在光学透明的铟锡氧化物电极的图案细胞

嗨，我是 Isha。我是 Dr.Zen 实验室的二年级研究生。我们现在在加州大学戴维斯分校生物医学工程系。

今天，我将向您展示在组织工程和再生工作中对微制造的光学透明氧化铟 10 氧化物电极的 Ian 的控制，以模拟器官的微环境。为了在体外创建这种微环境，必须在空间和时间上隔离基质上的细胞。我们对设计可以控制不同肝细胞类型位置的表面感兴趣。

在今天的实验中，我们将使用表面改性、微加工和电化学来形成一个可以从电池非粘附性切换到电池芯粘合剂的表面。第一步是光刻。下面是该过程将如何运作的流程图。

蓝色是玻璃灯，绿色是涂在玻璃灯顶部的 10 氧化铟。首先，我们要做的是在 Indium 10 氧化物涂层玻璃灯的顶部旋转镀膜光刻胶 red。然后，我们将通过光掩模将其传递到紫外线，曝光区域将在显影解决方案中显影。

不受光刻胶保护的 ITO 区域将在 IT oing 中被删除。最后，所有剩余的光刻胶将在丙酮中去除，形成我们的 ITO 电极。下面是其余三个步骤的流程图。

首先，我们将使用 peg cylin 修改整个 surface。这将使表面无污染，并且没有细胞或蛋白质会与其结合。接下来，我们将使用电化学技术从我们之前制作的 I 两个电极中专门吸收钉柱。

最后，我们将在表面顶部孵育成纤维细胞，它们将仅选择性地结合到条带区域。现在我们准备好开始我们的实验了。第一步涉及光刻，将在洁净室中进行。

所以让我们继续进入洁净室。所以现在我们在我们的洁净室里。在开始实验之前，我们要做的是将氧化铟锡或 ITO 涂层样品在烘箱中以 200 C 烘烤。

这样我们就可以使所有表面脱水。在 200 C 下烘烤后，我们要将其放在旋转技术上并实际涂抹光刻胶。因此，在将我们的 ITO 基材脱水后，我们要把它拿起来放在 spin tech 的卡盘上。

这个卡盘足够大，可以容纳四分之一的玻璃灯。然后我们要，我们要应用真空。之后，我们在基材上涂上正性色调、光刻胶。

涂完光刻胶后，我们就开始吧。这涉及两个步骤。第一个是铺展，第二个是铺展步骤中的旋涂。

卡盘以 800 RPM 的速度旋转，这只是将光刻胶均匀地分布在整个表面上。然而，下一个是旋转步骤，它在 4， 000 RPN 和 4， 000 RPM 时，它会形成一个非常薄的层。我所说的薄是指大约 1 微米。

如果你把 photo， resist 这个词拆开，它就会变成 photo 和 resist。它由光激活。因此，我们在洁净室中工作，并使用过滤光，这样我们的照片门光阻就不会被光激活，并且它对资产具有抵抗力，我们将成为我们稍后在进行蚀刻时将使用的资产。

所以现在我们已经完成了表面的旋涂、光刻胶，我们只是把它取出来，继续我们的下一步。因此，在烘烤样品 1 分 45 秒后，我们要从热板中取出样品，并将其移到我们的 Cannon 面罩衬垫上。在这里，我们取一个我们需要的掩模，然后将掩模放在基板的顶部，以便在带有端口光刻胶的基板和掩模之间进行接触印刷，我们将其与四英寸的玻璃晶圆一起放置，只是为了增加它的重量。

完成后，我们只需重新打开快门，然后将样品暴露在紫外线下。曝光完成后，我们只需以相反的顺序将盖子移开即可。我们取出玻璃晶片，取出掩模，然后取下基板并接管进行显影。

公开示例后，我们将其放在开发人员解决方案中。当样品暴露在紫外线下时，会形成氢离子，这些氢离子会与碱和显影液中和，实际上会从表面去除。所以现在你要确保在做样品时，你一直在转动基材。

当你这样做时，你可以看到大约在第一分钟或一分半钟内，前暴露区域实际上是显影的并从表面去除的。但要进行完整的开发，我们让它在开发人员解决方案中放置大约 5 分钟。开发完成后，我们要把它取出来，我们要清洗它并去水，然后用氮气枪干燥它。

一旦我们干燥了样品，我们就要把它拿过来，在显微镜下观察它。在这里，我们在显微镜下观察样品。我们只是在开发 5 分钟后将其取出。

您可以在此处看到两个区域，一个被光刻胶覆盖的较暗区域和去除光刻胶的较亮区域。相对于我们之前使用的蒙版，蒙版上较暗的区域是我们现在在显微镜下看到的较暗区域，而我们在这里看到的清晰区域在蒙版上是透明的。这里显示的一种设计只是从 500 微米到 50 微米的不同大小的阵列，而另一种设计是一个 1000 微米的圆圈，它们只是相互互连的。

所以这里我们有一个不同的设计，它是使用相同的程序制作的。在这里，我们有可单独寻址的电极。我的意思是，ITO 的不同区域是相互关联的，它们可以以不同的方式激活。

例如，在这里，中央圆形区域，它们连接到一个电垫，而最外层的矩形区域，它们连接到不同的电垫。这样我们就可以在不同的时间点刺激这两个不同的表面。看完我们的样品后，下一步是蚀刻样品。

任何不受照片保护的区域都将被 ITO 蚀刻去除。在此之前，我们必须确保穿上合适的衣服，因为 ITO 蚀刻含有酸。现在，穿上我的酸性防护服，戴上我的面罩后，我要将一些 ITO 蚀刻剂倒入玻璃烧杯中。

ITO 蚀刻由 20% 氯化氢、5% 硝酸组成，其余为 DI 水。然后把我的样品拿过来，放在蚀刻中。在显微镜的早期，我们看到有一些区域没有受到照片凸起的保护。

ITO 蚀刻中的酸会侵蚀这些区域，并导致这些区域的 ITO 被蚀刻掉。当 ITO 从表面缓慢降解时，它会改变颜色。在这里，您可以看到它从最初的蓝色变化变为紫色变化，现在它正在转向黄色交换。

颜色变化表示 ITO 正在被蚀刻掉。所以现在我们到了 15 分钟。所有的 ITO，它都被完全蚀刻掉了。

您现在看到的是照片是受保护的 ITO 区域。所以蚀刻完成后，表面还残留着一些酸。为了去除这些酸，我们将其放入碳酸钠溶液中，这将中和所有酸。

中和酸后，我们要把它取出来，用去离子水清洗，然后用氮气干燥。所以现在我们已经完成了酸蚀。没有酸了，我脱掉了我的热袍。

我们要把它取出来，转移过来，在显微镜下观察。所以现在我们在显微镜下观察样品。这是在我们执行 ITO 蚀刻之后。

在这种情况下，较暗的区域是蚀刻掉 ITO 的玻璃区域。在这种情况下，较亮的区域是受光刻胶保护的 ITO。同样，这些是从 500 到 50 微米的阵列，在另一种情况下，我们每个阵列都有相互连接的千微米圆。

所以我们只是在显微镜下观察，我们看到有玻璃区域和 ITO 区域，但 ITO 区域受到光刻胶的保护。现在我们需要把这个光刻胶拿出来。因此，我们要做的就是取我们的底物，将其放入丙酮中，然后将其放入超声处理液中，超声处理 10 分钟。

这确保了所有光阻的去除，您可以单独用作音调，但通过声波打击，它使用声波进行打击，并确保光刻胶被正确去除。从声波空气中取出后，用去离子水清洗，再次用氮气干燥，现在您可以在玻璃基板上清楚地看到图案。这些是最初受光刻胶保护的图案。

现在我们已经查看了我们的样本并找到或制作了我们的 ITO 模式，我们将开始实验的第二阶段。该阶段涉及用自组装的 PEG cycline 单层对表面进行修饰。但在此之前，我们必须确保表面是反应性的。

为此，我们将其放入等离子清洁器中。这会在表面引入羟基，从而使其具有反应性。为此，我们只需将样品放入等离子清洗机中，然后打开真空泵即可。

我们打开氧气，打开主电源。这种能量用于将氧气转化为等离子体，然后引入等离子体，从而形成羟基槽。一旦我们打开电源，我们就可以继续并点击开始。

因此，现在该过程完成后，我们取出基材，将其存放在培养皿中，然后前往洁净室 de gown 继续下一步。所以现在我们已经走出了洁净室，完成了我们理想的图案，我们将用聚乙二醇、CYLIN 或 PEG Cylin 修改我们刚刚图案化的表面。要知道 peg cylin 对水分有反应是关键。

因此，我们使用的所有木材都必须是无水分的。我们在这里使用的玻璃器皿，宠物餐具，它们已经在 100 摄氏度的温度下烘烤了一夜。我们要用作溶剂的桶也是无水的。

它不含水分。所以现在我要把 tun、无水甲苯倒入这两个玻璃扬声器中，其中一个扬声器里有我们的样品。现在我们必须使用两个培养皿，因为其中一个是我们要进行修改的地方。

另一个我们稍后将在修改结束后使用，以实际清洗我们的基材。所以，在放入我们的玻璃披萨盘后，我打算把它接过来，然后转移到手套箱里的气闸室里。关闭气闸室后，我们将向气闸室中引入氮气。

现在这里的主室已经充满了氮气。因此，除非这个腔室充满氮气，否则我们不想打开它。一旦两个腔室都是氮气，我们将用移液管转移所有样品。

我们将有我们的钉子和镊子，我们稍后将用它来转移样品。所以我们要戴上手套，打开这里的腔室，慢慢地、小心地取出气闸里的所有东西，把它放在主腔室里。这是带有基质的培养皿和仅装有甲苯的培养皿，我们将用于洗涤。

存在的 pxi 是在氮气下包装的，除非您处于氮气环境中，否则不应打开此瓶子。因此，一旦你想取出样本，就把它放回袋子里。所以你取出你的圆柱形树脂，我们要使用的浓度是 2% 的甲苯。

所以你拿出来，放在高处，我们混合它。也要腔室并确保其充分混合，然后让样品在 Toin 中孵育两个小时。现在两个小时过去了，我们的样品已经在 Pxi 中了，我们将取出样品并将其转移到新的托因溶液中，在那里我们将短暂地清洗、旋转，然后将其移动到我们的气闸室。

一旦它进入我们的气闸室，我们只需打开我们的腔室，取出我们修改后的表面，我们就可以使用氮气枪驱动了。我们再次将其放入干净、干燥的培养皿中，然后将其放入 100 摄氏度的烤箱中再放置两个小时。现在，样品已经在烤箱中以 100°C 烘烤了两个小时，我们将取导线并将其连接到我们制备的电极上。

我们通过制作银环氧树脂和固化剂的一对一混合物来实现这一点。这就是银环氧树脂，现在我们向其中添加相同量的固化。我们想把它混合好，然后我们要拿它来连接我们的电线。

因此，我们将导线放在我们想要使用的电极上，然后对其进行编码。焊接在 ITO 上不起作用，因此我们必须使用银环氧树脂和固化剂。然后我们烘烤，以便去除我们之前使用的所有固化剂，它变硬，我们可以将其用作电极。

现在我们已经完成了两个阶段，我们将开始实验的第三阶段，即执行电化学部分。为此，我们将取一个样品并将其放入我们的电化学池中。将其放入我们的电化学电池后，我们只要在它上面放置一个 O 形圈。

这将隔离将要发生电化学的区域，然后我们只需密封电池。因此，我将连接导线的样品放入电化学池中。现在，我已准备好使用 potential stat 来施加电压。

所以，我将白线连接到参比电极，红色电极，反电极，最后是绿色电极，我将连接到我们的工作电极。连接完所有这些电极后，我只需将 1 x 磷酸盐缓冲盐水或 PBS 溶液添加到电化学本身中。现在澄清一下，它的工作方式是截至目前，整个表面都使用 pxi 进行了修改。

因此，所有电极，包括周围的玻璃区域，都用 pxi 修饰。一旦我在存在 ITO 的所有地方都施加电压，这就是我们所做的电极设计，钉岛将仅从这些表面脱落，周围区域不会受到影响。因此，我们选择性地从基材上去除 peg island。

所以现在我要按下播放键，它将启动并向我们的工作电极施加 1.4 伏的负电压。当施加电压时，您可以在电极上看到颜色发生变化。它从我们不得不变成棕色的透明蓝绿色发生了变化。

我们怀疑电极上可能发生了氧化反应，导致它们变成棕色。这也是 pxi 来自表面的指标之一，确实是从表面剥离出来的。再一次，无论你在哪里看到棕色，那就是 Peg Island 被移除的地方。

周围的玻璃区域仍然组装了 PXI。因此，我们施加负 1.4 瓦的电压，持续 60 秒。这提供了足够的时间来去除电极上存在的所有 pxi。

我们也可以使用这种方法来剥离单独寻址的电极。在本例中，有三行圆圈将被剥离。我们可以使用所有三种不同的电极来选择什么，我们想要剥离哪些。

所以现在我们已经成功完成了电化学的第三部分，我们已经从 ITO 电极中选择性地去除了 PG siling。我用 PBS 和 DI 水短暂清洗，去除导线，将样品放入普通的六孔板中。现在，我们将在这些电极上进行 On 和培养的细胞。

现在我们在组织培养室。在实验的最后阶段，我们今天将使用成纤维细胞，三个 T 3 细胞。我们用于接种细胞的浓度在 0.5 到 150 万个细胞/密耳之间。

接种细胞后，我们将细胞放到样品上约 20 分钟。这将使它有足够的时间将其连接到剥离区域。所以我们把它放在孵化器里。

所以现在已经 20 分钟了，我们准备好查看在 ITO 的剥离区域上形成图案的细胞，我们之前看到的棕色区域，它们只会特异性地结合到这些区域，不会附着在这些区域之外的任何位置。在这里，您可以看到棕色区域是去除了 pxi 的 ITO 区域。通过使用电化学，电池仅附着在这些棕色区域，而不是周围的玻璃区域。

在另一帧中，我们再次看到 seltz 附着在剥离区域。这些是棕色区域，但在这些棕色区域之上，您几乎看不到，ITO 设计 PEG 没有从这个 ITO 设计中剥离出来，因此没有细胞附着在上面。好了，就是这样。

我们已经完成了方案，细胞在 ITO 电极上有图案，这正是我们想要的。我刚刚向您展示了在微制造的光学透明氧化铟 10 氧化物电极上控制细胞粘附。今天，我向您展示了如何在这些电极上对 THREET 三个成纤维细胞进行图案化。

我们还使用相同的程序来模式 Hep G 两个细胞、卫星细胞和大鼠原代细胞。当前的单元图案化技术只允许在表面上组装两种单元类型。这种技术的灵活性将允许在表面上组装多种细胞类型，这些细胞类型将来在空间上是隔离的。

我们计划使用这种技术在 ITO 底物上空间分离三种不同的肝细胞类型，以模拟体内微环境。通过这样做，我们可以在空间上分离未成熟细胞或干细胞以及成熟细胞和支持细胞。这将为未成熟细胞的生长和分化创造一个指导性的环境。