Name: 确定远距离的DNA相互作用的相关染色体陷阱 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: 学习使用相关染色体陷阱（ACT）技术鉴定远距离DNA相互作用，以人早幼粒白血病细胞为模型。该方法通过限制性酶切、连接和PCR扩增揭示基因组区域间的未知关联，为研究核结构与基因表达调控提供有力工具。

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我们非常感谢Adelle Murell和Wolf Reik分享他们的3C实验方案。本工作由美国国防部和退伍军人事务部研究服务局资助。

1. 长程染色质相互作用的甲醛固定
<ol>
	<li>将HL-60人细胞系在含15% FBS和1×青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中培养至80–90%融合度，培养箱条件为37°C、5% CO2。</li>
	<li>将细胞收集至50 ml Nunc离心管中，于1,200 rpm离心15分钟，随后吸除上清液。</li>
	<li>加入5 ml培养基重悬细胞沉淀，用血细胞计数板计数细胞。取约1×107个细胞，用40 ml RPMI1640/10% FBS重悬，然后加入1.7 ml 37%甲醛以固定稀释的染色质。</li>
	<li>室温下轻轻振荡孵育10分钟，随后加入2.4 ml 2 M甘氨酸终止反应。在4°C下以1,200 rpm离心15分钟，弃去上清液。用40 ml预冷的PBS洗涤沉淀一次，再次离心后弃去PBS。</li>
</ol>
2. 裂解细胞以分离细胞核
<ol>
	<li>在 40 ml 冰冷的裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，10 mM NaCl，0.2% NP-40）中重悬细胞，加入新鲜配制的蛋白酶抑制剂（1:500 稀释）和 0.1 mM PMSF。在冷室中旋转孵育 90 分钟，于 2,500 rpm 离心 15 分钟，弃去上清液。</li>
</ol>
3. 使用 Bgl II 进行限制性酶切
<ol>
	<li>将细胞核重悬于 0.5 ml 1 × NEB 缓冲液 3 中，加入 15 μl 10% SDS。37°C 摇床孵育 1 小时，然后加入 45 μl 20% Triton X-100 以结合 SDS。37°C 继续摇床孵育 1 小时。</li>
	<li>取 1 × 106 个细胞核（约 15 μg，相当于原始细胞的十分之一）用于限制性内切酶消化。从步骤 3.1 中取出 55 μl 细胞核溶液，加入 433 μl 1 × NEB 缓冲液 3 和 12 μl Bgl II（50 U/μl），总体积补至 500 μl。37°C 孵育过夜。</li>
</ol>
4. 相互作用DNA片段的连接
<ol>
	<li>加入 95 μl 10% SDS 以灭活限制性内切酶，并在水浴中于 65 °C 加热 20 分钟进行变性。</li>
	<li>加入 7 ml 1× 连接缓冲液（30 mM Tris-HCl，pH 8.0，10 mM MgCl2，10 mM DTT，1 mM ATP）和 360 μl 20% Triton X-100，于 37°C 孵育 1 小时。</li>
	<li>将温度降至 16°C，加入 50 μl 400 U/μl T4 DNA 连接酶。样品在 16 °C 孵育 4 小时，随后在室温下孵育 30 分钟。</li>
</ol>
5. DNA 纯化
<ol>
	<li>加入 300 μg 蛋白酶 K，在 65°C 下孵育过夜。</li>
	<li>加入 5 μg RNase A，在 37°C 下孵育 30 分钟。</li>
	<li>用苯酚/氯仿抽提法纯化 DNA，并用异丙醇沉淀 DNA。将 DNA 溶解于 150 μl 无菌蒸馏水中。</li>
</ol>
6. 使用 Msp I 进行消化并与寡核苷酸连接子连接
<ol>
	<li>将2μg纯化的DNA与5单位的Msp I在37°C孵育4-6小时。在65°C灭活Msp I 10分钟，然后加入1 μl浓度为5 mg/ml的糖原，通过乙醇沉淀DNA。将DNA沉淀溶解于50 μl无菌蒸馏水中。</li>
	<li>将50 μl经Msp I处理的DNA与2 μl浓度为20 μM的接头寡核苷酸L（5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3'）、1 μl浓度为20 μM的寡核苷酸S（5'-cggtgaatc-3'）、1 μl无菌蒸馏水以及6 μl 10× T4 DNA连接酶缓冲液混合。用液体石蜡覆盖混合物。</li>
	<li>在PCR仪中于50°C变性寡核苷酸1分钟，随后以每分钟0.5°C的降温速率逐步冷却至10°C。</li>
	<li>加入1 μl浓度为400 U/μl的T4 DNA连接酶，在15°C孵育过夜。使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化连接接头后的DNA，并洗脱于50 μl无菌蒸馏水中。</li>
</ol>
7. PCR 扩增与序列分析
<ol>
	<li>选择用于检测长距离相互作用（即“诱饵”）的特定 DNA 区域的引物。在本示例中，我们使用 ABL-1。</li>
	<li>取 1 μl 纯化的 DNA 进行第一轮 PCR，加入 1 μl 20 μM 的 ABL-1 特异性引物 #4656（5'-gttcaagcgattctcctgcctcga-3'）、1 μl 20 μM 的连接子特异性引物 #2963（5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3'）、3 μl 3 x Klen Taq DNA 聚合酶 I 混合液和 3 μl 无菌去离子水。在 PCR 扩增前，将 2 μl 的 32P-dCTP 加入 100 μl 的 3 x Klen Taq DNA 聚合酶 I 混合液中。热循环程序为：72°C 预延伸 2 分钟，95°C 变性 2 分钟；随后进行 18 个循环（95°C 变性 20 秒，65°C 退火 40 秒，72°C 延伸 1 分钟）；最后在 72°C 延伸 5 分钟。</li>
	<li>使用 QIAquick PCR 纯化试剂盒纯化第一轮 PCR 产物，并用 30 μl 无菌去离子水洗脱 DNA。</li>
	<li>取 1 μl 第一轮 PCR 产物（稀释 100 倍后）作为模板，加入 1 μl 20 μM 的 ABL-1 特异性巢式引物 #4626（5'-ggagaatttttatctgcctctgtga-3'）（图 1a）、1 μl 20 μM 的连接子特异性引物 #2961（5'-gtcgttagcggacacagggcgattc-3'）、3 μl 3 x Klen Taq DNA 聚合酶 I 混合液和 3 μl 无菌去离子水，进行第二轮 PCR。热循环程序为：25 个循环（95°C 变性 20 秒，67°C 退火 40 秒，72°C 延伸 1 分钟），最后在 72°C 延伸 5 分钟。</li>
	<li>通过 5% 尿素-PAGE 凝胶电泳检测 PCR 产物，并使用磷屏成像仪扫描凝胶（图 1b）。每条 PCR 条带可通过将凝胶条带切下并置于含有 60 μl 无菌去离子水的离心管中，95°C 孵育 5 分钟溶解回收。短暂离心（10,000 rpm，10 秒）以收集样品。取 1 μl 回收产物作为 DNA 模板，使用引物对 2961/4626 在相同条件下进行 PCR 扩增。PCR 产物经 QIAquick PCR 纯化试剂盒纯化后可进行测序分析。</li>
	<li>使用在线工具在 http://genome.ucsc.edu 网站分析 DNA 序列的染色体定位（图 1c）。点击“BLAT”进入新窗口，可粘贴 DNA 序列；点击“submit”后出现新页面，显示“BLAT 搜索结果”。点击与目标序列 100% 匹配的比对结果中的“browser”，进入下一窗口以查看该 DNA 序列的染色体位置。</li>
</ol>
8. 代表性结果
1. 使用 ABL-1 区域作为诱饵的ACT检测，以确定其远距离DNA相互作用
如图1a所示，ACT实验选择了两个Bgl II位点和一个BamH I位点。在第二轮PCR中，使用引物对4626/2961扩增ABL-M1，4630/2961扩增ABL-M2，4636/2961扩增ABL-M3。典型的凝胶电泳图谱显示一条或多条条带（图1b）。ACT实验中每个片段均由两个DNA片段连接而成：其中一个片段来源于诱饵DNA区域，另一个片段来源于与之相连的配对序列，该配对序列通过第一个限制性酶切位点序列与诱饵区域片段连接。第二个酶切位点序列将出现在配对序列的末端（图1c）。克隆得到的ABL-M1片段包含位于9号染色体q32.4区域的ABL1基因DNA序列，位置为+133,592,306-133,592,399；其配对序列位于3号染色体p13区域，位置为+71,869,882-71,870,107。通过使用UCSC基因组浏览器（2009年2月发布的GRCh37/hg19版本）对配对序列进行BLAST比对，确定其身份。结果表明，chr3p13位点的配对基因为PROK2。
同样，ABL-M2 相关的配对位于 chr5q21.1，而克隆 ABL-M3 被鉴定为靠近该区域的染色体内关联 ABL-1 位点
2. 使用ACT检测法确定低频长程相互作用
基于 3C 的其他检测方法已报道了比我们在图1及 Igf2/H19 位点所示更多的相互作用伙伴12。我们所概述的方法将筛选出最普遍的长距离相互作用。然而，通过增加 PCR 循环次数，也有可能鉴定出其他频率较低的关联（图2）。
3. 癌细胞与正常组织相比在长程相互作用上的差异。
ACT 检测还可用于识别正常细胞与癌细胞之间在细胞核结构和远距离相互作用上的差异（图3）。这些差异可能反映了细胞转化过程中发生的细胞核结构变化，因此该检测最终可能适用于诊断目的。在正常组织和癌组织中出现的相似凝胶图谱表明，ACT 检测具有可靠性和可重复性。尽管 ACT 检测能够识别远距离的 DNA 配对伙伴，但仍需进一步分析（如 FISH 和 ChIP 检测）来验证所鉴定的远距离位点之间的关联。随后可开展遗传学、生理学和生物化学研究，以阐明这些远距离 DNA 关联的生物学意义。
<img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig1.jpg" alt="ABL基因研究的基因结构图、电泳结果及序列分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1 在HL-60细胞中以ABL-1区域作为诱饵DNA进行ACT检测。a. ABL-1区域的DNA结构。ACT检测中使用的第一种限制性内切酶为Bgl II。第二轮PCR的引物也用箭头及相应的引物编号标出。b. 5%尿素-PAGE中ACT检测的凝胶图谱。巢式PCR中，引物对4626/2961用于扩增克隆ABL-M1，4630/2961用于扩增克隆ABL-M2，4636/2961用于扩增克隆ABL-M3。c. 克隆ABL-M1的DNA序列。ABL-1诱饵DNA来源的DNA片段以红色标注，其相互作用的DNA配对片段以青色标注。Bgl II位点（AGACTC）以绿色标注，Msp I位点（CCGG）以紫色标注。
<img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig2.jpg" alt="PCR循环分析；电泳结果；DNA扩增比较；凝胶条带标记。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2 PCR循环次数影响ACT实验结果。 以小鼠成纤维细胞中Igf2/H19位点的印记控制区（ICR）作为 bait DNA，在ACT实验的第一轮和第二轮PCR中采用不同的循环程序。第一轮PCR进行18-20个循环时，扩增信号不足，无法观察到条带；第二轮PCR进行25个循环可产生清晰的条带，而增加第二轮PCR的循环次数则在出现更多条带的同时伴随拖尾现象。
<img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig3.jpg" alt="利用DpnII消化进行CTCF结合位点定位；正常组织与癌组织DNA的电泳图谱。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3 ACT实验中检测正常结肠组织与结肠癌组织间核结构差异。a. IGF2/H19 位点处ICR区域及IGF2基因的DNA结构。DpnII在ACT实验中的酶切位点已标注。第二轮PCR所用引物以不同颜色的箭头和数字标注，对应于图b中各泳道。b. ACT实验在5%尿素-PAGE凝胶中的电泳图谱。正常结肠组织MAD03-1423和结肠癌组织MAD04-149来自合作人类组织网络（CHTN）西部部门。每份结肠组织经匀浆处理后，按本文所述步骤进行ACT实验。泳道1代表使用引物对#2961和#4161（5'-tctgcgccatcagggcagtgagac-3'）的PCR结果，该引物对在图a中以粉红色标注；泳道2代表使用引物对#2961和#4163（5'-gccgcgcggccacttccgattcc-3'）的PCR结果，该引物对在图a中以橙色标注；泳道3代表使用引物对#2961和#5145（5'-gccatgcaggtaggatttgagctg-3'）的PCR结果，该引物对在图a中以蓝色标注；泳道4代表使用引物对#2961和#5151（5'-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3'）的PCR结果，该引物对在图a中以绿色标注。仅在正常结肠组织中出现的独特条带以黄色箭头标注，仅在结肠癌组织中出现的条带以红色箭头标注。ICR，印记控制区；DMR，差异甲基化区。

<ol><li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295, 1306-1311 (2002).</li>
<li>Apostolou, E., Thanos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+Infection+Induces+NF-kappaB-dependent+interchromosomal+associations+mediating+monoallelic+IFN-beta+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Virus Infection Induces NF-kappaB-dependent interchromosomal associations mediating monoallelic IFN-beta gene expression.</a> Cell. 134, 85-96 (2008).</li>
<li>Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+model+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional model of the yeast genome.</a> Nature. 465, 363-367 (2010).</li>
<li>Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interchromosomal+interactions+and+olfactory+receptor+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice.</a> Cell. 126, 403-413 (2006).</li>
<li>Murrell, A., Heeson, S., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+differentially+methylated+regions+partitions+the+imprinted+genes+Igf2+and+H19+into+parent-specific+chromatin+loops%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and H19 into parent-specific chromatin loops.</a> Nat Genet. 36, 889-893 (2004).</li>
<li>Schoenfelder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat Genet. 42, 53-61 (2010).</li>
<li>Spilianakis, C. G., Lalioti, M. D., Town, T., Lee, G. R., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interchromosomal+associations+between+alternatively+expressed+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interchromosomal associations between alternatively expressed loci.</a> Nature. 435, 637-645 (2005).</li>
<li>Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+among+distant+regulatory+elements+at+the+beta-globin+locus+requires+GATA-1+and+FOG-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Proximity among distant regulatory elements at the beta-globin locus requires GATA-1 and FOG-1.</a> Mol Cell. 17, 453-462 (2005).</li>
<li>Xu, N., Tsai, C. L., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+homologous+chromosome+pairing+marks+the+onset+of+X+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation.</a> Science. 311, 1149-1152 (2006).</li>
<li>Lieberman-Aiden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li>
<li>Berkum, N. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C%3A+a+method+to+study+the+three-dimensional+architecture+of+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Ling, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+mediates+interchromosomal+colocalization+between+Igf2%2FH19+and+Wsb1%2FNf1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CTCF mediates interchromosomal colocalization between Igf2/H19 and Wsb1/Nf1.</a> Science. 312, 269-272 (2006).</li>
<li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+%27C%27s+of+chromosome+conformation+capture%3A+controls%2C+controls%2C+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The three 'C's of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nat Methods. 3, 17-21 (2006).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

Dekker 等 开发了染色体构象捕获（3C）技术，用于检测两个基因组位点之间相互作用的频率1，该技术已被广泛用于研究哺乳动物细胞中两个已知DNA区域之间的染色体内和染色体间关联2-9。尽管新发展的Hi-C方法可用于全基因组DNA关联研究，ACT检测仍是一种研究位点特异性DNA相互作用的有效技术10-11。我们对该方法进行了改进，以鉴定在培养的小鼠和人类细胞中与已知DNA区域相关联的未知DNA区域（图1）。我们将该方法命名为“关联染色体捕获”（associated chromosome trap, ACT）检测，因为它为我们提供了一种可靠且可重复的方法，用于鉴定与已知靶DNA区域相关联的新的未知DNA伙伴序列12。在实施ACT检测的新颖步骤之前，需先完成包含适当对照的成功的3C检测13。为了尽可能多地发现相关联的DNA区域，有必要使用多种第一和第二限制性内切酶的组合。尤其重要的是，在进行首次3C连接步骤时，应选用对CpG甲基化不敏感的限制性内切酶。蛋白质结合和DNA甲基化也可能影响限制性内切酶的消化效率，导致某些酶切条件下相关DNA区域无法有效连接。染色体内或染色体间的连接发生情况取决于蛋白-DNA交联以及两个相关DNA区域的适当物理图谱。因此，一些初步实验对于确定ACT检测中可行且有效的甲醛浓度和处理时间至关重要。在不同实验室中，3C步骤所使用的甲醛终浓度范围通常为1.5%至2%7,9。此外，也可将用作连接子的寡核苷酸设计为与第二限制性内切酶切割产生的黏性末端相匹配。尽管我们发现第一轮PCR进行18–20个循环、第二轮PCR进行20–25个循环即可获得清晰条带，但仍需为每个实验建立最佳PCR条件（图2）。在PCR过程中，DNA链的5'端和3'端互补接头序列之间可能发生分子内退火，这会抑制接头特异性引物与DNA分子的结合，导致最初几个循环的扩增效率显著降低。随着目标DNA经过多轮扩增，其数量可能远超过非特异性反应产物，从而促进引物优先与目标DNA分子结合。这也是为何会出现背景扩增，以及为何第一轮PCR产物必须稀释以降低背景信号的原因。为降低第二轮PCR中的背景信号，从PCR反应体系中去除过量引物非常重要。与所有基于PCR的实验一样，设计引物时必须避免位于重复序列区域，因为这些区域构成了人类和小鼠DNA的大部分。尽管新发展的Hi-C方法可用于全基因组DNA关联研究，ACT检测仍是一种研究位点特异性DNA相互作用的有效技术。

<table><tbody><tr><td>RPMI1640 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>22400-105</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>15512-023</td><td></td></tr><tr><td>ATP 溶液，10 mM</td><td>Invitrogen</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9856</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Invitrogen</td><td>12091-039</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Invitrogen</td><td>15505-035</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;BamH&lt;/em&gt; I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bgl&lt;/em&gt; II</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144M</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Dpn&lt;/em&gt; II</td><td>New England Biolabs</td><td>R0543T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Msp&lt;/em&gt; I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106S</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8102S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>37% 甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>双丙烯酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93482</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Roche Group</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>KlenTaq1</td><td>Ab peptides</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>dCTP alpha P32</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU513H250UC</td><td></td></tr><tr><td>PTC-100 热循环仪</td><td>MJ Research</td><td>mjptc100</td><td></td></tr><tr><td>电泳电源</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5056</td><td></td></tr><tr><td>OmniPAGE Maxi</td><td>Aurogene Life Science</td><td>VS20D</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9400</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0055-78</td><td></td></tr></tbody></table>

关联染色体捕获法用于鉴定远端dna相互作用

Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

DNA编码的遗传信息以复杂且高度调控的染色质结构进行组织。每条染色体占据特定的空间区域，其位置可能随发育阶段或细胞周期而变化。基因表达可在特化的转录工厂中进行，此时染色质片段可从不同染色体区域环出，导致在不同染色体上或同一染色体上相距较远的DNA片段发生共定位。染色体相关捕获（Associated Chromosome Trap，ACT）检测通过扩展和改进染色体构象捕获技术，提供了一种无偏倚识别这些长距离DNA关联的有效方法。ACT检测使我们能够研究反式转录调控的机制，并有助于阐明在正常生理状态及疾病状态下，细胞核结构与基因表达之间的关系。

染色体捕获关联（ACT）检测是一种用于鉴定远端DNA相互作用的新型无偏倚方法。对远端DNA相互作用的表征将有助于我们确定在正常生理状态以及疾病状态下，细胞核结构与基因表达之间的关系。

关联染色体捕获法用于鉴定远端DNA相互作用

由DNA编码的遗传信息以复杂且高度调控的染色质结构进行组织。每条染色体占据特定的区域，……

以下实验的总体目标是发现并鉴定远距离相关的DNA配对片段。该目标通过固定细胞、裂解细胞以及利用第一种限制性内切酶消化DNA来实现，随后进行连接反应，形成由两个相关基因片段组成的嵌合DNA。在第二次限制性酶切后，将接头序列添加至嵌合DNA上，以促进其扩增。随后使用接头序列和诱饵DNA特异性引物进行PCR扩增，从而获得足量的相关DNA片段。通过对扩增后的DNA片段进行序列分析，可获得与诱饵DNA存在长距离相互作用的DNA配对结果。与现有的染色体构象捕获技术（如三C技术）相比，该方法的主要优势在于，A-C-T-S-A 能够有效鉴定未知的远距离关联 DNA 伙伴，而三C技术仅适用于验证先前已怀疑存在的相互作用。开始本实验方案时，将人类细胞在含有5%二氧化碳、37°C的培养箱中培养，直至细胞融合度达到80%至90%。本实验使用人早幼粒急性白血病细胞。将细胞倒入50毫升无菌离心管中，于1200 RPM条件下离心15分钟以收集细胞。离心后，通过抽吸去除上清液。加入 5 毫升培养基以重悬细胞沉淀。用血细胞计数板计数细胞后，取约 1 × 10⁷ 个细胞，用含 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基定容至 40 毫升。然后加入 1.7 毫升 37% 甲醛以固定稀释的染色质。将样品在室温下轻轻振荡孵育10分钟。孵育结束后，加入2.4毫升2摩尔的甘氨酸终止反应。随后，在4摄氏度、1200转/分钟的条件下离心样品15分钟。去除上清液后，用40毫升预冷的PBS洗涤沉淀一次，然后离心样品以收集洗涤后的细胞沉淀。将所得沉淀重悬于40毫升预冷的裂解缓冲液中，缓冲液需新鲜添加蛋白酶抑制剂和0.1毫摩尔PMSF，在冷室中旋转孵育90分钟。最后，以2,500 RPM离心15分钟，去除上清液，获得分离的细胞核。将细胞核重悬于0.5毫升1×NEB缓冲液3中，并加入15微升10% SDS。将样品在 37 摄氏度下振荡孵育 1 小时。然后加入 45 微升 20% Triton X-100 以结合 SDS，并再次在 37 摄氏度下振荡孵育 1 小时，分装为每份 1 × 10⁶ 个。取细胞核（约 15 微克）用于限制性内切酶消化，加入 55 微升细胞核溶液。加入433 µL NEB缓冲液三和12 µL BglII，使总消化反应体积达到500 µL。将反应体系在37°C下孵育过夜。次日，加入95 µL 10% SDS以灭活限制性内切酶，并在65°C加热20分钟使酶变性。在水浴中，加入7毫升1×连接缓冲液和360微升20% Triton X-100。将样品在37摄氏度孵育1小时。将温度降至16摄氏度，然后加入50微升400单位/微升的酶。T四 DNA 连接酶。将连接反应在 16 摄氏度孵育 4 小时，然后在室温下孵育 30 分钟。连接完成后，加入 300 微克蛋白酶 K，并在 65 摄氏度孵育过夜。然后加入五微克RNAA，在37摄氏度下孵育30分钟。用苯酚-氯仿抽提法纯化DNA，并用异丙醇沉淀DNA，将沉淀的DNA溶解于150微升无菌蒸馏水中。为了向嵌合DNA添加接头，首先通过将两微克纯化的DNA与五个单位的MspI在37摄氏度下孵育四至六小时来消化DNA；消化完成后，在65摄氏度下孵育10分钟以灭活MspI。然后用乙醇沉淀DNA，并加入一微升浓度为每毫升五毫克的糖原，将所得的DNA沉淀溶解于50微升无菌蒸馏水中。接着，将50微升MSP1处理后的DNA与两微升20微摩尔的连接子寡核苷酸L以及一微升20微摩尔的寡核苷酸S混合，再加入一微升无菌蒸馏水和六微升10×T4 DNA连接酶缓冲液。用液体石蜡覆盖混合物。在50摄氏度下变性寡核苷酸1分钟，然后以每分钟0.5摄氏度的梯度逐渐冷却至10摄氏度。使用热循环仪，加入1微升浓度为400单位/微升的T4 DNA连接酶，于15摄氏度孵育过夜。第二天，使用kaya快速PCR纯化试剂盒纯化连接接头的DNA，并用50微升无菌蒸馏水洗脱。然后选择针对要研究长距离相互作用的DNA特定区域的引物。在此示例中，将使用Abel作为引物或诱饵。将1微升纯化后的DNA与1微升20微摩尔的特异性引物Able One 46 56以及1微升20微摩尔的连接子特异性引物29 63混合，以准备第一轮PCR。然后加入3微升三倍浓度的ClinTech DNA聚合酶预混液（该预混液已按照书面方案与32P-dCTP预先混合），再加入3微升无菌蒸馏水。按照书面方案中描述的热启动PCR热循环程序进行PCR扩增，PCR循环完成后即可。使用kaya快速PCR纯化试剂盒纯化第一轮PCR产物，用30微升无菌蒸馏水洗脱。取1微升第一轮PCR产物，稀释100倍后用于第二轮PCR，加入1微升20微摩尔的特异性引物abe one specific primer, 46 26，以及1微升20微摩尔的连接子特异性引物29 61。再次加入 3 µL 的 3 × ClinTech DNA 聚合酶预混液和 3 µL 无菌蒸馏水。使用以下热循环程序进行第二轮 PCR：95 °C 变性 20 秒，67 °C 退火 40 秒，72 °C 延伸 1 分钟，共 25 个循环，最后在 72 °C 延伸 5 分钟。通过运行5%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后在磷屏成像仪中扫描曝光的屏，以观察PCR产物。每条PCR条带均可从凝胶中回收：将凝胶条切下，放入含有60 µL无菌蒸馏水的Eppendorf管中，95 °C孵育5分钟使其溶解，短暂离心，于10,000 RPM离心10秒。收集所有样品。取一微升作为DNA模板，用于与引物修复进行PCR反应。29 61 46 26。在相同条件下，经过纯化和测序分析后，可使用在线工具确定其染色体位置。进入基因组生物信息学网站后，点击 BLAT 按钮以打开新窗口，并粘贴DNA序列。提交DNA序列后，BLAT 搜索结果将显示出来。点击浏览器中与目标序列完全一致（100% 相同性）的匹配结果，以显示该 DNA 序列的位置。将该区域作为诱饵，用于确定其远距离 DNA 相互作用。在第二轮 PCR 引物设计中，选择两个 BGL 两个位点和一个 BAM H 一个位点用于 A CT 检测。引物 46 26 29 61 用于扩增 able M1，46 30 29 61 用于 able M2，46 36 29 61 用于 able M3。典型的凝胶电泳图谱显示一条至多条条带，此处展示的 able M1、able M2 和 able M3 即为如此。克隆子 able M1 的 DNA 序列表明，A CT 检测中每个片段均由两个连接的 DNA 片段组成：其中一个片段来源于诱饵 DNA 区域，另一个片段则来自与其结合的伴侣序列。这些片段通过第一种限制性酶识别序列相互连接。第二种酶的识别序列将出现在相应伴侣序列的末端。克隆的ABLE M1片段包含位于9号染色体Q32.4区域的ABLE1基因片段的DNA，其相应的伴侣序列位于3号染色体P3区域，被鉴定为PROC2。类似地，Able M2 的相关互作伙伴定位于第5号染色体的 Q21.1 区域，而 Able M3 克隆则被鉴定为位于 Able1 位点附近的染色体内互作区域，这与 3C 实验的结果形成对比。本视频中所述的方法将筛选出最普遍的长距离相互作用。然而，通过增加 PCR 循环次数，也有望鉴定出其他出现频率较低的互作。以小鼠成纤维细胞中 IGF2-H19 位点的印记控制区（ICR）作为诱饵 DNA，在 A-CUT 实验中，第一轮和第二轮 PCR 采用了不同的循环程序。ACT检测还可用于识别正常细胞与癌细胞之间在核结构和长距离相互作用上的差异。将正常结肠组织和结肠癌组织进行匀浆处理，并按照本文所述步骤执行ACT检测。此处展示的是IGF2-H19位点ICR区域以及IGF2基因dpn的DNA结构。ACT 检测的两个位点以及第二轮 PCR 中使用的引物由不同颜色的箭头和数字标记。ACT 检测的电泳图谱显示了使用引物 29 61 与引物对 41/61、41/63、51/45 和 51/51 进行 PCR 所得到的结果。仅在正常结肠组织中出现的独特条带用黄色箭头标记，仅在结肠癌组织中出现的条带用红色箭头标记。该技术为市场生物学领域的研究人员探索细胞核结构和基因调控的三维机制铺平了道路。

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