一种直接从血培养物中鉴定 Enterococcus 物种的1.5小时操作流程

本实验的总体目标是利用肽核酸荧光原位杂交（PNA FISH）技术，快速鉴定来自阳性血培养瓶中的肠球菌属物种。在血培养物制备完成并经革兰染色确认存在肠球菌后，将样本固定于PNA FISH显微镜载玻片上。随后，将载玻片与针对目标微生物特异性的PNA探针共同孵育。

探针杂交完成后，进行严格洗脱以去除未结合的过量探针。向载玻片添加封片介质，然后用盖玻片密封。通过荧光显微镜可鉴定样本中存在的肠球菌种类。

该PNA Fish鉴定方案的独特之处在于提供了一种快速且特异性的方法，用于从瘫痪患者中鉴定肠球菌。将两瓶患者血培养样本分别接种至需氧瓶和厌氧瓶中，每瓶均含有疑似脓毒症患者的静脉血，并在自动血培养仪中于35摄氏度下孵育。一旦仪器提示检测到微生物生长，立即取出培养瓶，轻轻旋转混匀，使细菌均匀重悬。

然后使用无菌注射器和针头，将每瓶中的约五毫升血液无菌转移至单独的螺旋盖试管中。待所有样本分配完毕后，使用无菌移液管从每支试管中各取一滴血液，分别滴加到不同的玻璃显微镜载玻片上。让载玻片在空气中干燥约15分钟。

待玻片完全干燥后，将其浸入甲醇中以固定样本。玻片固定后，进行洗涤，并进行标准革兰染色，以确定每份血培养中微生物的形态。使用油镜显微镜观察染色后的玻片。

输入一种隐球菌属物种将表现为革兰氏阳性球菌，通常成对或短链状排列。在P和鱼显微镜载玻片的小孔中加入一滴固定液。轻轻混匀待检测的血培养管。

然后取10微升培养物转移至固定液滴中，并反复吹打以乳化样本。将载玻片置于55摄氏度的加热板上20分钟，以固定每次试验中的涂片。务必包含阳性和阴性对照载玻片，用于评估检测的质量。

可从 Van DX 购买疣状控制载玻片，或使用参考培养物制备。涂片准备好后，在含有血液培养样本的孔中加入一滴 EFI 疣状 O-E-P-N-A，在阳性与阴性对照孔中也各加一滴。为避免探针储存液受到污染，切勿让滴管瓶尖接触血液涂片。

将盖玻片盖在样品上，注意避免产生气泡。然后将载玻片置于55°C的加热块上孵育30分钟。孵育结束后，为使PNA发生杂交，将载玻片放入载玻片架中。

将加载好的载玻片架浸入含有预热至55摄氏度洗涤液的染色缸中。通过在缓冲液中轻轻晃动载玻片或使用镊子，去除样本上多余的PNA，并小心移除盖玻片。将载玻片在55摄氏度的洗涤液中孵育30分钟。

然后将载玻片从染色缸中取出，使其自然风干。待载玻片完全干燥后，加入一滴室温封片剂至载玻片上，并小心地将盖玻片覆盖在样本上。制备完成后两小时内，使用双通道滤光片在荧光显微镜下观察载玻片。

采用此方法，可将左侧绿色显示的疑似的角质层（iffy, callous）与红色的真菌（eum）区分开来。最右侧中间图显示阴性结果。要获得成功结果需牢记三点：仪器温度必须保持在设定温度。

您需要严格按照试剂盒说明书中所述的染色步骤进行操作。最后，您需要由一位经验丰富的读片人员对玻片进行仔细阅片。该方案在针对由肠球菌引起的败血症治疗方案决策中具有重要价值。

感谢观看，祝您的实验顺利。