Name: 波谱与自发拉曼显微荧光背景的抑制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 4 s
Description: 学习构建超快全光开关系统，用于分离拉曼信号与荧光背景，实现高信噪比的生化定量分析。该方法适用于生物物理学研究及活体样本检测。

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本工作由美国国家科学基金会（NSF）资助项目 DBI 0852891 支持。部分工作还由生物光子学科学与技术中心资助，该中心是美国国家科学基金会指定的科学与技术中心，由加州大学戴维斯分校根据合作协议编号 PHY0120999 进行管理。

1. 在此系统中制备和放置拉曼样品时需格外小心。
<ol>
	<li>由于该系统通常使用数值孔径极高且工作距离极短的物镜，因此样品需置于盖玻片上。生物样品通常放置在艾托荧光细胞培养皿（Attofluor cell chamber，Invitrogen，Carlsbad，CA）中编号为1的盖玻片上。</li>
 <li>液体样品，特别是对人类具有毒性的样品，应置于小型玻璃瓶中，并用硅酮环氧树脂将盖玻片密封在瓶口。测量时将瓶子倒置。</li>
 <li>由于本系统依赖于泵浦光与信号光脉冲的精确时序控制，因此不能使用显微镜传统的调焦方式，即上下移动物镜，因为这会改变系统的光程。取而代之的是，我们将样品置于安装在显微镜载物台顶部的二级载物台上，该二级载物台具有独立的调焦控制功能。</li>
</ol>


2. 为了获取时间门控拉曼光谱，必须对激发光束进行适当准备。
<ol> 
 
 <li>我们从一台 2.4 W 可调谐脉冲钛宝石激光器（Chameleon，Coherent Systems，Santa Clara，CA）输出的光开始。在 80 MHz 的脉冲序列中，每个脉冲的能量为 30 nJ，脉宽为 140 fs，光谱中心位于 808 nm，光谱带宽约为 ~6 nm。</li>
 <li>为防止背向反射光重新进入激光谐振腔，光束需通过一个法拉第隔离器。在法拉第隔离器前放置一个半波片，可连续调节进入系统的总功率。</li>
 <li>由于 6 nm 的带宽过宽，无法分辨大多数拉曼模式，因此将光束通过一个极窄的带通滤光片（中心波长 808 nm，半高全宽 0.8 nm，Andover Corporation，Salem，NH）。</li>
 <li>随后，光束由一个消色差双胶合透镜（f = 100 mm）聚焦至一块 5 mm 长的 β-硼酸钡（BBO）晶体（CASIX，中国福建省福州市）上，使波长从 808 nm 减半至 404 nm。BBO 晶体安装在一个具有俯仰和倾斜调节功能的支架上，并固定于平移台。为最大化波长转换效率，晶体必须精确对称地放置在双胶合透镜的焦点处，且其晶体轴需与入射光束的偏振方向对齐。</li>
 <li>由于波长转换效率依赖于偏振态，可在法拉第隔离器后放置第二个半波片，以控制照射到样品上的光强。通过旋转该波片，可独立调节照射到样品上的光强，而不影响泵浦光束的强度（下文将讨论）。</li>
 <li>波长转换后的光束由第二个消色差双胶合透镜（f = 500 mm）重新准直，选择该透镜以确保出射光束足够大，能够充满显微镜物镜的后光瞳，并通过两个转向镜导入倒置显微镜（IX-71，Olympus，Center Valley，PA）。</li>
 <li>显微镜物镜作为系统中最整体化组件内的光学元件，定义了光轴。为将激发光束对准该光轴，需在显微镜的样品平面放置一面反射镜。通过显微镜成像端口连接的 CCD 相机（μEye，IDS，Obersulm，德国）观察背向反射的激光光束，迭代调节两个转向镜。假设相机上的图像位于显微镜视场中心，则当焦点位于显微镜芯片中心，且沿 z 轴平移物镜时离焦光束的中心点不变时，光束即与光轴对齐。</li>
 <li>当样品置于样品平面并受到激光照射时，发生拉曼散射。在显微镜物镜下方放置一个二向色镜，将发生波长偏移的拉曼散射光（以及荧光）与激发光束分离，并将拉曼散射光导向显微镜的侧端口。该显微镜已改装，移除了该光路中的所有透镜，使信号光以准直状态从显微镜出射。</li>
 <li>由于从显微镜出射的信号光束直径大于 Glan-Thompson 偏振器的通光孔径，因此使用一个由两个消色差双胶合透镜（f1 = 75 mm，f2 = 35 mm）构成的 0.47 倍望远镜来缩小光束。</li>
 <li>信号光随后通过一个在实验室坐标系中相对于垂直方向取向为 0° 的 Glan-Thompson 偏振器进行偏振化，并被导向一个二向色镜，在此处与泵浦光束重新合并。</li>
</ol>
为了使光学门以最高效率运行，还必须仔细制备泵浦光束（克尔光束）。

<ol>
	<li>泵浦光脉冲首先通过一个由两个消色差双合透镜（f1 = 35 mm，f2 = 100 mm）构成的望远镜系统进行 0.35 倍扩束，以匹配信号光束的最终尺寸。</li>
 <li>随后，泵浦光束进入一个延迟线，该延迟线由一个安装在直线平移台上的直角棱镜组成，可通过调节平移台确保泵浦脉冲与信号脉冲在时间上重合（具体调谐方法将在下文讨论）。</li>
 <li>经过延迟线后，光束通过一个半波片和一个相对于实验室坐标系垂直方向呈 45° 方向放置的偏振片。这可确保泵浦光束到达非线性介质时具有合适的偏振态。</li>
 <li>随后，光束经由两个导向镜反射，其中一个配备压电控制装置，用于微调泵浦光束的位置，使其在空间上与信号光束完全重叠。通过在两个位置——一个靠近、一个远离用于合束的二向色镜——分别观察泵浦光束和信号光束的重合情况，可实现精确对准：利用第一个导向镜使两束光在近点重合，再通过压电控制的导向镜使它们在远点重合，从而确保泵浦光束与信号光束完全共线。</li>
 <li>在两束光实现合束后，设置克尔门（Kerr gate）和收集系统，以最大化采集到的时间门控信号。</li>
</ol>
4. 当两束光合并后，设置克尔门控和收集系统以最大化收集到的时间门控信号。
<ol> 
 <li>首先将泵浦光束和信号光束通过一个在 404 nm 处具有 6 个光密度（OD）的二向色滤光片，以防止任何残余的激发光在非线性介质中引发拉曼散射。</li>
 <li>随后，泵浦光束和信号光束均由一个消色差双胶合透镜（焦距 f = 35 mm）聚焦，进入一个长度为 1 cm 的石英比色皿，其中装有非线性材料。任何具有足够高非线性折射率（高于 CS2）和足够短时间响应（&lt;2 ps）的非线性材料均可用于此。在本实验中，我们使用二硫化碳（CS2），其非线性折射率 n2 = 3.1 × 10−18 m2/W。之后，光束由第二个与第一个焦距相同的双胶合透镜重新准直。</li>
 <li>光束随后通过安装在旋转支架上的格兰-汤普森偏振分析器，再通过一组吸收滤光片和干涉滤光片，这些滤光片在 808 nm 处的总光密度（OD）为 10。</li>
 <li>最后，信号光由一个消色差双胶合透镜（焦距 f = 35 mm）聚焦进入一根 50 μm 的多模光纤，该光纤安装在一个可在 x、y 和 z 方向上平移的平台上。光纤随后连接至一台商用成像光谱仪，并配备 CCD 相机（分别为 SP2300i 和 Pixis 100B，均由美国新泽西州普林斯顿仪器公司制造）。</li>
 <li>为对准收集系统以最大化收集到的信号，将分析器设置为 0°，并在样品平面放置甲苯测试样品。通过调节光纤支架的 x、y 和 z 控制旋钮，优化收集到的拉曼信号。</li>
 <li>为确保泵浦光束与信号光束在空间和时间上的正确重叠，将一面反射镜置于显微镜的样品平面。从系统中移除 404 nm 滤光片。将分析器旋转至 90°，使后向反射的 404 nm 光束进入光谱仪，并调节其强度以避免相机饱和。在关闭泵浦光束的情况下，旋转分析器以最小化透射的 404 nm 信号。随后打开泵浦光束，缓慢调节延迟台，直至 404 nm 光的透射开始增强。然后通过反复调节延迟台、压电反射镜以及光纤的 x、y 和 z 控制，使信号达到最大。</li>
 <li>由于后向反射的 404 nm 光束与拉曼散射光在系统中可能经过略微不同的路径，因此需将一种强拉曼散射样品（如甲苯）置于样品台上，通过微调延迟台、压电反射镜以及光纤的 x、y 和 z 控制，进一步优化拉曼信号，完成最终的对准调整。</li>
</ol>

5. 采集单个时间门控拉曼光谱需要获取多个光谱以校正系统伪影。

<ol>
	<li>将检偏器设置为 0°，打开激发光束并关闭泵浦光束，采集“未时间门控”光谱，该光谱代表未使用时间门控系统时所获得的光谱。</li>
 <li>将检偏器设置为 90°，同时关闭激发光束和泵浦光束，采集背景光谱，该光谱代表系统中偏振片及其他元件泄漏的杂散光强度。</li>
 <li>保持检偏器在 90° 位置，打开激发光束和泵浦光束，采集“时间门控”光谱，该光谱代表由于泵浦光束的存在，拉曼散射光通过交叉偏振片后被允许通过的信号。</li>
 <li>最后，保持检偏器仍处于 90° 位置，关闭激发光束但打开泵浦光束，采集第二个背景光谱，该光谱代表进入光谱仪的残余 808 nm 光对“时间门控”光谱的贡献。</li>
 <li>此外，关闭所有激光器后采集一个光谱，用于表征相机和电子设备的基线“暗”信号水平。</li>
 <li>由于光谱采集通常需要较长的积分时间，必须将总积分时间分割为多个片段（帧），以便对宇宙射线进行有效校正——这是在数分钟时间跨度内采集数据时常见的问题。</li>
</ol>
6. 数据采集后，进行若干处理步骤有助于提升数据的质量和呈现效果。
<ol>
	<li>首先，通过从所有光谱中减去“暗”光谱来完成暗背景校正。</li>
 <li>为了校正宇宙射线干扰，将构成一次采集的多个帧在像素基础上逐一对比。对于任意帧中偏离所有帧对应像素中位数超过2个中位数偏差的像素，其像素值将被该像素在所有帧中的中位数值所替代。</li>
 <li>经宇宙射线校正后的帧随后通过Savitzky-Golay滤波器1进行平均和光滑处理。</li>
 <li>为了提取“真实”的门控光谱，我们从测得的门控光谱中减去“仅激发”和“仅泵浦”光谱。</li>
 <li>最后，门控和非门控光谱通过减去一个5th-阶多项式进行背景校正，该多项式采用Lieber和Mahadevan-Jansen2提出的方法确定。</li>
</ol>
7. 代表性结果：
<img src="/files/ftp_upload/2592/2592fig1.jpg" alt="超快激光光谱示意图；光路、SHG、拉曼过程、压电驱动镜设置。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1">
 图 1. 克尔门控系统的示意图。泵浦光束路径以红色表示，SHG 路径以蓝色表示。拉曼和荧光重叠的路径以绿色表示，而荧光被时间滤除后的路径以黄色表示。缩写如下：BPF，带通滤光片；CCD，电荷耦合器件；DCM，二向色镜；FI，法拉第隔离器；λ/2，半波片；LPF，长波通滤光片；NLM，非线性介质；P，偏振片；SHG，二次谐波产生晶体。
<img src="/files/ftp_upload/2592/2592fig2.jpg" alt="拉曼光谱结果；强度与相对波数的关系；门控光谱分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 上图：香豆素溶解在浸油中的原始光谱。红色曲线表示门控打开时测得的光谱（检偏器设置为最大透射）。黑色曲线表示检偏器调整至最小透射并施加泵浦光束时测得的光谱（门控光谱）。蓝色曲线表示检偏器调整至最小透射但未施加泵浦光束时测得的光谱（门控关闭）。绿色曲线表示仅施加泵浦光束时测得的光谱。虚线品红色线表示下方面板中显示的光谱区域。所有光谱均使用11点、3阶Savitzky-Golay滤波器进行了平滑处理。下图：香豆素溶解在浸油中并扣除荧光背景后的光谱。红色曲线为门控打开时的光谱，蓝色曲线为门控光谱。门控光谱清晰地显示出油类物质特有的重叠高波数峰。

<ol><li>Savitzky, A., Golay, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smoothing+and+differentiation+of+data+by+simplified+least+squares+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures.</a> Analytical Chemistry. 36, 1627-1639 (1964).</li>
<li>Lieber, C. A., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+method+for+subtraction+of+fluorescence+from+biological+Raman+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Automated method for subtraction of fluorescence from biological Raman spectra.</a> Applied Spectroscopy. 57, 1363-1367 (2003).</li>
<li>Gniadecka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+diagnosis+by+Raman+spectroscopy+and+neural+networks%3A+Structure+alterations+in+proteins+and+lipids+in+intact+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investiga-tive+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Melanoma diagnosis by Raman spectroscopy and neural networks: Structure alterations in proteins and lipids in intact cancer tissue.</a> Journal of Investiga-tive Dermatology. 122, 443-449 (2004).</li>
<li>Lieber, C. A., Majumder, S. K., Billheimer, D., Ellis, D. L., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+microspectroscopy+for+skin+cancer+detection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Raman microspectroscopy for skin cancer detection in vitro.</a> Journal of Biomedical Optics. 13, 024013-024013 (2008).</li>
<li>Chen, K., Qin, Y., Zheng, F., Sun, M., Shi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+colorectal+cancer+using+Raman+spectroscopy+of+laser-trapped+single+living+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of colorectal cancer using Raman spectroscopy of laser-trapped single living epithelial cells.</a> Optics Letters. 31, 2015-2017 (2006).</li>
<li>Chan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondestructive+identification+of+individual+leukemia+cells+by+laser+trapping+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nondestructive identification of individual leukemia cells by laser trapping Raman spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 80, 2180-2187 (2008).</li>
<li>Zhu, Q. Y., Quivey, R. G., Berger, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+bacterial+concentration+fractions+in+polymicrobial+mixtures+by+Raman+microspectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Measurement of bacterial concentration fractions in polymicrobial mixtures by Raman microspectroscopy.</a> Journal of Biomedical Optics. 9, 1182-1186 (2004).</li>
<li>Rösch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxonomic+identification+of+single+bacteria+by+micro-Raman+spectroscopy%3A+Application+to+clean-room-relevant+biological+contaminations%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Chemotaxonomic identification of single bacteria by micro-Raman spectroscopy: Application to clean-room-relevant biological contaminations.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 1626-1637 (2005).</li>
<li>Moritz, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopic+signatures+of+the+metabolic+states+of+escherichia+coli+cells+and+their+dependence+on+antibiotics+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopic signatures of the metabolic states of escherichia coli cells and their dependence on antibiotics treatment.</a> Biophysical Journal. 98, 742a-742a (2010).</li>
<li>Dehring, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+chemical+changes+in+subchondral+bone+taken+from+murine+knee+joints+using+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Identifying chemical changes in subchondral bone taken from murine knee joints using Raman spectroscopy.</a> Applied Spectroscopy. 60, 1134-1141 (2006).</li>
<li>Berger, A. J., Koo, T. W., Itzkan, I., Horowitz, G., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicomponent+blood+analysis+by+near-infrared+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Multicomponent blood analysis by near-infrared Raman spectroscopy.</a> Applied Optics. 38, 2916-2926 (1999).</li>
<li>Qi, D., Berger, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+concentration+measurement+in+blood+serum+and+urine+samples+using+liquid-core+optical+fiber+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Chemical concentration measurement in blood serum and urine samples using liquid-core optical fiber Raman spectroscopy.</a> Applied Spectroscopy. 46, 1726-1734 (2007).</li>
<li>Beier, B. D., Berger, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+automated+background+subtraction+from+Raman+spectra+containing+known+contaminants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Method for automated background subtraction from Raman spectra containing known contaminants.</a> The Analyst. 134, 1198-1202 (2009).</li>
<li>De Luca, A. C., Mazilu, M., Riches, A., Herrington, C. S., Dholakia, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+fluorescence+suppression+in+modulated+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Online fluorescence suppression in modulated Raman spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 82, 738-745 (2010).</li>
<li>Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+imaging+of+tissue+in+vivo+with+video-rate+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 16807-16812 (2005).</li>
<li>Jones, W. J., Stoiche, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+raman+spectra%3A+Induced+absorption+at+optical+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Inverse raman spectra: Induced absorption at optical frequencies.</a> Physical Review Letters. 13, 657-659 (1964).</li>
<li>Freudiger, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+et+Imaging+with+High+Sensitivity+by+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Label-Free et Imaging with High Sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Science. 322, 1857-1861 (2008).</li>
<li>Cui, M., Bachler, B. R., Ogilvie, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+coherent+and+spontaneous+Raman+scattering+under+biological+imaging+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Comparing coherent and spontaneous Raman scattering under biological imaging conditions.</a> Optics Letters. 34, 773-775 (2009).</li>
<li>Matousek, P., Towrie, M., Stanley, A., Parker, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+rejection+of+fluorescence+from+Raman+spectra+using+picosecond+Kerr+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Efficient rejection of fluorescence from Raman spectra using picosecond Kerr gating.</a> Applied Spectroscopy. 53, 1485-1489 (1999).</li>
<li>Matousek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+suppression+in+resonance+Raman+spectroscopy+using+a+high-performance+picosecond+Kerr+gate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Raman+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Fluorescence suppression in resonance Raman spectroscopy using a high-performance picosecond Kerr gate.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 32, 983-988 (2001).</li>
<li>Knorr, F., Smith, Z. J., Wachsmann-Hogiu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+time-gated+system+for+Raman+spectroscopy+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Development of a time-gated system for Raman spectroscopy of biological samples.</a> Optics Express. 18, 20049-20058 (2010).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

近年来，生物医学拉曼光谱学领域因其在解决生物诊断中若干难题方面所展现出的潜力而受到越来越多的关注。例如，拉曼光谱已被证明在癌症检测中具有诊断价值3, 4, 5, 6。拉曼光谱技术还被用于细菌定量7, 8和细菌药物反应分析9。此外，该技术已广泛应用于其他多种生物医学领域，从骨骼健康10到生物流体分析11, 12均有涉及。
然而，尽管拉曼光谱具有如此巨大的潜力，但在大多数生物系统中仍存在一个巨大的应用障碍：其极弱的散射截面。因此，拉曼信号极易被即使较弱的荧光背景所掩盖。目前已有多种技术用于去除荧光谱形2, 13, 14。然而，这些技术均未能真正解决强荧光背景下的核心问题：荧光背景引入的散粒噪声会完全淹没拉曼信号，且无法通过减法消除。为增强拉曼信号强度，已发展出若干技术，例如相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和受激拉曼散射（或称逆拉曼散射）15, 16, 17。然而，这些技术主要适用于透明样品，且在化学灵敏度方面存在各自的背景干扰和其他...

<table><tbody><tr><td>透镜</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>Various</td><td>所有透镜均镀膜，以确保每个透镜的最大透射损耗为1%</td></tr><tr><td>可调谐钛宝石激光器</td><td>Coherent Inc.</td><td>Chameleon</td><td>30 nJ, 200 fs, 80 MHz</td></tr><tr><td>40倍油浸物镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>UApo/340</td><td>NA = 1.35</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX-71</td><td>经改装以移除侧端口中的所有透镜</td></tr><tr><td>半波片</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>AHWP05M-600</td><td></td></tr><tr><td>格兰-汤普森偏振器</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>GTH10M</td><td>&amp;#8764;10% 透射损耗</td></tr><tr><td>光谱仪</td><td>Princeton Instruments/Acton</td><td>SP2300i</td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>Princeton Instruments/Acton</td><td>Pixis 100B</td><td></td></tr><tr><td>数学软件</td><td>Mathworks</td><td>MATLAB</td><td>版本 2008a</td></tr><tr><td>法拉第隔离器</td><td>EOT</td><td>BB8-5I</td><td></td></tr><tr><td>压电驱动反射镜</td><td>Newport Corp.</td><td>AG-M100</td><td></td></tr><tr><td>BBO 晶体</td><td>CASIX</td><td>custom</td><td>厚度 1 mm</td></tr><tr><td>带通滤光片 1</td><td>Andover</td><td>008FC14</td><td>808 &amp;#177; 0.4 nm</td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>Semrock</td><td>FF662-FDI01</td><td>截止波长 662 nm</td></tr><tr><td>长通滤光片</td><td>Semrock</td><td>BLP01-405R</td><td>截止波长 417 nm</td></tr><tr><td>带通滤光片 2</td><td>Semrock</td><td>FF02-447/60</td><td>417–447 nm</td></tr><tr><td>CS&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>335266</td><td>纯度 99%</td></tr><tr><td>香豆素 30</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>546127</td><td>纯度 99%</td></tr><tr><td>浸油</td><td>Cargill Labs</td><td>16242</td><td>型号 DF</td></tr></tbody></table>

共振与自发拉曼显微光谱中荧光背景的抑制

Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

拉曼光谱常常受到强烈荧光背景的干扰，尤其是对于生物样品而言。如果使用一串超快脉冲激发样品，通过能够在皮秒时间尺度上对光谱重叠信号进行时间分辨的系统，即可将及时到达的拉曼散射光与延迟到达的荧光光分离。本文讨论了一种复杂的非线性光学系统的构建与操作，该系统采用低功率光学克尔门形式的全光开关，以分离拉曼信号与荧光信号。系统使用单一的808 nm激光器，平均功率为2.4 W，重复频率为80 MHz；该激光束被分束后，约200 mW的808 nm光被转换为&lt; 5 mW的404 nm光并照射到样品上，用于激发拉曼散射。剩余未转换的808 nm光则被导入非线性介质，作为全光快门的泵浦光。该快门的开关时间为800 fs，峰值效率约为5%。利用此系统，我们能够在80 MHz的重复频率下，使用保持在生物安全范围内的脉冲能量和平均功率，成功分离拉曼信号与荧光信号。由于系统在光学功率方面无冗余余量，我们详细说明了若干有助于最大化系统通量的设计与准直考虑因素。我们还介绍了在克尔介质内实现信号光与泵浦光空间和时间重叠的操作流程，以及光谱采集的详细步骤。最后，我们报告了使用该时间门控系统在强荧光背景下成功获取的若干代表性拉曼光谱结果。

我们讨论一种复杂的非线性光学系统的构建与运行，该系统利用超快全光开关来分离拉曼信号与荧光信号。通过该系统，我们能够利用保持在生物安全范围内的脉冲能量和平均功率，成功分离拉曼信号和荧光信号。

拉曼光谱常常受到强烈荧光背景的干扰，尤其是对于生物样品。如果使用一串……对样品进行激发

本实验的目的是构建一种全光学步态，该步态可透过拉曼散射光，同时抑制荧光信号。首先通过激发并极化拉曼散射实现这一目标。实验的第二步是准备泵浦光束以操作光学门。第三，必须调整泵浦光、拉曼光和脉冲，使其相互重叠。该实验流程的最后一步是获取时间门控光谱。最终，通过分析具有高信噪比的拉曼信号，可以获得用于生化定量与分类的结果。与现有方法（如通过软件去除荧光背景）相比，该技术的主要优势在于显著降低了荧光所产生的散粒噪声。该方法有助于解答生物与生物医学领域的关键问题，例如对细菌细胞和组织中内源性荧光物质的化学成分进行无创表征，利用内源性标记物研究细胞过程以及癌症、血管疾病或神经退行性疾病等疾病机制。该方法还可能促进新型探针的开发，这些探针对荧光和拉曼（RAM）标记均可适用，也可用于开发用于血液分析的无创医学传感器。尽管该方法可为生物医学工程中的生物系统研究提供见解，但它也可应用于生物燃料、科研或电信产业等其他领域。生物样本通常置于载玻片上，该载玻片为一号厚度盖玻片，安装于 ATO Fluor 细胞培养腔内。液体样品，特别是对人类有毒的样品，应置于小型玻璃瓶中，并用硅胶环氧树脂将盖玻片固定在瓶口。随后将样品瓶倒置，放置于显微镜载物台顶部的二级载物台上，该二级载物台具有独立的聚焦控制功能，以便采集时间门控拉曼光谱。首先，必须正确准备激发光束。激发光源采用输出功率为 2.4 瓦的可调谐脉冲式 GI 蓝宝石激光器。在 80 兆赫的脉冲序列中，每个脉冲的能量应为 30 纳焦，脉宽为 140 飞秒，光谱中心波长为 808 纳米，光谱带宽约为 6 纳米。为防止背向反射光重新进入激光谐振腔，光束应依次通过法拉第隔离器；在法拉第隔离器前放置半波片，以实现对进入系统总功率的连续调节。由于六纳米的带宽太宽，无法分辨大多数拉曼模式，因此将光束通过一个极窄的带通滤光片，使其通过808纳米的波长。接下来，使用一个芳香双透镜将光聚焦到一个五毫米的β-硼酸钡晶体上。八个晶体将波长从808纳米减半至404纳米。将β偏硼酸钡（BBO）晶体置于带有俯仰和倾斜调节装置的镜架中，并安装在平移台上。为了最大化波长转换效率，必须将晶体精确地对称放置于双胶合透镜的焦点处，并使其晶体轴与入射光束的偏振方向对齐。由于波长转换效率依赖于偏振态，因此可在法拉第隔离器后放置第二块半波片，以控制照射到样品上的光量。通过旋转该半波片，可独立调节照射到样品上的光强，而不影响泵浦光束的光强。随后，波长转换后的光束由第二组芳香双胶合透镜重新准直，该透镜组的设计可确保激发光束足够大，以充满显微镜物镜的后光阑，并通过两个导向反射镜导入倒置显微镜中。显微镜物镜用于定义光轴，以使激发光束与该光轴对准。在显微镜的样品平面放置一面反射镜。然后在观察连接至显微镜成像端口的CCD相机上反射回来的激光束的同时，迭代调节两个导向镜。假设相机上的图像位于显微镜视场的中心，则光束处于光轴上。当焦点位于显微镜芯片中心时，沿Z轴移动物镜不会改变该位置。当样品置于样品平面并受到激光照射时，离焦光束的拉曼散射中心点即出现。位于物镜下方的二向色滤光片用于分离发生波长偏移的拉曼散射光与激发光束，并将拉曼散射光引导至显微镜的侧端口。该显微镜经过改装，移除了此光路中的所有透镜，使得信号光能够从显微镜中射出，因为从显微镜射出的信号光束直径大于镜筒透光孔径。使用由两组芳香双合透镜构成的0.47倍望远镜来缩小光束。信号光随后由一个Thompson偏振器进行偏振，该偏振器在实验室坐标系中相对于垂直方向取向为零度，并将光引导至二向色镜，在此处与泵浦光束重新合并。泵浦光束被导入一个由两个相互成直角放置的反射镜组成的延迟线，这两个反射镜均安装在可线性平移的平台上，可通过调节该平台以确保泵浦脉冲与信号脉冲在时间上重叠。经过延迟线后，光束通过一个半透射板和一个相对于实验室坐标系垂直方向呈45度取向的偏振片。这可确保泵浦光束到达非线性介质时具有合适的偏振态。随后，光束被两片转向镜反射，其中一片带有压电控制装置，应利用该装置最终调节泵浦光束的位置，使其在空间上与信号光束完全重合。为了获得这种重叠，需在两个位置观察泵浦光束和信号光束，一个位置靠近二向色镜，另一个位置远离该镜面。首先使用第一块转向镜在近端使两束光重叠，再通过压电镜在远端实现光束重叠，从而使泵浦光束与信号光束完全共线。接下来，应调整凹槽镜和收集系统，以最大化收集到的时间门控信号。为此，需先让泵浦光束和信号光束通过一个二向色滤光片，该滤光片在404纳米处具有六级光密度（OD6），用于阻止任何残余的激发光在非线性介质中产生激发或散射。然后，泵浦光束和信号光束通过一个芳香族双胶合透镜聚焦，进入一个光程长度为一厘米的石英池，池中包含非线性材料；任何具有足够高的非线性折射率和足够短的时间响应特性的非线性材料均可在此使用。在本实验中，我们采用二硫化碳。随后，光束由第二个双胶合透镜重新准直，该透镜的焦距与第一个透镜相同。然后将光束通过安装在旋转支架上的格兰-汤普森偏振分析器，再经过一组吸收滤光片和干涉滤光片，该组合滤光片在808纳米处的光密度（OD）为10。最后，信号光由一个芳香双胶合透镜聚焦进入一根50微米的多模光纤中，该光纤安装在一个可在X、Y和Z方向平移的载物台上。随后将光纤耦合至一台配有CCD相机的商用成像光谱仪，用于校准收集系统以最大化采集信号：首先将分析器设为零度，在样品平面放置甲苯测试样品，通过调节光纤支架的X、Y和Z控制旋钮优化采集到的拉曼信号，确保泵浦光与信号光在空间和时间上实现良好重叠。最后在显微镜的样品平面放置一面反射镜。然后从系统中移除404纳米滤光片。将检偏器旋转至90度，使后向反射的404纳米光束进入光谱仪，并调节其强度，确保不使相机饱和。现在关闭泵浦光束，旋转检偏器以最小化透射的404纳米信号。然后重新打开泵浦光束，并缓慢调节延迟台，直到404纳米光的透射开始增强。接下来，通过反复调节延迟台、压电镜以及光纤的X、Y和Z控制，以最大化信号强度，因为后向反射的404纳米光束与拉曼散射光在系统中可能经过略微不同的光路。最后，将一种强拉曼散射样品（如甲苯）放置在样品台上，替换拉曼滤光片，并通过微调延迟台、压电镜以及光纤的X、Y和Z控制，进一步优化拉曼信号，完成最终对准。现在系统已准备就绪，可以开始采集光谱。首先需要获取多条背景曲线，以校正系统伪影。第一步，将分析器设置为零度，打开激发光束，关闭泵浦光束。获取未加栅格的光谱，然后将检偏器设置为90度，采集代表杂散光透过偏振片的背景光谱。接着，在检偏器保持90度不变的情况下，关闭拉曼光束，打开泵浦光束，采集第二组背景光谱，代表泵浦光透过二向色滤光片的泄漏量。最后，在关闭所有激光器后，采集代表相机和电子设备暗电流水平的基线暗光谱。然后打开所有光束，采集门控光谱。为了获得仅通过门控的光的真实光谱，必须从该门控光谱中减去两个背景光谱和暗光谱。此处展示了瓦楞系统的示意图。泵浦光束的光路以实心红色线表示，二次谐波生成（SHG）光路以实心深蓝色线表示，拉曼和荧光重叠的光路以绿色表示。荧光被暂时滤除的光路以黄色显示。此处显示的是溶于浸油中的香豆素的原始光谱。红色曲线表示在门控打开时采集的光谱，黑色曲线表示在分析器调整至最小透射率并施加泵浦光束时采集的光谱。蓝色曲线显示的是在分析器调至最小透射率且未施加泵浦光束时测得的光谱，绿色曲线显示的是仅施加泵浦光束时测得的光谱。所有光谱均使用11点三阶KY高勒滤波器进行了平滑处理。虚线品红色线条标出了下一张图中所示的光谱范围。此处显示了香豆素溶解在浸油中并扣除荧光背景后的光谱。红色曲线为门控常开时的光谱，蓝色曲线为门控光谱。门控光谱清晰地显示出油类物质特有的高波数卷积峰。在尝试此操作时，重要的是要记住，激光器必须首先具备足够的脉冲能量来驱动气体，并且系统需要两个脉冲在空间和时间上实现精确重叠。观看本视频并阅读附带的实验方案后，您应能充分理解如何将激光束分离为激发光束和探测光束，以及如何在空间和时间上使这两束光实现重叠。如何通过光谱仪记录拉曼信号以及C、c、D，并进一步可视化和分析拉曼信号。请注意，使用激光器可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，必须采取佩戴激光防护眼镜等安全防护措施。此外，使用非线性材料及特定样品时还需遵守相应的其他安全规定。

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