波谱与自发拉曼显微荧光背景的抑制

我们讨论一个复杂的非线性光学系统，采用超快全光开关，隔离荧光信号的拉曼的建设和运营。使用这个系统，我们能够成功地分离的拉曼光谱和荧光信号，利用脉冲能量和平均的权力，保持生物安全。

该程序的目的是构建一种全光学步态，该步态通过拉曼散射光，同时拒绝荧光信号。这是通过首先激发和极化拉曼散射来实现的。程序的第二步是准备泵梁以作闸门。

第三，必须调整泵、柱塞和脉冲，使其重叠。该过程的最后一步是获取时间门控光谱。最终，通过分析具有高信噪比的拉面信号，可以获得显示生化定量和分类的结果。

与现有方法（例如软件去除荧光背景）相比，该技术的主要优点是荧光产生的散粒噪声显著降低。该方法可以帮助回答生物和生物医学领域的关键问题，例如细菌细胞和组织中内源性氟化学成分的非侵入性表征，通过使用内在标志物了解细胞过程和疾病，如癌症、血管或神经退行性疾病。这种方法还可能有助于开发可用作荧光和 RAM 标记的新探针，以及用于血液分析的非侵入性医疗传感器。

虽然这种方法可以为生物医学工程提供对生物系统的见解。它还可以应用于其他领域，例如生物燃料、研究或电信行业。生物样品通常放置在安装在 ATO Fluor 细胞室中的一号厚度盖玻片上。

液体样品，尤其是对人体有毒的液体样品，被放置在一个小玻璃瓶中，盖玻片通过硅树脂粘在开口上，然后将其倒置进行测量将样品放在安装在显微镜载物台顶部的二级载物台上，该载物台具有自己独立的聚焦控制，以便拍摄时间门控拉面光谱， 首先，必须适当准备激发光束。从 2.4 瓦可调谐脉冲 GI 蓝宝石激光器发出的光开始。80 兆赫兹脉冲序列中的每个脉冲应具有 30 纳焦耳的能量，时间宽度为 140 飞秒，光谱以 808 纳米为中心，光谱带宽约为 6 纳米，以防止背向反射重新进入激光腔，光应通过法拉第隔离器位置，法拉第隔离器之前的半波板，以允许连续调谐发送到系统。

由于 6 纳米的带宽太宽，无法分辨大多数拉面模式，因此光束通过非常窄的带通滤光片发送。以 808 纳米发送。接下来，使用芳香族双合透镜将光线聚焦到 5 毫米的 β 钡孔上。

8 个晶体到 808 纳米到 404 纳米波长的一半。将 β 钡 bate 晶体放在一个支架中，并在平移台上安装有倾斜和倾斜控件。为了最大限度地提高波长转换的效率，晶体必须围绕双合透镜的焦点精确对称放置，并且其晶体轴与入射光束的偏振对齐。

由于波长转换的效率取决于偏振，因此可以通过在法拉第隔离器之后放置第二个半波板来控制发送到样品的光量。通过旋转该波片，可以独立于泵束中发送的强度来调整发送到样品的光强度。然后，波长转换后的光被选择的第二个芳香双合透镜重新准直，使得激发光束足够大，足以填满显微镜物镜的后孔，并通过两个转向镜引导到倒置显微镜中。

显微镜物镜定义光轴，以将激发光束对准该轴。在显微镜的样品平面上放置一面镜子。然后，在连接到显微镜成像端口的 CCD 相机上观察背反射激光束的同时，对两个转向镜进行迭代调谐。

假设相机上的图像以显微镜的视场为中心，则光束在轴上。当焦点以显微镜芯片为中心时，物镜沿 Z 轴的平移不会改变。当样品放置在样品平面上并用激光照射时，就会出现散焦光束拉面散射的中心点。

放置在显微镜物镜下方的二向色滤光片可分离波移。来自激发光束的拉面散射光将拉面散射光引导至显微镜的侧端口。显微镜已经过修改，以去除该路径内的任何透镜，因此信号光从显微镜中发出时被镀膜，因为从显微镜发出的信号光束大于腺体的通光孔径。

汤普森偏振器是一种由两个芳香双合透镜构成的 0.47 倍望远镜，用于缩小光束。然后，信号光由实验室框架中相对于垂直方向为零度的压盖汤普森偏振器进行偏振，并指向二向色镜，在那里它与泵光束重新结合。泵浦光束被发送到延迟线中，该延迟线由两个彼此成直角的镜子组成，这两个镜子都放置在一个线性平移台上，该平移台可以调谐以确保泵浦和信号脉冲的时间重叠。

在延迟块之后，光束通过实验室框架中相对于垂直方向成 45 度的中板和偏振器。这确保了泵梁在到达非线性介质时处于适当的极化状态。然后，光线从两个转向镜反射，一个带有压电控制，最终用于调整泵浦光束的位置，使其在空间上与信号光束重叠。

为了获得这种重叠，在两个位置观察泵浦和信号光束，一个靠近二向色镜，一个远离二向色镜，通过使用第一个转向镜在近点重叠两个光束，使用压电镜在远点重叠光束，泵浦光束可以与信号光束完全共线。接下来，应设置瓦楞纸和收集系统，以最大限度地利用收集的时间门控信号。为此，泵浦和信号光束首先通过一个双滤光片，该滤光片在 404 纳米处的外径为 6，以防止任何残余激发光在非线性介质中激发和散射。

然后，泵浦和信号光束通过芳香族双合透镜聚焦到包含非线性材料的一厘米路径长度的石英中，可以使用任何具有适当高非线性指数和适当短时间响应的非线性材料。这里。对于这些实验，我们使用二硫化碳。然后，光由第二个双合透镜重新准直，其焦距与第一个双合透镜相同。

然后，光束通过旋转支架上的压盖汤普森分析仪，然后通过一组吸收和干涉滤光片，这些滤光片在 808 纳米处的外径为 10。最后，信号光通过芳香族双合透镜聚焦到 50 微米多模光纤中，光纤安装在允许 X、Y 和 Z 方向平移的舞台上，然后将光纤耦合到带有 CCD 相机的商用成像光谱仪上，以对准收集系统以最大化收集的信号， 将分析仪设置为零度，将甲苯测试样品置于样品平面上，通过调整光纤支架的 X、Y 和 Z 控件来优化收集的拉曼信号，以确保泵浦和信号束的适当空间和时间重叠。在显微镜的样品平面上放置一面镜子。

然后从系统中取出 404 纳米滤光片。将分析仪旋转 90 度，以便将逆向反射的 404 纳米光束发送到光谱仪，并调整强度，使其不会使相机饱和。现在关闭泵浦光束，旋转分析仪以最小化传输的 404 纳米信号。

然后重新打开泵浦光束并缓慢调整延迟级，直到 404 纳米光的透射率开始增加。接下来迭代转动延迟级、压电镜以及光纤的 X、Y 和 Z 控件，以最大化信号，因为逆向反射的 404 纳米光束和拉曼散射光在系统中的路径可能略有不同。通过在样品台上放置一个强拉曼散射体（如甲苯）进行最终调整，更换拉曼滤光片，并通过更改延迟台压电镜以及光纤的 X、Y 和 Z 控件来略微调整对准，以优化拉曼信号。

现在系统已准备好收集光谱。这首先需要采集多条背景曲线来校正系统伪影。首先，将分析仪设置为零度，打开激发光束，关闭泵浦光束。

获得一个未分配的光谱，然后将分析仪设置为 90 度并收集代表通过偏振器泄漏的杂散光的背景光谱。接下来，在分析仪保持 90 度的情况下，关闭拉面梁并打开泵梁。收集第二个背景光谱，表示通过二向色滤光片泄漏的泵光量。

最后，在所有激光器关闭的情况下，收集代表相机和电子设备的暗电流水平的基线暗光谱。最后，打开所有光束并收集门控光谱。为了获得通过门控的光的真实光谱，必须从这个门控光谱中减去两个背景光谱和暗光谱。

在这里，我们看到瓦楞系统的示意图。泵浦光束路径显示为红色实线，而 SHG 路径显示为海军实线。拉面和荧光重叠的路径显示为绿色。

而荧光被暂时过滤掉的路径显示为黄色。在这里，我们看到了溶解在浸泡油中的香豆素的原始光谱。红色曲线表示闸门保持打开状态时采集的谱图，黑色曲线表示将分析仪对准以实现最小透射率并施加泵浦光束时采集的谱图。

蓝色曲线显示了分析仪对准最小透射率且未应用泵浦光束时获得的光谱，绿色曲线显示了仅应用泵浦光束时获得的光谱。所有光谱都使用 11 点三阶 KY gole 滤波器进行平滑处理。洋红色虚线表示下图所示的光谱区域。

在这里，我们看到扣除荧光背景后香豆素溶解在浸油中的光谱。红色曲线是门保持打开状态的光谱，蓝色曲线是门控光谱。门控光谱清楚地显示了油的复杂高波数、峰值特性。

在尝试此过程时，重要的是要记住，激光器必须首先具有足够的脉冲能量来驱动 ga，并且系统需要两个脉冲的精细空间和时间重叠。观看此视频并阅读随附的协议后，您应该对如何将激光束分成激发光束和曲线光束有很好的了解。如何在空间和时间上重叠这两个光束。

如何通过光谱仪和 C、c、D 记录拉面信号，以及如何可视化和分析拉面信号。不要忘记，使用激光工作可能非常危险，因此在尝试此过程时应始终采取预防措施，例如佩戴激光护目镜。其他安全规则适用于非线性材料的使用和特定样品的使用。