Name: 一个1.5小时的程序，鉴定肠球菌直接从血培养的物种 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-10T20:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: 学习使用肽核酸荧光原位杂交技术快速鉴定血培养中的肠球菌属细菌。该方法通过特异性探针和荧光显微镜实现快速诊断，为败血症治疗提供及时的临床决策支持。

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本研究由 AdvanDx 资助。

1. 标本采集与制备
<ol>
<li>采集疑似脓毒症患者的静脉血，分别注入两支BACTEC（BD，Sparks，MD）血培养瓶中，一支需氧瓶和一支厌氧瓶，共同组成一套血培养标本。</li>
<li>将培养瓶放入BACTEC 9240仪器中，在35°C条件下孵育。</li>
<li>继续孵育直至仪器因血培养瓶中微生物生长而触发报警。</li>
<li>从血培养仪器中取出培养瓶。</li>
</ol>
2. 染色前试剂的准备
<ol>
<li>向染色皿中加入 4 mL 的 60 倍浓度洗涤液，再加入 240 mL 新鲜的去离子水或蒸馏水，配制洗涤液。</li>
<li>将染色皿放入 55°C 水浴中预热。</li>
<li>将剩余的浓缩液储存于 2-8°C 环境中。</li>
<li>从冰箱中取出封片液，并使其恢复至室温。</li>
</ol>
3. 革兰氏染色
<ol>
<li>轻轻旋转混匀血培养瓶。</li>
<li>使用针管或转种植片装置，从瓶中取出血液（约 5 mL），并置于无菌螺口管中。</li>
<li>用无菌移液管吸取一滴较大的血滴，置于玻璃显微镜载玻片上。</li>
<li>将载玻片在空气中干燥，并用甲醇固定 10 秒。</li>
<li>让载玻片自然晾干。</li>
<li>对血膜进行革兰染色，以确定血培养瓶中生长微生物的形态特征。</li>
<li>使用油镜观察载玻片。革兰染色中观察到成对或短链排列的革兰阳性球菌，最符合肠球菌属（enterococcus species）的特征。</li>
<li>该革兰染色结果将指导选择合适的 PNA FISH 探针试剂盒用于细菌鉴定。本血培养样本将使用 E. faecalis/OE PNA FISH 染色法进行染色。</li>
</ol>
4. PNA FISH 染色
<ol>
<li>在制备涂片前，轻轻旋转混匀含有血液的试管。</li>
<li>在PNA FISH显微镜载玻片的凹槽中加入一滴固定液。</li>
<li>从含有阳性血培养的试管中转移10 μL或一小滴样品至固定液中，并轻轻混匀以形成乳状液。</li>
<li>将涂片置于加热板上，在55°C下加热20分钟以完成固定。</li>
</ol>
5. 质量控制材料
每批染色切片必须同时检测一张阳性对照和一张阴性对照质控切片。
<ol>
<li>为此目的，使用从 AdvanDx 购买的 E. faecalis/OE 对照载玻片，或制备来自 E. faecalis 和 E. faecium 参考菌株液态培养物的涂片作为阳性对照，可分别置于不同的载玻片上，或将两者混合于同一张载玻片上；同时使用 Staphylococcus spp 或 Streptococcus spp 作为阴性对照材料。</li>
</ol>
质量控制结果应能够监测适当的检测条件，特别是影响杂交严谨性和细胞壁通透性的条件，因为PNA方法旨在优化细胞壁通透性
6. 杂交
<ol>
<li>在载玻片的涂片上滴加一滴 E. faecalis/OE PNA。</li>
<li>加盖盖玻片，避免产生气泡。</li>
<li>将载玻片置于加热板上，在 55 ± 1°C 下孵育 30 ± 5 分钟。</li>
<li>孵育结束后，将载玻片放入载玻片架中。</li>
</ol>
7. 严格洗涤
<ol>
<li>将载玻片架浸入预热至 55°C 的洗涤液中，并小心取下盖玻片。通常，轻轻晃动载玻片即可使盖玻片脱落。偶尔需用镊子轻轻推动使其脱离。</li>
<li>在 55 ± 1°C 条件下，于洗涤液中孵育 30 ± 5 分钟。</li>
<li>从洗涤液中取出载玻片</li>
<li>让载玻片自然风干</li>
</ol>
8. 封片
<ol>
<li>向每张载玻片上加一滴封片介质。</li>
<li>加盖盖玻片，避免产生气泡。</li>
<li>在2小时内使用荧光显微镜观察载玻片。</li>
<li>请勿将载玻片暴露于直射阳光或其他强光源下，以免导致荧光淬灭。</li>
</ol>
9. 结果解读
用于玻片检查的荧光显微镜必须配备 AdvanDx 双波段滤光片以及 60x 或 100x 油镜物镜。应首先检查质控玻片，以确认杂交确实发生。 E. faecalis 应在多个视野中呈现明亮的绿色荧光球菌，而 E. faecium 将呈现为明亮的红色球菌。非肠球菌对照片应无荧光。在确认对照样本系统正常后，可检查患者样本片。起初血膜呈微红色，但明亮的红色和绿色球菌将非常明显。 
<img src="/files/ftp_upload/2616/2616fig1.jpg" alt="细菌细胞的荧光显微镜图像；绿色和红色荧光；细胞活力分析。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1. 绿色阳性 E. faecalis（左）、红色阳性 E. faecium（中）和阴性（右）检测结果的代表性示例。
10. 代表性结果
本研究纳入了三家机构开展的一项多中心临床试验，旨在评估这种PNA FISH染色法，并将2.5小时操作流程与刚刚审阅过的缩短版1.5小时流程进行比较。共纳入152例常规检测中呈革兰阳性成对或链状排列球菌（GPC）阳性的血培养瓶。改良法与原始检测方法的结果完全一致，符合率达100%（152/152）。 E. faecalis/OE PNA FISH：41/41 E. faecalis；33株其他肠球菌和78株其他革兰阳性球菌（表1）。该染色方法在此项临床试验中表现出极高的敏感性和特异性（表2）。
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>常规方法</td>
 <td>E. faecalis /OE PNA FISH 标准操作程序</td>
 <td>E. faecalis/OE PNA FISH 简明操作流程</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E. faecalis</td>
 <td>41</td>
 <td>41（绿色阳性）</td>
 <td>41（绿色阳性）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E. faecium</td>
 <td>27</td>
 <td>27（红色阳性）</td>
 <td>27（红色阳性）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E. casseliflavus</td>
 <td>2</td>
 <td>2（红色阳性）</td>
 <td>2（红色阳性）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E. gallinarum</td>
 <td>2</td>
 <td>2（红色阳性）</td>
 <td>2（红色阳性）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>其他 肠球菌属 spp.</td>
 <td>2</td>
 <td>2（红色阳性）</td>
 <td>2（红色阳性）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>S. pneumoniae</td>
 <td>17</td>
 <td>17（阴性）</td>
 <td>17（阴性）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>S. viridans</td>
 <td>33</td>
 <td>33（阴性）</td>
 <td>33（阴性）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>S. mitis</td>
 <td>1</td>
 <td>1（阴性）</td>
 <td>1（阴性）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>S. pyogenes</td>
 <td>3</td>
 <td>3（阴性）</td>
 <td>3（阴性）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>S. bovis</td>
 <td>2</td>
 <td>2（阴性）</td>
 <td>2（阴性）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>S. salivarius</td>
 <td>1</td>
 <td>1（阴性）</td>
 <td>1（阴性）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>S. sanguinis</td>
 <td>2</td>
 <td>2（阴性）</td>
 <td>2（阴性）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>S. agalactiae</td>
 <td>7</td>
 <td>7（阴性）</td>
 <td>7（阴性）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>其他 链球菌属 种（spp.）</td>
 <td>7</td>
 <td>7（阴性）</td>
 <td>7（阴性）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Abiotrophia spp.</td>
 <td>3</td>
 <td>3（阴性）</td>
 <td>3（阴性）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peptostreptococcus 属</td>
 <td>2</td>
 <td>2（阴性）</td>
 <td>2（阴性）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总计</td>
 <td>152</td>
 <td>152/152 
 100% 一致</td>
 <td>152/152 
 100% 一致</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
表1. 使用标准（2.5 小时）和快速（1.5 小时）两种方案检测的细菌列表。
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>E.faecalis 的敏感性</td>
 <td>其他 Enterococcus spp. 的敏感性</td>
 <td>特异性</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100% (41/41) 
 95% CI (93.0-100)</td>
 <td>100% (33/33) 33/33 
 95% CI (91.3-100)</td>
 <td>100% (78/78) 
 95% CI (96.2-100)</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
表2. 1.5小时PNA FISH实验方案的灵敏度和特异性。

<ol><li>Rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures by dual color fluorescence in situ hybridization using PNA probes. Oliveira, K., Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Haase, G., Weber-Heynemann, J., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Stender, H. 42rd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2002, San Diego, , (2002).</li>
<li>Multicenter evaluation of E. faecalis PNA FISH for rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures. Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Oliveira, K., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Johansen, J. T., Procop, G. W., Wilson, D., Padilla, E., Gonzalez, V., Stender, H. 103rd Annual Meeting of American Society, 2003, Washington DC, , (2003).</li>
<li>Direct identification of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, and Candida albicans from blood cultures using fluorescence in situ hybridization with nucleic acid probes. Rausei, V., Youssef, E., Morgan, M. 104th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2005, New Orleans, LA, , (2005).</li>
<li>Validation of S. aureus PNA FISH, E. faecalis PNA FISH & C. albicans PNA FISH for Rapid Identification of Positive Blood Culture Bottles. Novak-Weekley, S. M., LaForga, M., Carey, L., Frazier, L. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, , (2006).</li>
<li>Rapid Identification of Enterococcus Species in Positive Blood Cultures with Therapeutic Implications. Johnson, J. K., Roberts, A. A., Forrest, G. N., Lincalis, D. P., Venezia, R. A. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, , (2006).</li>
</ol>

本视频文章的制作由AdvanDx公司赞助。Benjamin Crystal是AdvanDx公司的员工，该公司生产本文所使用工具和试剂。

的 E. faecalis/OE PNA FISH 检测法对肠球菌的鉴定比标准培养方法提前 2-3 天。该检测的简化流程（1.5 小时）可实现快速鉴定，有助于优化抗菌治疗方案并改善患者预后。Forrest 等人开展的一项研究为此提供了支持。 等 (6). 从2005年开始的连续两年中，微生物学实验室通过传统微生物学方法鉴定出血液培养瓶中生长的成对和链状排列的革兰阳性球菌，2006年增加了 E. faecalis/OE PNA FISH。此外，由本机构抗菌药物团队（AMT）制定了一项治疗流程算法，以及时有效地利用实验室生成的PNA FISH数据。主要评估结局为实施有效抗菌治疗的时间，即从血培养采集至有效抗菌治疗开始的时间，在PNA FISH引入实验室工作流程前后的变化。同时评估了疾病严重程度、患者所在科室及经验性抗菌治疗情况。共纳入224例医院获得性肠球菌菌血症患者，其中干预前阶段129例，PNA FISH阶段95例。PNA FISH鉴定出 E. faecalis 比传统培养方法提前3天（1.1天 vs. 4.1天，p&lt;0.001）。PNA FISH 鉴定出屎肠球菌的中位时间早 2.3 天（1.1 天 vs. 3.4 天，p&lt;0.001），并与启动有效治疗的时间显著缩短相关（1.3 天 vs. 3.1 天，p&lt;0.001）以及降低30天死亡率（26% vs. 45%，p=0.04）。该组研究者得出结论认为 E. faecalisOE PNA FISH 检测联合 AMT 治疗方案可促进医院获得性粪肠球菌菌血症患者更早启动适当的经验性抗菌治疗。
<ol>
<li>试剂不得在标签上标注的有效期后使用，且不得以任何方式修改试剂。不使用时应将其保留在冰箱中，否则可能导致试剂失效。</li>
<li>采样前需混匀血培养瓶。</li>
<li>滴管瓶瓶口不得接触血涂片，以免造成载玻片之间的交叉污染或试剂污染。</li>
<li>确保水浴箱和加热块始终保持在恒定的 55°C。</li>
<li>必须使用双波段滤光片，否则颜色将无法清晰分辨。</li>
<li>必须使用显微镜载玻片，否则杂交反应将无法发生。</li>
<li>显微镜必须处于正常工作状态。确保显微镜灯泡的使用时长在允许范围内。</li>
</ol>
<ul>
<li>某些罕见的肠球菌种类无法被针对其他肠球菌种类的PNA探针检测到，例如 E. asinii、E. dispar、E. haemoperoxidus、E. cecorum、E. columbae、E. saccharolyticus、E. solitarius 和 E. sulfurous。</li>
<li>由于序列相似性，E. moraviensis 被鉴定为 E. faecalis。</li>
<li>由于序列相似性，某些 Streptococcus anginosus 菌株会产生假性的绿色荧光阳性结果。</li>
<li>在临床研究期间未评估VersaTREK血培养瓶的性能。使用VersaTREK血培养瓶检测 E. faecalis 及其他肠球菌属物种的能力尚不明确。</li>
<li>若使用标准的FITC滤光片而非双波段滤光片，可能会出现假阳性绿色自发荧光。</li>
<li>由于混合生长或实验操作技术错误，可能会偶尔出现假阴性结果。</li>
<li>所用仪器的类型和状态会影响所获得图像的视觉外观。荧光强度可能因所用显微镜类型、光源以及细胞中rRNA含量的不同而有所差异。</li>
<li>需要在固体培养基上进行分离培养，以区分与其他微生物的混合生长，并识别产生阴性结果的阳性血培养样本。</li>
<li>该产品尚未在除血培养以外的其他标本类型中进行过验证。</li>
</ul>

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;试剂&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;em&gt;E. faecalis&lt;/em&gt;/&amp;#8211; PNA FISH 由以下试剂盒组分组成：&lt;/p&gt;&lt;ul&gt; &lt;李&gt;固定液 固定液 含去垢剂的3 mL磷酸盐缓冲液。&lt;/li&gt; &lt;李&gt;&lt;em&gt;E. faecalis&lt;/em&gt;/&amp;#8211; PNA &lt;em&gt;E. faecalis&lt;/em&gt;/&amp;#8211; PNA 1.5 mL PNA探针杂交液，含30%甲酰胺。&lt;/li&gt; &lt;李&gt;60倍洗涤液 60倍洗涤液 50 mL 含去垢剂的Tris缓冲盐水&lt;/li&gt; &lt;李&gt;封片剂 含3 mL 甘油的光漂白抑制封片剂&lt;/li&gt; &lt;李&gt;质量控制切片&lt;/li&gt; &lt;李&gt;&lt;a href=&quot;http://www.advandx.com&quot;&gt;AdvanDX&lt;/a&gt;&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

一种直接从血培养物中鉴定 enterococcus 物种的1.5小时操作流程

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

肠球菌是引起菌血症的常见原因 E. faecalis 以粪肠球菌为优势菌种，其次是屎肠球菌。由于对氨苄西林和万古霉素的耐药性 E. faecalis 与粪肠球菌中的耐药性相比，这种现象仍不常见，因此开发能够区分肠球菌种类的快速检测方法，对于合理治疗和耐药性监测具有重要意义。 E. faecalis OE PNA FISH 检测法（AdvanDx，Woburn，MA）采用针对特定物种的肽核酸（PNA）探针进行荧光原位杂交 原位 杂交格式，可在1.5小时内获得结果，有望为物种特异性治疗提供重要信息。已开展多中心研究以评估该1.5小时检测方法的性能 E. faecalis与原始的2.5小时检测程序及标准细菌学方法相比，OE PNA FISH程序直接从阳性血培养瓶中鉴定肠球菌。

一种利用肽核酸荧光原位杂交实验（PNA FISH）快速直接鉴定阳性血培养中粪肠球菌及其他肠球菌属物种的实验方案。

一种直接从血培养物中鉴定 Enterococcus 物种的1.5小时操作流程

肠球菌是引起菌血症的常见原因，其中粪肠球菌（E. faecalis）为主要致病菌，其次为屎肠球菌（E. faecium）。由于对氨苄西林和……产生耐药性

本实验的总体目标是利用肽核酸荧光原位杂交（PNA FISH）技术，快速鉴定来自阳性血培养瓶中的肠球菌属物种。在血培养物制备完成并经革兰染色确认存在肠球菌后，将样本固定于PNA FISH显微镜载玻片上。随后，将载玻片与针对目标微生物特异性的PNA探针共同孵育。探针杂交完成后，进行严格洗脱以去除未结合的过量探针。向载玻片添加封片介质，然后用盖玻片密封。通过荧光显微镜可鉴定样本中存在的肠球菌种类。该PNA Fish鉴定方案的独特之处在于提供了一种快速且特异性的方法，用于从瘫痪患者中鉴定肠球菌。将两瓶患者血培养样本分别接种至需氧瓶和厌氧瓶中，每瓶均含有疑似脓毒症患者的静脉血，并在自动血培养仪中于35摄氏度下孵育。一旦仪器提示检测到微生物生长，立即取出培养瓶，轻轻旋转混匀，使细菌均匀重悬。然后使用无菌注射器和针头，将每瓶中的约五毫升血液无菌转移至单独的螺旋盖试管中。待所有样本分配完毕后，使用无菌移液管从每支试管中各取一滴血液，分别滴加到不同的玻璃显微镜载玻片上。让载玻片在空气中干燥约15分钟。待玻片完全干燥后，将其浸入甲醇中以固定样本。玻片固定后，进行洗涤，并进行标准革兰染色，以确定每份血培养中微生物的形态。使用油镜显微镜观察染色后的玻片。输入一种隐球菌属物种将表现为革兰氏阳性球菌，通常成对或短链状排列。在P和鱼显微镜载玻片的小孔中加入一滴固定液。轻轻混匀待检测的血培养管。然后取10微升培养物转移至固定液滴中，并反复吹打以乳化样本。将载玻片置于55摄氏度的加热板上20分钟，以固定每次试验中的涂片。务必包含阳性和阴性对照载玻片，用于评估检测的质量。可从 Van DX 购买疣状控制载玻片，或使用参考培养物制备。涂片准备好后，在含有血液培养样本的孔中加入一滴 EFI 疣状 O-E-P-N-A，在阳性与阴性对照孔中也各加一滴。为避免探针储存液受到污染，切勿让滴管瓶尖接触血液涂片。将盖玻片盖在样品上，注意避免产生气泡。然后将载玻片置于55°C的加热块上孵育30分钟。孵育结束后，为使PNA发生杂交，将载玻片放入载玻片架中。将加载好的载玻片架浸入含有预热至55摄氏度洗涤液的染色缸中。通过在缓冲液中轻轻晃动载玻片或使用镊子，去除样本上多余的PNA，并小心移除盖玻片。将载玻片在55摄氏度的洗涤液中孵育30分钟。然后将载玻片从染色缸中取出，使其自然风干。待载玻片完全干燥后，加入一滴室温封片剂至载玻片上，并小心地将盖玻片覆盖在样本上。制备完成后两小时内，使用双通道滤光片在荧光显微镜下观察载玻片。采用此方法，可将左侧绿色显示的疑似的角质层（iffy, callous）与红色的真菌（eum）区分开来。最右侧中间图显示阴性结果。要获得成功结果需牢记三点：仪器温度必须保持在设定温度。您需要严格按照试剂盒说明书中所述的染色步骤进行操作。最后，您需要由一位经验丰富的读片人员对玻片进行仔细阅片。该方案在针对由肠球菌引起的败血症治疗方案决策中具有重要价值。感谢观看，祝您的实验顺利。

a-15-hour-procedure-for-identification-enterococcus-species-directly

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