研究膜蛋白的构象动力学原位网站的荧光标记

我们将介绍一种方法，措施以及具体站点的使用对单个细胞的荧光的构象变化的分析膜蛋白的离子转运的动力学。这种技术是适应离子通道，转运和离子泵并可以被用来确定蛋白亚基之间的距离限制。

该程序的总体目标是利用单细胞表面的定点荧光标记来检查膜蛋白的确认动力学。这是通过首先将细胞外和跨膜结构域界面上的残基单独突变为胱氨酸来实现的，如红 C.It 所示，然后需要确定该残基是否可以用胱氨酸反应的氟 4 标记。该程序的第二步是检查胱氨酸、诱变和/或氟 4 标记是否影响蛋白质的动力学和/或确认状态。

这是使用所示的设置执行的。该程序的第三步是将荧光强度的变化与目标蛋白的动力学参数进行比较和对比。此处显示了典型的荧光迹线。

该程序的最后一步是用供体 Fluor fours 或供体受体 Fluor fours 标记突变的半胱氨酸对，以测量光破坏率，同时进行电压钳测量以确定距离限制。该图显示了没有受体时的供体照片销毁率（黑色），在受体存在的情况下供体照片销毁率（红色）。最终，可以获得结果表明荧光强度的变化（蛋白质确认变化的结果）可以通过电压钳荧光法与膜蛋白功能相关联。

这种方法可以帮助回答膜离子转运领域的关键问题，例如蛋白质确认状态的变化如何促进小分子和离子跨质膜的转运。通过将钠钾泵克隆到适合 xop posts、Lavis 卵母细胞表达的载体中来开始该过程。下一步是在位于跨膜和细胞外结构域之间界面的残基上进行半胱氨酸突变，如随附文章所述。

完成后，如随附文章所述，将血浆 DNA 转录为 mRNA 后通过 DNA 测序验证突变的插入，手术前使用分光光度计定量 mRNA 的产量。青蛙应禁食 12 小时，以防止手术过程中呕吐。要在第二天开始手术，请将青蛙浸入麻醉溶液中，直到青蛙对脚趾挤压没有反应。

从麻醉溶液中取出青蛙，并将其背侧朝下放在尿布垫的吸收面上。将湿纸巾放在青蛙身上，以保持青蛙湿润。此外，如果青蛙的眼睛睁开，请用盐水溶液保持它们湿润。

在青蛙中线的一侧做一个小的 smic 切口。找到卵巢并将其带到青蛙的外部。避免将卵巢接触皮肤。

取出卵巢，将其放入含有林格溶液的培养皿中。在将其放回 smic 腔内之前，检查剩余的组织是否出血。如果发生出血，请用无菌棉签按压直至止血。

通过使用间断缝合模式缝合切口来完成手术。使用剪刀将青蛙放回其外壳以从麻醉中恢复。将分离的卵巢叶分成更小的部分。

将团块转移到林格液中，加入钙和胶原酶。接下来，在 18 摄氏度下轻轻摇晃消化液 2 小时。当大部分细胞分离后，用不含钙的林格溶液洗涤卵母细胞。

然后将卵母细胞在室温下在不含钙的林格溶液中孵育 10 分钟。此时，在林格加钙溶液中彻底洗涤细胞。然后将卵母细胞转移到林格液和钙中，以便在注射前储存。

下一步，从零下 20 摄氏度的冰箱中取出合成的 mRNA。加入 25 ng mRNA，最终体积为 50 ng。然后在注射后将 mRNA 注射到细胞中。

将卵母细胞置于林格溶液和每毫升 1 毫克庆大霉素中，并在 18 摄氏度下避光孵育 3 至 7 天。这使得钠钾泵能够在卵母细胞质膜内表达。实验当天，从培养箱中取出卵母细胞，将其置于上样缓冲液中 45 分钟，然后在上样后缓冲液中放置 45 分钟。

这增加了细胞内钠浓度，以便于测量钠钾泵。对于荧光测量，将细胞在含有 5 微摩尔所需荧光团（如 TMRM 或 FM）的上样后缓冲液中在黑暗中孵育 5 至 10 分钟。菌群 4 标记后，用无染料后缓冲液彻底洗涤卵母细胞。

将卵母细胞置于黑暗中以防止光漂白。为了准备两个电极电压钳测量，首先在微电极中填充三个摩尔氯化钾并测试电阻。电阻应在 0.5 到 1.5 兆欧姆之间。

对于半胱氨酸扫描实验，为荧光显微镜配备一个 5 35 DF 50 激发滤光片、一个 5 65 EFLP 发射滤光片和一个 5 个 70 DRLP 双光镜。接下来，将八倍体放入荧光显微镜载物台上的 RC 10 腔室中。然后使用放大器将两个微电极轻轻插入八缸体中，以将膜电位保持在恒定值。

通过使用适当的技术（如溶液交换或改变膜电位）激活蛋白质来测量穿过膜的离子通量。对于同时进行的荧光测量，使用 100 瓦钨光源激发供体荧光团，并针脚 0 2 2，A 光 DDE 检测荧光强度的变化以进行荧光标记。半胱氨酸扫描后。

使用由 P clamp 10 软件控制的电压步长测量稳态电流下荧光强度的变化。该协议的第二部分涉及在距离测量的同时进行 anes 熵测。为了计算 kappa 平方值的范围，atropy 测量由于旋转而导致的荧光 4 的相对迁移率。

有关计算的详细信息，请参阅随附的文章。要测量距离限制，请使用全息酶，它有两个可接近的细胞外半胱氨酸残基，可以用荧光四分体标记。添加含有 1 微摩尔 FM 和 4 微摩尔 TMRM 的上样后缓冲液。

那就是施主和接受者。对 1 批卵母细胞的荧光 4 仅添加 1 微摩尔 FM。那只是供体荧光。

四到另一批卵母细胞在黑暗中将两批卵母细胞在冰上孵育 30 分钟。这允许对标记有和没有受体氟 4 标记的 hollo 酶进行测量。接下来，为显微镜配备一个 4 75 DF 40 激发滤光片、一个五个 30 DF 30 发射滤光片和一个 5 0 5 DRLP 二向色镜。

然后将卵母细胞放入荧光显微镜载物台上的腔室中。保持连续的溶液流测量在受体菌群存在和不存在的情况下供体漂白的时间依赖性。四。这些结果可用于计算使用 forester's 的钠钾泵上两个残留物之间的距离。

应同时进行方程式 2 电极电压钳测量，以确保蛋白质功能正常。使用 P clamp 10 中的夹 X 功能，对供体荧光 4 的照片破坏结果进行平均，至少四个 oh 位点记录。为了测量蛋白质亚基的相对运动，使用包含受体和供体氟四离子的双半胱氨酸构建体。

这些残基的荧光强度对蛋白质的确认状态不敏感，并且是两个 4 之间距离的函数。接下来，将显微镜中的滤光片组更改为 4 75 a F 40 激发滤光片、5 95 a F 60 发射滤光片和 5 0 5 DRLP 二向色镜。然后将 OI 放入荧光显微镜载物台上的腔室中。

接下来，用 100 瓦钨丝光源和受体的荧光强度激发供体。使用适当的方法（如电压配体或溶液交换）测量荧光 4，激活膜蛋白并同时测量荧光强度的变化。该图显示了离子穿过细胞膜的传输与荧光强度变化的相关性。

上部迹线显示了在钠试液和钾试液存在下，在 10 微摩尔和 10 毫摩尔存在下的电流钳测量。下部迹线显示测得的荧光强度变化与电流钳测量值同时发生。该图显示了两个用 TMRM 标记的卵母细胞，即受体氟 4。

左侧的卵母细胞表达野生型钠钾 atpa，而右侧的卵母细胞表达钠钾 APA，带有一个可接近的半胱氨酸残基。该图的上部轨迹显示了电压脉冲上的瞬态电流数据。下部迹线显示荧光强度随电压脉冲变化的实时记录。

该图显示了在受体氟 4 不存在和存在的情况下测量光漂白供体光销毁的时间依赖性，在没有受体氟 4 的情况下，光漂白发生得更快。每条跟踪是 4 次 oh site 录音的平均值。该图显示了确认变化时的相对亚基移动。

荧光变化显示在红色迹线中，电流显示在黑色迹线中。左侧显示的荧光强度增加表明植物群地板靠得更近。中间显示的荧光强度没有变化表明 Fluor 4 距离保持静止。

右侧显示的荧光强度降低表示 Fluor 四分体在尝试此过程时进一步分开。重要的是要记住将动力学和稳态荧光强度的变化与蛋白质的确认变化相关联。