共振与自发拉曼显微光谱中荧光背景的抑制

本实验的目的是构建一种全光学步态，该步态可透过拉曼散射光，同时抑制荧光信号。首先通过激发并极化拉曼散射实现这一目标。实验的第二步是准备泵浦光束以操作光学门。

第三，必须调整泵浦光、拉曼光和脉冲，使其相互重叠。该实验流程的最后一步是获取时间门控光谱。最终，通过分析具有高信噪比的拉曼信号，可以获得用于生化定量与分类的结果。

与现有方法（如通过软件去除荧光背景）相比，该技术的主要优势在于显著降低了荧光所产生的散粒噪声。该方法有助于解答生物与生物医学领域的关键问题，例如对细菌细胞和组织中内源性荧光物质的化学成分进行无创表征，利用内源性标记物研究细胞过程以及癌症、血管疾病或神经退行性疾病等疾病机制。该方法还可能促进新型探针的开发，这些探针对荧光和拉曼（RAM）标记均可适用，也可用于开发用于血液分析的无创医学传感器。

尽管该方法可为生物医学工程中的生物系统研究提供见解，但它也可应用于生物燃料、科研或电信产业等其他领域。生物样本通常置于载玻片上，该载玻片为一号厚度盖玻片，安装于 ATO Fluor 细胞培养腔内。

液体样品，特别是对人类有毒的样品，应置于小型玻璃瓶中，并用硅胶环氧树脂将盖玻片固定在瓶口。随后将样品瓶倒置，放置于显微镜载物台顶部的二级载物台上，该二级载物台具有独立的聚焦控制功能，以便采集时间门控拉曼光谱。首先，必须正确准备激发光束。激发光源采用输出功率为 2.4 瓦的可调谐脉冲式 GI 蓝宝石激光器。在 80 兆赫的脉冲序列中，每个脉冲的能量应为 30 纳焦，脉宽为 140 飞秒，光谱中心波长为 808 纳米，光谱带宽约为 6 纳米。为防止背向反射光重新进入激光谐振腔，光束应依次通过法拉第隔离器；在法拉第隔离器前放置半波片，以实现对进入系统总功率的连续调节。

由于六纳米的带宽太宽，无法分辨大多数拉曼模式，因此将光束通过一个极窄的带通滤光片，使其通过808纳米的波长。接下来，使用一个芳香双透镜将光聚焦到一个五毫米的β-硼酸钡晶体上。

八个晶体将波长从808纳米减半至404纳米。将β偏硼酸钡（BBO）晶体置于带有俯仰和倾斜调节装置的镜架中，并安装在平移台上。为了最大化波长转换效率，必须将晶体精确地对称放置于双胶合透镜的焦点处，并使其晶体轴与入射光束的偏振方向对齐。

由于波长转换效率依赖于偏振态，因此可在法拉第隔离器后放置第二块半波片，以控制照射到样品上的光量。通过旋转该半波片，可独立调节照射到样品上的光强，而不影响泵浦光束的光强。随后，波长转换后的光束由第二组芳香双胶合透镜重新准直，该透镜组的设计可确保激发光束足够大，以充满显微镜物镜的后光阑，并通过两个导向反射镜导入倒置显微镜中。

显微镜物镜用于定义光轴，以使激发光束与该光轴对准。在显微镜的样品平面放置一面反射镜。然后在观察连接至显微镜成像端口的CCD相机上反射回来的激光束的同时，迭代调节两个导向镜。

假设相机上的图像位于显微镜视场的中心，则光束处于光轴上。当焦点位于显微镜芯片中心时，沿Z轴移动物镜不会改变该位置。当样品置于样品平面并受到激光照射时，离焦光束的拉曼散射中心点即出现。

位于物镜下方的二向色滤光片用于分离发生波长偏移的拉曼散射光与激发光束，并将拉曼散射光引导至显微镜的侧端口。该显微镜经过改装，移除了此光路中的所有透镜，使得信号光能够从显微镜中射出，因为从显微镜射出的信号光束直径大于镜筒透光孔径。

使用由两组芳香双合透镜构成的0.47倍望远镜来缩小光束。信号光随后由一个Thompson偏振器进行偏振，该偏振器在实验室坐标系中相对于垂直方向取向为零度，并将光引导至二向色镜，在此处与泵浦光束重新合并。泵浦光束被导入一个由两个相互成直角放置的反射镜组成的延迟线，这两个反射镜均安装在可线性平移的平台上，可通过调节该平台以确保泵浦脉冲与信号脉冲在时间上重叠。

经过延迟线后，光束通过一个半透射板和一个相对于实验室坐标系垂直方向呈45度取向的偏振片。这可确保泵浦光束到达非线性介质时具有合适的偏振态。随后，光束被两片转向镜反射，其中一片带有压电控制装置，应利用该装置最终调节泵浦光束的位置，使其在空间上与信号光束完全重合。

为了获得这种重叠，需在两个位置观察泵浦光束和信号光束，一个位置靠近二向色镜，另一个位置远离该镜面。首先使用第一块转向镜在近端使两束光重叠，再通过压电镜在远端实现光束重叠，从而使泵浦光束与信号光束完全共线。接下来，应调整凹槽镜和收集系统，以最大化收集到的时间门控信号。为此，需先让泵浦光束和信号光束通过一个二向色滤光片，该滤光片在404纳米处具有六级光密度（OD6），用于阻止任何残余的激发光在非线性介质中产生激发或散射。

然后，泵浦光束和信号光束通过一个芳香族双胶合透镜聚焦，进入一个光程长度为一厘米的石英池，池中包含非线性材料；任何具有足够高的非线性折射率和足够短的时间响应特性的非线性材料均可在此使用。在本实验中，我们采用二硫化碳。随后，光束由第二个双胶合透镜重新准直，该透镜的焦距与第一个透镜相同。

然后将光束通过安装在旋转支架上的格兰-汤普森偏振分析器，再经过一组吸收滤光片和干涉滤光片，该组合滤光片在808纳米处的光密度（OD）为10。最后，信号光由一个芳香双胶合透镜聚焦进入一根50微米的多模光纤中，该光纤安装在一个可在X、Y和Z方向平移的载物台上。随后将光纤耦合至一台配有CCD相机的商用成像光谱仪，用于校准收集系统以最大化采集信号：首先将分析器设为零度，在样品平面放置甲苯测试样品，通过调节光纤支架的X、Y和Z控制旋钮优化采集到的拉曼信号，确保泵浦光与信号光在空间和时间上实现良好重叠。最后在显微镜的样品平面放置一面反射镜。

然后从系统中移除404纳米滤光片。将检偏器旋转至90度，使后向反射的404纳米光束进入光谱仪，并调节其强度，确保不使相机饱和。现在关闭泵浦光束，旋转检偏器以最小化透射的404纳米信号。

然后重新打开泵浦光束，并缓慢调节延迟台，直到404纳米光的透射开始增强。接下来，通过反复调节延迟台、压电镜以及光纤的X、Y和Z控制，以最大化信号强度，因为后向反射的404纳米光束与拉曼散射光在系统中可能经过略微不同的光路。最后，将一种强拉曼散射样品（如甲苯）放置在样品台上，替换拉曼滤光片，并通过微调延迟台、压电镜以及光纤的X、Y和Z控制，进一步优化拉曼信号，完成最终对准。

现在系统已准备就绪，可以开始采集光谱。首先需要获取多条背景曲线，以校正系统伪影。第一步，将分析器设置为零度，打开激发光束，关闭泵浦光束。

获取未加栅格的光谱，然后将检偏器设置为90度，采集代表杂散光透过偏振片的背景光谱。接着，在检偏器保持90度不变的情况下，关闭拉曼光束，打开泵浦光束，采集第二组背景光谱，代表泵浦光透过二向色滤光片的泄漏量。

最后，在关闭所有激光器后，采集代表相机和电子设备暗电流水平的基线暗光谱。然后打开所有光束，采集门控光谱。为了获得仅通过门控的光的真实光谱，必须从该门控光谱中减去两个背景光谱和暗光谱。

此处展示了瓦楞系统的示意图。泵浦光束的光路以实心红色线表示，二次谐波生成（SHG）光路以实心深蓝色线表示，拉曼和荧光重叠的光路以绿色表示。

荧光被暂时滤除的光路以黄色显示。此处显示的是溶于浸油中的香豆素的原始光谱。红色曲线表示在门控打开时采集的光谱，黑色曲线表示在分析器调整至最小透射率并施加泵浦光束时采集的光谱。

蓝色曲线显示的是在分析器调至最小透射率且未施加泵浦光束时测得的光谱，绿色曲线显示的是仅施加泵浦光束时测得的光谱。所有光谱均使用11点三阶KY高勒滤波器进行了平滑处理。虚线品红色线条标出了下一张图中所示的光谱范围。

此处显示了香豆素溶解在浸油中并扣除荧光背景后的光谱。红色曲线为门控常开时的光谱，蓝色曲线为门控光谱。门控光谱清晰地显示出油类物质特有的高波数卷积峰。

在尝试此操作时，重要的是要记住，激光器必须首先具备足够的脉冲能量来驱动气体，并且系统需要两个脉冲在空间和时间上实现精确重叠。观看本视频并阅读附带的实验方案后，您应能充分理解如何将激光束分离为激发光束和探测光束，以及如何在空间和时间上使这两束光实现重叠。

如何通过光谱仪记录拉曼信号以及C、c、D，并进一步可视化和分析拉曼信号。请注意，使用激光器可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，必须采取佩戴激光防护眼镜等安全防护措施。此外，使用非线性材料及特定样品时还需遵守相应的其他安全规定。