研究膜蛋白的构象动力学 原位 采用位点特异性荧光标记

本实验的总体目标是通过在单个细胞表面进行位点特异性荧光标记，研究膜蛋白的构象动态变化。首先，在胞外区与跨膜区交界处选择特定残基，将其单独突变为半胱氨酸（如红色C所示）。随后需确定该残基是否可被半胱氨酸反应性荧光染料标记。实验的第二步是检测半胱氨酸突变以及荧光染料标记是否影响蛋白的动力学行为和/或构象状态。

此操作使用所示装置进行。该实验步骤的第三步是对比分析荧光强度的变化与目标蛋白的动力学参数。此处展示了一条典型的荧光曲线。

该实验步骤的最后一步是用供体荧光染料或供体-受体荧光染料标记突变的半胱氨酸对，以在进行电压钳测量的同时测定光漂白速率，从而确定距离限制。该图显示了不存在受体时的供体光漂白速率（黑色），存在受体时的供体光漂白速率（红色）。最终，可以获得结果显示荧光强度的变化（由蛋白质构象变化引起）可通过电压钳荧光法与膜蛋白功能相关联。

该方法有助于解答膜离子转运领域中的关键科学问题，例如蛋白质构象状态的变化如何促进小分子和离子跨质膜的转运。首先，将钠钾泵克隆至适用于 Xenopus 卵母细胞表达的载体中。下一步，根据随附文章所述，在跨膜区与胞外区结构域交界处的特定残基上引入半胱氨酸突变。

完成操作后，按照随附文章所述，将血浆DNA转录为mRNA，并通过DNA测序验证突变的插入；手术前使用分光光度计定量mRNA产量。手术前应使青蛙禁食12小时，以防止术中呕吐。次日开始手术时，将青蛙浸入麻醉溶液中，直至其对脚趾夹捏无反应为止。

将青蛙从麻醉液中取出，腹面朝下放置在尿垫的吸水面上。用湿润的纸巾覆盖青蛙以保持其湿润。此外，如果青蛙的眼睛是睁开的，需用生理盐水保持其湿润。

在青蛙中线的一侧做一个小的皮肤切口。找到卵巢并将其移至青蛙体外。避免让卵巢接触皮肤。

取出卵巢并将其置于含有林格液的培养皿中。在将组织放回腹腔之前，检查剩余组织是否有出血。如果发生出血，用无菌棉签施加压力直至止血。

使用间断缝合法缝合切口以完成手术。用剪刀将青蛙放回饲养环境中，使其从麻醉状态中恢复。将分离的卵巢叶分成更小的部分。

将团块转移至含钙的任氏液中，并加入胶原酶。随后，在18摄氏度下轻轻振荡消化液两小时。当大部分细胞已分离后，用不含钙的任氏液洗涤卵母细胞。

然后将卵母细胞在室温下置于不含钙的林格溶液中孵育10分钟。随后，用含钙林格溶液充分洗涤卵母细胞。接着将卵母细胞转移至含钙林格溶液中，于注射前进行储存。

下一步，从负20摄氏度冰箱中取出合成的mRNA。将25纳克mRNA加入至终体积为50纳升。然后将mRNA注射到受精卵的胞质中。

将卵母细胞置于含有1毫克/毫升庆大霉素的林格溶液中，在18摄氏度避光条件下孵育3至7天。此过程可使钠钾泵在卵母细胞质膜中表达。实验当天，从培养箱中取出卵母细胞，先放入加样缓冲液中孵育45分钟，随后转移至后加样缓冲液中继续孵育45分钟。

这会提高细胞内钠离子浓度，以利于测量钠钾泵活性。进行荧光检测时，在含有五微摩尔目标荧光染料（如 TMRM 或 FM）的染色后缓冲液中，避光孵育细胞 5 至 10 分钟。完成 Flora Four 标记后，用不含染料的染色后缓冲液充分洗涤卵母细胞。

将卵母细胞避光保存，以防止光漂白。在准备进行双电极电压钳测量时，首先用 3 摩尔氯化钾填充微电极，并测试其电阻，电阻值应在 0.5 至 1.5 兆欧之间。

进行半胱氨酸扫描实验时，在荧光显微镜上配备5 35 DF 50激发滤光片、5 65 EFLP发射滤光片和五 70 DRLP二向色镜。接着，将卵母细胞置于荧光显微镜载物台上的RC 10灌流 chamber中。然后，利用放大器将膜电位维持在恒定值，同时小心地将两个微电极插入卵母细胞内。

通过使用适当的手段（如溶液交换或改变膜电位）激活蛋白质，测量跨膜离子流。对于同步荧光检测，采用100瓦钨灯光源激发供体荧光团，并使用光电DDE检测荧光标记的荧光强度变化。在完成半胱氨酸扫描后进行上述操作。

使用 P clamp 10 软件控制的电压阶跃，测量在恒定电流下荧光强度的变化。该方案的第二部分包括同时进行无应变测量和距离测量。为了计算 kappa 平方值的范围，无应变测量可反映荧光基团因旋转而产生的相对移动性。

有关计算的详细信息，请参见配套文章。为测量距离限制，使用含有两个可及的细胞外半胱氨酸残基的全酶，并用荧光染料进行标记。加入含有1 µM FM和4 µM TMRM的上样后缓冲液。

这是供体和受体。将荧光染料以四比一的比例加入一批卵母细胞中，仅添加一微摩尔的FM。这只是供体的荧光染料。

将四个卵母细胞加入另一批卵母细胞中，将两批卵母细胞在避光条件下冰上孵育30分钟。这一步骤可实现对有或无受体荧光团标记的空心酶进行测量。接下来，为显微镜配备475 DF 40激发滤光片、530 DF 30发射滤光片以及505 DRLP二向色镜。

然后将卵母细胞置于荧光显微镜载物台上的腔室中。在有或无受体荧光团存在的情况下，保持溶液持续流动，测量供体漂白的时间依赖性。这些结果可用于利用福斯特共振能量转移（Förster's）计算钠钾泵上两个残基之间的距离。

应同时进行双电极电压钳测量，以确保蛋白质具有功能。使用P Clamp 10中的钳制X功能，对供体荧光染料四的光漂白结果进行平均，至少需记录四个不同位点的数据。为测量蛋白质亚基的相对运动，应使用包含受体和供体荧光染料四的双半胱氨酸构建体。

这些残基处的荧光强度对蛋白质的构象状态不敏感，将取决于两个荧光基团之间的距离。接下来，将显微镜的滤光片组更换为475AF40激发滤光片、595AF60发射滤光片以及505DRLP二向色镜。然后将含有样品的腔室置于荧光显微镜载物台上。

接下来，使用100瓦的钨光源激发供体，并采用适当方法（如电压钳、配体结合或溶液置换法）测量受体Fluoro four的荧光强度。通过激活膜蛋白，同时检测荧光强度的变化。该图显示了跨细胞膜离子转运与荧光强度变化之间的相关性。

上方曲线显示了在含有钠测试溶液和钾测试溶液的条件下，分别在10微摩尔和10毫摩尔ing存在时的电流钳测量结果。下方曲线显示了与电流钳测量同步测得的荧光强度变化。该图显示了两个用TMRM标记的卵母细胞，TMRM为受体荧光染料。

左侧的卵母细胞表达野生型钠钾ATP酶，而右侧的卵母细胞表达含有一个可接近的半胱氨酸残基的钠钾ATP酶。该图的上部曲线显示了电压脉冲下的瞬时电流数据，下部曲线显示了电压脉冲下荧光强度变化的实时记录。

该图显示了光漂白的时间依赖性，即在有无受体荧光素四存在的情况下测量供体光破坏的速率；在没有受体荧光素四时，光漂白发生得更快。每条曲线均为四个观察位点记录的平均值。该图显示了构象变化时亚基的相对运动。

红色轨迹显示荧光变化，黑色轨迹显示电流流动。左侧荧光强度的增加表明荧光标记物之间的距离变近。中间荧光强度无变化表明荧光标记物之间的距离保持不变。

右侧显示的荧光强度降低表明，在进行该操作时，Fluor四聚体之间的距离增大。需要注意的是，应将动力学和稳态荧光强度的变化与蛋白质的构象变化相关联。