在我们已到达洁净室。在开始实验之前，需要将我们的氧化铟锡（ITO）镀膜样品放入烘箱中，在 200 °C 下进行烘烤。

这样我们就可以对所有表面进行脱水处理。在200 °C下烘烤之后，我们将基底放置在匀胶机上，并真正涂覆光刻胶。因此，在对ITO基底进行脱水处理后，我们会将其取出并放置在匀胶机的卡盘上。

这个卡盘刚好可以固定住一块玻璃光源的四分之一。然后，我们将施加真空。之后，在基底上涂覆正性光刻胶。

涂覆光刻胶后，我们即可开始操作。该过程包含两个步骤：首先是涂布，其次是旋涂步骤中的铺展。

卡盘以800 RPM的转速旋转，使光刻胶均匀地分布在整个表面。接下来是旋转步骤，转速为4,000 RPM，在此转速下会形成一层非常薄的光刻胶，所谓薄是指大约一微米。

如果将“photoresist”一词拆分，即为“photo”和“resist”。它可被光激活。因此，我们在洁净室中操作，并使用过滤后的光源，以防止光刻胶因光照而提前激活；同时，它具有抗蚀性，这一特性将在后续的刻蚀工艺中被利用。

现在，我们已经完成了在表面旋涂光刻胶的步骤，接下来只需将其取出，进入下一步操作。在将样品加热烘烤1分45秒后，我们将样品从加热板上取下，转移到我们的康宁掩模对准仪上。在此处，我们取出所需的掩模，并将其放置在基底上方，以便在带有光刻胶的基底与掩模之间实现接触式曝光。为了增加压力，我们会在上面放置一片四英寸的玻璃晶圆作为重物。

完成这一步后，我们只需将快门重新装上，然后将样品暴露在紫外光下。曝光完成后，我们按相反顺序移开盖子。取出玻璃基片，取下掩模，然后移除基底并将其送入显影工序。

暴露样品后，将其放入显影液中。当样品暴露于紫外光时，会产生氢离子，这些氢离子与显影液中的碱发生中和反应，并从表面被去除。因此，在处理样品时，需要持续晃动基底。

当进行此操作时，大约在一分钟到一分半钟内，可以看到曝光区域实际上已经开始显影并从表面去除。但为了完成整个显影过程，我们让其在显影液中继续浸泡约五分钟。显影完成后，将其取出，用去离子水清洗，然后使用氮气枪吹干。

样品干燥后，我们将将其转移至显微镜下进行观察。此处我们正在显微镜下观察样本，该样本在显色反应五分钟后刚刚取出。

此处可以看到两个区域：一个被光刻胶覆盖的较暗区域，以及一个光刻胶已被去除的较亮区域。与之前使用的掩膜版相对应，掩膜版上较暗的区域对应于当前在显微镜下观察到的较暗区域，而此处所见较亮的区域在掩膜版上是透明的。其中一个设计显示的是尺寸从500微米到50微米不等的多种阵列，而另一个设计则是由直径1000微米的圆相互连接而成。

因此，这里展示的是使用相同方法制备的另一种设计。此处具有可单独寻址的电极。所谓“可单独寻址”，是指氧化铟锡（ITO）的不同区域相互连接，并可分别进行激活。

例如，在此结构中，中央的圆形区域连接到一个电极垫，而最外侧的矩形区域则连接到另一个不同的电极垫。通过这种方式，我们可以在不同的时间点分别刺激这两个不同的表面。观察完样品后，接下来的步骤是进行样品刻蚀。

在氧化铟锡（ITO）刻蚀过程中，未被光刻胶保护的区域将被刻蚀掉。在进行此操作之前，我们必须穿戴适当的防护服装，因为氧化铟锡刻蚀液含有酸性物质。现在，在穿上防酸保护服并佩戴好面部防护罩后，我将把一些氧化铟锡刻蚀液倒入玻璃烧杯中。

ITO刻蚀液由20%盐酸、5%硝酸和其余去离子水组成。然后将我的样品取出并放入刻蚀液中。此前在显微镜下观察到，存在一些未被光刻胶保护的区域。

ITO刻蚀中的酸攻击了这些区域，导致这些区域的ITO被刻蚀掉。随着ITO从表面缓慢降解，其颜色发生变化。在这里，您可以看到它从最初带有的蓝色变为这种紫蓝色，现在正进一步转变为黄色。

颜色的变化表明 ITO 正在被蚀刻掉。现在我们已经到了 15 分钟，所有的 ITO 都已完全被蚀刻掉。

目前您所看到的照片中是受保护的ITO区域。蚀刻完成后，表面仍残留有一些酸。为了去除这些酸，我们将样品放入碳酸钠溶液中，以中和所有残留的酸。

中和酸液后，我们将样品取出，用去离子水清洗，然后用氮气吹干。至此，酸蚀步骤已完成。不再使用酸液，我也脱下了防护服。

我们将把它取出并转移至显微镜下进行观察。现在我们正在显微镜下观察样品，这是在完成ITO刻蚀之后的结果。

在这种情况下，较暗的区域是玻璃区域，其中的氧化铟锡（ITO）已被蚀刻去除。而较亮的区域则是被光刻胶保护的氧化铟锡（ITO）。再次说明，这些阵列的尺寸从500微米到50微米不等，而在另一种情况下，我们得到的是每个直径为1000微米的相互连接的圆形结构。

因此，我们刚刚在显微镜下观察到存在玻璃区域和ITO区域，但ITO区域被光刻胶保护着。现在我们需要去除这层光刻胶。具体操作是：将我们的基底放入丙酮中，然后置于超声波清洗仪中，超声处理10分钟即可。

这一步确保完全去除所有光刻胶，可以单独作为显影步骤使用，但通过超声处理（利用声波冲击）可确保光刻胶被正确去除。从超声清洗机中取出后，用去离子水冲洗，并再次用氮气吹干，现在即可在玻璃基底上清晰地看到图案。这些图案正是最初由光刻胶保护而保留下来的区域。

在观察了我们的样品并制备或形成ITO图案后，我们将开始实验的第二阶段。该阶段涉及使用PEG环胺的自组装单分子层对表面进行修饰。但在进行此步骤之前，我们必须确保表面具有反应活性。

为此，我们将样品放入等离子清洗机中。这会在表面引入羟基，从而使其具有反应活性。操作时，只需将样品放入等离子清洗机，然后启动真空泵即可。

打开氧气，然后开启主电源。该电源用于将氧气转化为等离子体，随后将其引入，从而形成羟基化沟道。电源开启后，我们继续点击启动。

现在，经过上述步骤完成后，我们将基底取出，存放在培养皿中，离开洁净室并脱去洁净服，然后进入下一步操作。目前我们已离开洁净室，并完成了理想的图案化，接下来将对刚刚制备的表面进行修饰，使用聚乙二醇、CYLIN 或 PEG Cylin 进行处理。需要特别注意的是，PEG Cylin 对湿气具有反应性。

因此，我们所使用的木材必须完全无水。此处使用的玻璃器皿、培养皿等均已置于100°C下烘烤过夜。而我们将用作溶剂的丙酮也必须是无水的。

它不含水分。现在我将把无水甲苯倒入这两个玻璃容器中，其中一个装有我们的样品。现在我们需要使用两个培养皿，因为其中一个将用于进行修饰反应。

另一个将在修饰过程结束后用于实际清洗我们的基底。因此，在将样品放入玻璃培养皿后，我将把它转移至手套箱中的空气锁室。关闭空气锁室后，我们将向室内通入氮气。

目前，主腔室中已充满氮气。因此，除非腔室内充满氮气，否则我们不应打开该腔室。当两个腔室都充满氮气后，我们将连同样品和移液器一并转移至其中。

我们将使用一个插销和一把镊子，稍后用它们来转移样品。因此，我们先戴上手套，打开此处的舱室，缓慢而小心地将气闸中所有的物品取出，并放入主舱室内。这是装有基质的培养皿，以及另一份仅装有甲苯的培养皿，我们将用它进行清洗。

现有的 pxi 在氮气环境下封装，因此除非处于氮气环境中，否则不应打开此瓶。因此，每次取出样品后，都应将其放回袋中。取出您的氰化物后，我们将使用的浓度为甲苯中的 2%。

因此，取出样本并放入高容器中，混合均匀。同时准备另一个腔室，确保充分混匀，然后将样本在托因（Toin）溶液中孵育两小时。现在已过两小时，样本已在Pxi中孵育完毕，我们将取出样本并转移至新鲜的托因（Toin）溶液中进行短暂清洗，轻轻旋转混匀，随后将其转移至气闸室。

一旦样品进入我们的气闸室，只需打开腔室，取出经过修饰的表面，并使用氮气枪进行吹扫。然后将其再次放入一个洁净、干燥的培养皿中，并放入100°C的烘箱中加热两个小时。现在，样品已在100°C的烘箱中加热两小时，接下来我们将连接导线至之前制备好的电极上。

通过将银环氧树脂与固化剂按1:1比例混合来实现。这是银环氧树脂，现在我们加入等量的固化剂。需要充分混合均匀，然后用此混合物连接导线。

因此，我们将导线放置在要使用的电极上，然后进行连接。由于ITO材料上无法使用焊锡，我们必须采用银环氧树脂和固化剂进行连接。随后进行烘烤，以去除之前使用的全部固化剂，使其硬化，从而能够作为电极使用。

现在我们已经完成了两个阶段，接下来将开始实验的第三阶段，即进行电化学部分的操作。为此，我们将取一份样品并将其放入电化学池中。将样品放入电化学池后，再在其上方放置一个O形圈。

这将隔离电化学反应发生的区域，然后我们只需将电解池密封即可。现在，我已经将连接好导线的样品放入电化学池中，接下来可以使用恒电位仪施加电压了。

因此，白色导线我将连接到参比电极上，红色导线连接到对电极，最后绿色导线连接到我们的工作电极。所有电极连接完毕后，我将在电化学池中加入一倍浓度的磷酸盐缓冲液（PBS）。现在需要说明的是，该体系的工作原理是：目前整个表面已用 pxi 进行了修饰。

因此，所有电极（包括周围的玻璃区域）均用 pxi 进行修饰。一旦我在整个区域施加电压，只有存在 ITO 的区域（即我们设计的电极图案）才会使 peg 岛从这些表面脱离，而周围区域则不会受到任何影响。因此，我们能够从基底上选择性地去除 peg 岛。

现在我将点击播放，开始对工作电极施加 -1.4 伏的电压。当施加电压时，电极上会出现颜色变化，你可以观察到。颜色从原先透明的蓝绿色变为棕色。

我们怀疑电极上可能发生了一种氧化反应，导致电极变褐色。这同时也是表面的pxi确实已被从表面剥离的指标之一。再次强调，凡是你看到褐色的地方，就是peg岛已被去除的区域。

而周围的玻璃区域上仍有 PXI 组装。因此，我们施加 -1.4 瓦特的电压，持续 60 秒。这足以提供足够时间去除电极上存在的所有 PXI。

我们还可以使用此方法剥离单独布线的电极。在此情况下，有三排圆形电极需要进行剥离。我们可以通过使用三个不同的电极来选择需要剥离的具体电极。

现在，我们已成功完成了电化学实验的第三部分，即从 ITO 电极上选择性地去除了 PG 涂层。我用 PBS 和去离子水快速冲洗了电极，取下导线，并将样品放入普通的六孔板中。接下来，我们将继续进行下一步，即在这些电极上培养细胞。

现在我们位于组织培养室。在实验的最后阶段，今天将使用成纤维细胞，即3T3细胞。接种细胞时的浓度范围为每毫升0.5×10⁶至1.5×10⁶个细胞。

接种细胞后，我们将细胞置于样品上约 20 分钟，以使其有充足时间附着于去涂层区域。随后将其放入培养箱中。

现在已过去20分钟，我们可以观察细胞在ITO条带区域（即先前看到的棕色区域）上的排列情况。细胞将仅特异性地结合到这些区域，而不会在这些区域以外的任何位置附着。这里可以看到，棕色区域是已去除pxi的ITO区域。通过电化学方法，细胞仅附着在这些棕色区域，而不会附着在周围的玻璃区域。

在这一图像中，我们再次观察到细胞附着在被剥离的区域。这些是棕色区域，但在这些棕色区域上方，几乎看不到细胞附着，因为该 ITO 设计中的 PEG 未被剥离，因此细胞无法附着。好的，情况就是这样。

我们已完成实验方案，细胞已在ITO电极上形成预期的图案，这正是我们所期望的结果。我刚刚向您展示了如何在微加工的光学透明氧化铟锡电极上控制细胞黏附。今天我向您演示了如何在这些电极上对THREET三个成纤维细胞进行图案化。

我们还使用相同的程序对 Hep G2 细胞、卫星细胞以及大鼠原代细胞进行了图案化。目前的细胞图案化技术仅允许在表面组装两种细胞类型。该技术的灵活性将使未来能够在表面上组装多种空间上相互隔离的细胞类型。

我们计划利用该技术在ITO基底上对三种不同的肝细胞进行空间分离，以模拟体内的微环境。通过这种方法，可将未成熟细胞或干细胞与成熟细胞及支持细胞在空间上分隔开来，从而为未成熟细胞的生长和分化创造一种具有指导性的环境。