确定远距离的DNA相互作用的相关染色体陷阱

以下实验的总体目标是发现和鉴定长片段相关的 DNA 伴侣。这是通过固定、细胞裂解和第一种限制性内切酶消化 DNA，然后连接以产生由两个相关基因片段组成的嵌合 DNA 来实现的。在第二次限制性消化后，将接头添加到嵌合 DNA 中 为了促进其扩增，然后使用接头和诱饵 DNA 特异性引物进行 PCR 扩增，以获得足够量的相关 DNA 片段 根据扩增的 DNA 片段的序列分析，获得的结果显示长程相关 DNA 伴侣与诱饵 DNA。

与染色体确认捕获或三个 C 等现有方法相比，该技术的主要优点是 A-C-T-S-A 可用于有效识别未知的长距离相关 DNA 伴侣。而 3 个 C 的出现只是为了验证先前可疑的交互。为了开始这种方案培养，人类细胞在培养箱中加入 37 摄氏度的 5% 二氧化碳，直到它们达到 80% 至 90% 汇合。

人舞会酸性白血病细胞用于此演示。将细胞倒入 50 mL的NOC管中，以1200 RPM离心15分钟，收集细胞。离心后，通过抽吸去除培养基。

加入 5 毫升培养基以重悬细胞沉淀。用血细胞计数器计数细胞后，用含有 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基取大约一乘以 10 至第七个细胞至体积为 40 毫升。然后加入 1.7 毫升 37% 甲醛以固定稀释的染色质。

将样品在室温下孵育 10 分钟，轻轻摇动。孵育后，用 2.4 mL 双摩尔甘氨酸淬灭反应。接下来，将样品以 1200 RPM 和 4 摄氏度离心 15 分钟。

去除超级尼丁后，用 40 毫升冰冷的 PBS 洗涤沉淀一次，然后离心样品以回收洗涤后的细胞沉淀，将所得沉淀重悬于 40 毫升冰冷的裂解缓冲液中，加入新鲜添加的蛋白酶抑制剂和 0.1 毫摩尔 PMSF，在冷藏室中旋转孵育样品 90 分钟。最后，将样品以 2， 500 RPM 离心 15 分钟，去除超级 natin 并获得分离的细胞核。重新将细胞核悬浮在 0.5 毫升的 1 XNEB 缓冲液 3 中，并添加 15 微升 10% SDS。

将样品在 37 摄氏度下振荡孵育 1 小时。然后加入 45 微升 20% Triton X 100 以隔离 SDS，并在 37 摄氏度下再次孵育 1 小时，振荡并分装 1 乘以 10 至 6。细胞核或约 15 μg 用于限制性内切酶消化至 55 μL 细胞核溶液。

加入 433 微升 1 XNEB 缓冲液 3 和 12 微升 BGL 2。要使总消化反应体积为 500 升，请将反应在 37 摄氏度下孵育过夜。第二天，通过添加 95 微升 10% SDS 使限制性内切酶失活，并通过在 65 摄氏度下加热 20 分钟使酶变性。

在水浴中，加入 7 毫升 1 x 连接缓冲液和 360 微升 20% Triton X 100。将样品在 37 摄氏度下孵育 1 小时。将温度降低到 16 摄氏度，并添加 50 微升，每微升 400 个单位。

T 四 DNA 连接酶。让连接反应在 16 摄氏度下孵育 4 小时，然后在室温下孵育 30 分钟。连接完成后，加入 300 μg 蛋白酶 K，并在 65 摄氏度下孵育过夜。

然后加入 5 微克 RNAA，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。通过苯酚氯仿提取纯化 DNA，并在异丙醇中沉淀 DNA，将沉淀的 DNA 溶解在 150 μL 无菌蒸馏水中。要向嵌合 DNA 中添加接头，首先将 2 微克纯化的 DNA 与 5 个单位的 msp 一起孵育，其中 1 个在 37 摄氏度下消化 4 到 6 小时，在 65 摄氏度下灭活 MSP 10 分钟。

然后用 1 微升 5 毫克/毫升的乙醇沉淀 DNA。糖原将所得的 DNA 腭溶解在 50 μL 无菌蒸馏水中。接下来，将 50 μL MSP、1 个处理过的 DNA 与 2 μL 的 20 μmol 接头寡核苷酸 L 和 1 μL 的 20 μmol 寡核苷酸 S 混合，然后加入 1 μL 无菌蒸馏水和 6 μL 10 XT 4 DNA 连接酶缓冲液。

用液体蜡覆盖混合物。将寡核苷酸在 50 摄氏度下变性 1 分钟，然后以每分钟 0.5 摄氏度的梯度逐渐冷却至 10 摄氏度。使用热循环仪，每微升添加 1 微升 400 单位的 T 4 DNA 连接酶，并在 15 摄氏度下孵育反应过夜。

第二天，使用 kaya 快速 PCR 纯化试剂盒纯化接头连接的 DNA，并在 50 μL 无菌蒸馏水中洗脱。为要研究的 DNA 特定区域选择引物以进行长距离相互作用。在这个例子中，Abel 将用作引物或诱饵。

通过将 1 微升纯化的 DNA 与一微升 20 微摩尔的特异性引物 46 56 和一微升 20 微摩尔接头特异性引物 29 63 混合，制备用于第一轮 PCR 的纯化 DNA。然后加入 3 微升 3 x ClinTech，DNA 聚合酶 1 混合物，该混合物之前已根据书面方案与 32 P-D-C-T-P 混合，然后加入 3 微升无菌蒸馏水。PCR 循环完成后，使用书面方案中描述的热启动 PCR 热循环进行 PCR 扩增。

使用 kaya 快速 PCR 纯化试剂盒纯化第一轮 PCR 产物，在 30 微升无菌蒸馏水中洗脱。使用稀释 100 倍的第一小升 PCR 产物进行第二轮 PCR，方法是添加一微升 20 微摩尔能够的特异性引物 46 26 和一微升 20 微摩尔接头特异性引物。29 61.

再次加入 3 微升 3 x ClinTech、DNA 聚合酶、1 种混合物和 3 微升无菌蒸馏水。使用 25 个 95 摄氏度循环周期 20 秒的热循环计划执行第二轮 PCR。67 摄氏度持续 40 秒，72 摄氏度持续 1 分钟，然后延长至 72 摄氏度持续 5 分钟。

通过运行 5% 尿素页面凝胶，然后在磷酸化成像仪中扫描曝光的屏幕来观察 PCR 产物。通过将凝胶条带溶解在含有 60 μL 无菌蒸馏水的 einor 管中，并在 95 摄氏度下孵育 5 分钟，可以从凝胶中回收每个 PCR 条带。离心机。溶解的凝胶产物以 10， 000 RPM 短暂反应 10 秒。

收集所有样本。取出 1 微升，用作 DNA 模板，用于进行 PCR 和引物修复。29 61 46 26.

使用与上述相同的条件，纯化和测序后，可以使用在线工具进行分析以确定染色体位置。到达基因组生物信息学位点后，单击 blatt 生成一个新窗口并粘贴 DNA 序列。提交 DNA 序列后，将出现 BLATT 搜索结果。

单击具有 100%identity 的点击上的浏览器以显示 DNA 序列的位置。able one 区域被用作诱饵来确定其长程 DNA 相互作用。在第二轮 PCR 引物组中，选择 2 个 BGL 2 位点和 1 个 BAM H 1 位点进行 A CT 测定，46 26 29 61 用于扩增 M1,46.30 29 61 用于 M 2,46、36 29 61 用于 M 3。

典型的凝胶模式显示一到几个条带，如图所示，这里显示了 able M1、able M 2 和 able M 3。可克隆 M1 的 DNA 序列显示，来自 A CT 测定的每个片段由两个组合的 DNA 片段组成。一个片段来自诱饵 DNA 区域，而第二个片段来自相关的伙伴。

这些片段通过第一限制性内切酶识别序列相互连接。第二个酶识别序列将出现在相关伴侣序列的末尾。克隆的 ABLE M1 片段包含来自位于第九号染色体 Q 32.4 的 ABLE 一区域的 DNA，相关的伴侣位于三号染色体 P 三，被鉴定为 proc two。

同样，与 3 个 C 测定相比，能 M 2 相关伴侣定位于 5 号染色体 Q 21.1，而克隆能 M 3 被鉴定为 ABLE 1 位点附近的染色体内关联。本视频中概述的方法将选择最普遍的远程交互。然而，通过增加 PCR R 循环的数量，也可以使用印迹和控制区或 IGF 两个 H 19 基因座的 ICR 作为小鼠成纤维细胞中的诱饵 DNA，在小鼠成纤维细胞中应用不同的循环程序在第一轮和第二轮 PCR 中CT 测定。

A CT 检测也可用于识别细胞核结构的差异以及正常细胞和癌细胞之间的远程相互作用。对正常结肠组织和结肠癌组织进行匀浆，并按照本文描述的程序进行 A CT 测定。这里显示的是 IGF 两个 H 19 位点和 IGF 两个基因 dpn 处 ICR 区域的 DNA 结构。

A CT 测定的两个位点被标记，第二轮 PCR 中使用的引物用不同颜色的箭头和数字标记。A CT 测定的凝胶模式表示使用引物 29 61 和引物对 41、61、41、63、51 45 和 51 51 的 PCR 结果。仅在正常结肠组织中出现的独特条带用黄色箭头标记，而那些只出现在结肠癌组织中的条带在发展后用红色箭头标记。

这项技术为市场生物学领域的研究人员以三维方式探索核结构和基因调控铺平了道路。