Name: 使用动态面膜投影光刻系统的神经文化Micropatterned水凝胶的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-11T23:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 6 s
Description: 学习使用数字微镜器件动态掩模投影光刻技术制备微图案化双水凝胶神经培养系统，用于研究神经元存活与神经突生长。该方法可快速创建灵活的几何构型。

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作者谨此感谢 Anthony Windebank 教授实验室在背根神经节解剖与培养技术方面的专业指导，同时感谢 Shaochen Chen 教授在 DMD 装置设置方面的有益讨论。本研究部分由杜兰大学、路易斯安那州立大学董事会（LEQSF[2009-10]-RD-A-18）以及美国国立卫生研究院（NIH，项目编号 NS065374）提供的资助支持。

1. DMD 设置
<ol>
	<li>将DMD板、紫外光导（带准直器）和4倍物镜垂直安装在隔振台上。</li>
		<li>应调节紫外光导，使光线以相对于镜面平面45°、且低于镜面平面24°的角度照射到微镜阵列上（图1）。</li>
		<li>安装物镜时，需使DMD到物镜的距离等于该物镜对应的焦距。</li>
		<li>在物镜下方放置一台倒置显微镜，以便通过显微镜观察DMD反射的聚焦光。物镜到聚合表面的距离应大致等于物镜的工作距离。随后可利用显微镜的载物台调节此距离，以精细聚焦图像。该距离可能因所选聚合表面的不同而有所变化。</li>
</ol>
2. 用于组织外植体培养的双水凝胶结构
A. 背根神经节外植体黏附
<ol>
<li>使用Rain-X处理6孔胶原蛋白包被的细胞培养小室（Corning）的壁面，注意避免接触膜本身。（也可使用疏水屏障笔。）</li>
<li>在37 °C、5% CO2的培养箱中，用1.5 mL黏附培养基对小室进行过夜水化。黏附培养基为含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、0.5 mM L-谷氨酰胺和20 μg/mL NGF的Neurobasal培养基。</li>
<li>从E-15大鼠胚胎中分离背根神经节（DRG）。应将DRG接种至胶原蛋白包被的6孔小室上，每孔最多可接种四个DRG。</li>
<li>将小室孵育2小时，以使DRG黏附于膜上。</li>
</ol>
B. 动态掩模光聚合
数字微镜装置（DMD）是一种由 1024 × 768 个独立微镜组成的阵列，类似于投影电视中所使用的装置，可根据微镜的位置选择性地反射光线。在本实验中，DMD 用于将紫外光（UV）投射至光交联水凝胶上，从而以简单且快速的方式生成特定的水凝胶几何结构。图1展示了DMD装置与紫外光光路的设置。尽管我们的DMD为独立设备，该装置亦可集成至多种现有显微镜系统中使用。
<ol>
<li>移除小室中的所有过量液体，并加入 500 μL 插入物内聚合介质的量。聚合介质包含10% PEG（分子量1000）和0.5% Irgacure 2959，溶解于添加有神经基础培养基的溶液中 20 μg/mL NGF 和 1% 青霉素/链霉素</li>
<li>将插入片段置于经Rain-X处理的玻璃载片上的DMD装置下方。</li>
<li>使用配套的 ALP-3 基础图形用户界面程序，将适当的黑白图像作为“光掩模”加载至数字微镜器件（DMD）上。本实验中选用分叉形状，以实现神经突导向系统的构建。</li>
<li>使用倒置显微镜进行观察，通过数字微镜器件（DMD）反射的可见光源，将组织外植体与光掩模上的相应位置对齐。</li>
<li>切换可见光源为紫外光源，照射 PEG 溶液直至交联充分。（在给定条件下，5.0 Watts/cm2 入射到DMD上，交联可在短至55秒内完成。对插入物上的全部四个DRG重复此步骤。</li>
<li>用无菌 DPBS 和 1% 青霉素-链霉素溶液对每个插入物冲洗三次。</li>
<li>在细胞培养插件下方加入 1.5 mL 培养基，放入培养箱中平衡 30 分钟。培养基为含有 2% B-27、1% 青霉素/链霉素、0.5 mM L-谷氨酰胺的神经基础培养基，并 20 μg/mL NGF</li>
</ol>
C. 二次水凝胶
Puramatrix
<ol>
<li>用于神经元实验时，将1% Puramatrix 按照生产商说明用无菌 H2O 稀释至0.15%，并添加1 μg/mL 可溶性层粘连蛋白（laminin）。</li>
<li>使用无菌棉签、Kimwipe 或微量移液器，将含有DRG外植体的PEG空腔中所有多余培养基完全移除。</li>
<li>用微量移液器向PEG空腔中加入Puramatrix，以填充空隙但不溢出。根据空腔体积，通常每个结构使用约1 μL。</li>
<li>Puramatrix在接触生理盐溶液（即溶胀的PEG）后立即开始自组装过程，但为确保完全凝胶化，需在插入物下方加入1.5 mL生长培养基，并将培养体系置于培养箱中孵育1小时。</li>
<li>初始状态下Puramatrix略呈酸性，因此在1小时后更换培养基，以使pH达到平衡。</li>
<li>培养基更换频率约为每48小时一次。操作时需注意将所有培养基添加至插入物下方，以保护机械强度较弱的Puramatrix结构完整性。</li>
</ol>
琼脂糖
<ol>
<li>用于神经元实验时，将琼脂糖用培养基稀释成1%溶液，并置于60 °C水浴中，直至琼脂糖完全溶解（约1小时）。随后向溶液中添加1 μg/mL可溶性层粘连蛋白。</li>
<li>必须将PEG空腔中的所有过量培养基完全移除。</li>
<li>将琼脂糖加入PEG空腔中，以填充空隙且不溢出。根据空腔体积，通常每个结构使用约1 μL。</li>
<li>在6孔板中预先冷却1.5 mL培养基至8 °C，将含有琼脂糖的插入物转移至预冷的培养基中，并在8 °C冰箱中至少维持3分钟，以使琼脂糖凝胶化。</li>
<li>最后，将插入物转移至1.5 mL预热的培养基（37 °C）中，并在37 °C培养箱中孵育，每48小时需更换一次培养基。</li>
</ol>
3. 双重水凝胶三维细胞包封
当使用任何可自组装凝胶时，双重水凝胶包封法均适用。在此案例中，光交联凝胶（如聚乙二醇，PEG）可为自组装凝胶（例如 Puramatrix 或琼脂糖）提供结构支撑，以实现其几何形态的呈现。某些实验方法，特别是凝胶类型和光掩模的选择，将取决于具体的应用需求。
<ol>
<li>在数字微镜器件（DMD）上加载合适的掩模。针对我们的应用——细胞存活实验，我们仅选择Puramatrix的圆柱形呈现方式，以利于细胞成像。研究细胞信号传导的研究人员可能会对分隔式几何结构感兴趣，以便化学趋化分子的扩散。此外，已有研究展示了一种动脉的粗略模拟结构，表明该技术在血管研究中的潜在应用。</li>
<li>用Rain-X处理聚酯细胞培养小室的壁面，并将其置于经Rain-X涂层处理的载玻片上的DMD下方。</li>
<li>向小室中加入500 μL聚合介质。通过紫外光照射55秒诱导PEG交联。</li>
<li>用无菌DPBS和1%青霉素-链霉素溶液洗涤三次。</li>
<li>从PEG的空腔中彻底去除所有多余培养基。</li>
<li>将细胞以所需密度离心形成沉淀。在混合前必须小心彻底去除细胞沉淀中的所有培养基，因为Puramatrix一旦接触盐溶液便会立即开始自组装。将细胞重悬于0.15% Puramatrix中，该溶液用无菌H2O配制并添加10%蔗糖。</li>
<li>将Puramatrix/细胞/蔗糖混合物注入PEG内的空腔中。</li>
<li>在小室下方加入1.5 mL生长培养基，并在培养箱中孵育1小时使其凝胶化。</li>
<li>1小时后更换培养基，之后大约每48小时更换一次。</li>
</ol>
4. 单一水凝胶三维细胞包封
对于能够在光交联水凝胶内部进行观察的细胞，单次水凝胶包埋即可适用。
<ol>
<li>在DMD上加载适当的掩模。对于细胞存活研究，我们再次选择基本的圆形掩模来代表圆柱体。针对特定的研究领域，也可再次应用方法4中所示的类似掩模。</li>
<li>用Rain-X处理聚酯细胞培养插入物，并将其置于涂有Rain-X的载玻片上的DMD下方。</li>
<li>可将任意所需浓度的细胞直接加入10% PEG溶液中，充分混匀以确保均匀分布。</li>
<li>向插入物中加入500 μL聚合介质，通过暴露于紫外光下55秒诱导PEG交联。</li>
<li>用无菌DPBS和1%青霉素-链霉素溶液洗涤三次。</li>
<li>在插入物下方和上方均加入培养基，每约2天更换一次。</li>
</ol>
5. 薄膜水凝胶聚合
<ol>
<li>在DMD上加载适当的掩膜。</li>
<li>用Rain-X处理经胶原蛋白包被的聚酯细胞培养插入物，并将其放置在涂有Rain-X的载玻片上。</li>
<li>加入足够的聚合介质，使其刚好覆盖插入物底部（对于6孔板插入物，约为250–300 μL）。在室温下孵育30–45分钟，使介质充分渗透插入物膜。</li>
<li>用微量移液器或Kimwipe去除插入物中多余的聚合介质。加入足量的紫外透明油，完全覆盖插入物底部。在室温下静置15–30分钟，直至油相在已饱和插入物膜的聚合介质上方形成清晰的分层。</li>
<li>将插入物和载玻片置于DMD下方。通过紫外光照射诱导PEG交联。由于PEG层较薄，在DMD表面入射光强为5.0 Watts/cm2时，交联可在短至15秒内完成。</li>
<li>用无菌DPBS和1%青霉素-链霉素溶液洗涤插入物三次。（若需去除油性残留物，可在洗涤缓冲液中加入1% Tween 20等温和去污剂。）</li>
<li>将插入物储存于6孔组织培养板中。向悬浮细胞中加入所需浓度的生长培养基，并用移液器将适量细胞悬液加入细胞培养插入物内，以达到目标细胞密度。然后，在插入物下方加入足量生长培养基以完全维持细胞活力（约1.5 mL）。</li>
<li>48小时后，用无菌DPBS和1%青霉素-链霉素溶液洗涤插入物三次，以去除未贴壁的细胞。每约48小时更换一次培养基。</li>
</ol>
6. 典型结果
图2展示了包含背根神经节（DRG）外植体的双层水凝胶结构示例。请注意，细胞迁移和神经突延伸仅限于双层水凝胶结构中允许细胞生长的区域。图3显示了以类似方式包封在双层水凝胶结构内的解离细胞。由于DMD数字光掩模具有动态特性，包封结构的几何形状仅受限于光学系统的尺寸和分辨率。细胞也可包封于单一光聚合水凝胶聚乙二醇（PEG）中，并进行了活/死细胞活力检测，结果如图4所示。PEG中的包封仅作为示例，因为PEG并非神经细胞的理想环境，因此我们在PEG结构中观察到的细胞活力较低是可理解的。最后，图5展示了利用薄层PEG膜作为细胞培养插件上细胞黏附的图案化限制层的示例。此外，图6提供了可能出现的“不良”结果示例。
这些结果仅展示了我们实验室所开发方法可能应用范围的一小部分。其目的在于证明本方法的简便性、多功能性及可行性，可作为“原理验证”，供研究人员开发各自可能的改进应用。
<img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig1.jpg" alt="紫外光聚合装置示意图，包含DMD、物镜和投影光掩模。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 光刻所用光路的示意图。插图：紫外光以45°角照射DMD，位于镜阵列平面下方24°处。
<img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig2.jpg" alt="微流控装置结果；细胞迁移；荧光显微镜；多通道；生物学分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 含有双水凝胶结构的背根神经节（DRG）中细胞生长与增殖的标记结果。A-D) 显示聚合的聚乙二醇（PEG）结构（灰色），其中神经突用 Beta III 微管蛋白标记（绿色），细胞核经 DAPI 染色（蓝色）。DRG 外植体包含在 Puramatrix 中，并位于图案的圆形区域，神经突朝向分叉处生长。
<img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig3.jpg" alt="显示具有不同形状的微图案化水凝胶的荧光显微镜图像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 在生长培养基中培养48小时后，含有用钙黄绿素AM（一种活细胞标记物）标记细胞的双层水凝胶结构。A-D) 各种PEG形状，内含分散的背根神经节神经元（约5×103 个细胞/mL）的Puramatrix填充物。
<img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig4.jpg" alt="荧光显微镜图像，细胞组分，200 µm 比例尺，生物成像，细胞分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. 单个水凝胶结构在生长培养基中培养 24 小时后，活细胞用 Calcein AM 标记（绿色），死细胞用乙啶同二聚体-1 标记（红色）（5×103 个细胞/mL）。
<img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig5.jpg" alt="比较细胞结构和分布的荧光显微镜图像；放大倍数 A) 500μm，B) 100μm。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5. 使用“测试图案”将具有细胞限制性的聚乙二醇（PEG）聚合为薄膜，以选择性地使解离的细胞黏附于可渗透支持物的胶原蛋白包被膜上。A、B）活细胞在培养48小时后用Calcein AM（绿色）标记，死细胞则用乙啶同二聚体-1（红色）标记。在含有薄PEG膜的区域，细胞黏附极少发生。
<img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig6.jpg" alt="分支型微流控结构；采用荧光标记的光学显微镜进行流动分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6. 不理想结果的代表性图像。A) PEG 的部分聚合，导致无法使用的 PEG 结构。不完全聚合可能由预聚物介质中存在弯月面、聚合介质用量不足、紫外光照射不足或光学系统聚焦不当引起。B) 图像显示已聚合的 PEG 结构（灰色），神经突以 Beta III 微管蛋白标记（绿色），细胞核经 DAPI 染色（蓝色）。神经突已生长至图案化的 PEG 通道之外。这种情况常发生在注射过程中 Puramatrix 溢出并覆盖在 PEG 区域上方时。

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</ol>

未声明任何利益冲突。

本文所述方法可被任何寻求简单且可重复的细胞培养系统的科研人员使用。理论上，由于可光聚合水凝胶种类繁多，该环境可被定制以适用于任何细胞类型，包括完整的组织外植体。此外，双层水凝胶系统可提高自聚合水凝胶在空间呈现上的控制能力，因为这类水凝胶单独存在时往往形成无定形结构。由此产生的“2.5D”微图案化水凝胶结构，在二维构型中提供了三维基质，支持神经生长，同时便于显微观察。水凝胶聚合所用的基底也可根据需要进行调整，从而在实验设计中实现更精确的控制。我们的方法已针对细胞培养用可渗透支持材料进行了优化，与在玻璃载玻片上聚合相比，细胞存活率更高（图4，未展示玻璃载玻片上的聚合数据）。然而，其他聚合表面可能更适用于不同应用场景，例如用于微流控实验或细胞聚集体形成的玻璃载玻片上的结构制备。
我们在使用这些培养系统的过程中，识别出了一些潜在的难点。首先，必须采用精细的操作技术以保持构建物的无菌状态。由于DMD装置结构庞大，难以在无菌条件下进行聚合步骤。为解决这一问题，方法部分所述的清洗步骤具有一定帮助，同时所有培养基中均应添加抗生素。此外，聚合后构建物的最终厚度和形状高度依赖于预聚物混合液的流体行为，弯月面的存在可能导致凝胶构建物过薄或聚合不完全（图6）。可采取两个步骤以尽量减少细胞培养插件内部弯月面的形成。对于较厚的水凝胶（&gt;200 μm），仅需在插件内壁简单涂覆一层Rain-X即可。然而，如上文简要所述，对于较薄的构建物（&lt;200 μm），则需要使用油层，以同时抑制弯月面形成并消除自由基聚合过程中氧气的淬灭效应。分辨率与厚度相关，随着凝胶厚度增加，可实现的特征尺寸减小。此外，水凝胶中特征结构为正浮雕或负浮雕时，其分辨率也有所不同。然而，仅使用显微镜物镜作为聚焦光学元件，我们已实现了最小特征尺寸约为100 μm的足够分辨率。
我们的实验表明，此处所述的双水凝胶结构为基本结构的形成提供了优良的基础 体外 神经突生长与导向模型。所采用的微图形化技术是对现有方法的改进18,19，但我们的装置设计强调易于实现，并针对在细胞培养小室上制备双层水凝胶结构进行了优化；细胞培养小室对于提高细胞存活率以及在先前贴壁的组织外植体周围实现交联至关重要。本文展示结果的范围受限于本实验室的研究兴趣；然而，我们相信本论文所述方法将为那些寻求一种相对廉价、快速且易于使用的三维细胞培养模型构建方法的研究人员提供帮助。

<table><tbody><tr><td>数字微镜器件</td><td>Texas Instruments</td><td>DLPD4X00KIT</td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白包被的Transwell可渗透支持膜</td><td>Corning</td><td>3491</td><td>在文稿中也称为细胞培养插入物</td></tr><tr><td>聚酯Transwell可渗透支持膜</td><td>Corning</td><td>3412</td><td>在文稿中也称为细胞培养插入物</td></tr><tr><td>Neurobasal培养基</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>神经生长因子</td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep）</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>B-27添加剂</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Puramatrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇1000（PEG 1000）</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15178</td><td></td></tr><tr><td>光引发剂Irgacure 2959</td><td>Ciba Specialty Chemicals</td><td>0298913AB</td><td></td></tr><tr><td>油</td><td>曾使用菜籽油和硅油</td><td></td><td>需具备紫外透光性，并尽量减少凹面或凸面弯月面的形成</td></tr><tr><td>OmniCure Series 1000</td><td>EXFO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rain-X</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用动态掩模投影光刻技术制备用于神经培养系统的微图案化水凝胶

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

近年来，图案化细胞培养环境正逐渐成为研究细胞特性的相关技术，许多研究人员认为需要采用三维（3D）环境来构建体外（in vitro）实验，以更真实地模拟体内（in vivo）的特性1-3。在癌症研究4、神经工程5、心脏生理学6以及细胞-基质相互作用7,8等领域的研究表明，细胞在传统单层培养与三维结构中的行为存在显著差异。
水凝胶因其种类多样、用途广泛，并可通过功能化修饰定制分子组成，而被用作三维环境9-12。目前已存在多种构建细胞支持基质的技术，包括静电纺丝13、弹性体印章14、喷墨打印15、加成光图案化16、静态光掩模投影光刻17以及动态掩模微立体光刻18。然而，这些方法通常涉及多个制备步骤，和/或需要难以与常规细胞和组织培养方法兼容的设备。本实验方案所采用的技术改进了后两种方法，利用数字微镜装置（DMD）生成动态光掩模，通过紫外光引发的自由基聚合反应，交联具有特定几何形状的聚乙二醇（PEG）水凝胶。所形成的“2.5D”结构为神经生长提供了受控的三维环境。我们采用双水凝胶策略，其中PEG作为限制细胞进入的区域，为原本无固定形状但允许细胞生长的自组装凝胶（由Puramatrix或琼脂糖制成）提供结构支撑。该方法是一种快速、简便、一步完成的制备工艺，具有高度可重复性，并可轻松适配于常规细胞培养方法和基底材料。
完整的组织外植体（如胚胎背根神经节（DRG））可被整合到双层水凝胶结构中，用于 neurite outgrowth 等实验检测。此外，解离的细胞可包埋于光交联或自聚合水凝胶中，或通过细胞限制性光图案化技术选择性地黏附于可渗透支撑膜上。利用 DMD，我们制备了厚度达约 ~1 mm 的水凝胶结构，但薄层（&lt;200 μm）PEG 结构受限于自由基聚合反应中的氧气淬灭效应。随后，我们开发了一种在聚合液体上方覆盖一层油的技术，从而实现了薄层 PEG 结构的聚合。
在本方案中，我们描述了快速构建用于微加工神经细胞和组织培养的三维水凝胶系统的方法。本文展示的双层水凝胶结构具有多功能性 体外 可用于神经科学领域涉及细胞存活、迁移和/或神经突生长与导向研究的模型。此外，由于该方案适用于多种类型的水凝胶和细胞，其潜在应用范围广泛且多样。

本文描述了利用数字微镜装置在常规细胞培养基底上进行动态掩模投影光刻，快速制备微加工神经培养系统的简单技术。这些培养系统可能更接近天然生物结构，且所述技术可针对多种应用进行调整。

图案化细胞培养环境正日益成为研究细胞特性的相关技术，许多研究人员认为该方法在……

本实验的总体目标是构建一种用于神经元研究的微图案化双水凝胶细胞培养系统。首先将组织移植物（如胚胎期背根神经节）接种于可渗透的细胞培养插入式培养皿上，随后利用数字微镜装置（DMD）作为动态光掩模，在可光交联水凝胶中创建微图案。随后加入可自组装的水凝胶（如Pure），其中可能含有解离细胞的悬浮液。在进行细胞分析之前，必须经过适当的孵育时间。最终，可以获得结果显示神经元细胞的存活率以及通过DMD定义的特定几何构型所引导的神经突向外生长。与现有方法相比，该技术的主要优势在于能够快速创建、修改并从远距离投射动态光图案，从而适应几乎任何类型的基底，例如可渗透的细胞培养插入物。尽管该方法可为神经系统研究提供见解，但也可应用于其他需要特定几何约束的系统，例如细胞信号传导、细胞迁移、细胞间接触或形态发生等。DMD 芯片、紫外光源以及四倍物镜均垂直安装在隔振台上。将倒置显微镜置于物镜下方，以便通过显微镜观察来自数字微镜器件（DMD）反射的聚焦光。有关 DMD 装置的更多细节，请参见随附的文字版实验方案。首先，准备六孔胶原蛋白包被的细胞培养小室，用于接收 X 外植体培养物，用 Rain X 涂覆细胞培养小室的壁部，注意避免将 Rain X 涂到膜本身上。然后向插入物中加入 1.5 毫升 aian 培养基，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下过夜培养。第二天，从 E15 大鼠幼崽中收获胚胎背根神经节后，将最多四个背根神经节接种到每个胶原蛋白包被的六孔插入物上，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下孵育 2 小时，以使背根神经节贴附于膜上。孵育期结束后，背根神经节（DRGs）即可进行光聚合。数字微镜装置（DMD）是由1024 × 768个独立微镜组成的阵列，可根据微镜的位置选择性地反射光线。在本实验中，DMD用于将紫外光投射至光敏CROs可交联水凝胶上，从而以简便快速的方式形成特定结构的水凝胶几何形貌。尽管我们的DMD是一个独立的装置，但该设备也可与许多现有的显微镜整合使用。首先，从培养箱中取出DRGX植株，吸除插入物中所有多余的液体，然后向插入物内部加入500 µL聚合化培养基。将带有DRGX植物的插入物转移至一块雨蚀玻璃载玻片上，并将载玻片置于DMD下方。使用ALP三基图形用户界面程序，将用作光掩模的黑白图像加载到DMD上。本实验中选择了一种分叉形状，以便利用倒置显微镜和DI可见光源实现神经突导向系统。利用DMD反射的光线作为引导，将组织外植体与照片掩模上的相应位置对齐。接着，将可见光源切换为紫外光源，照射细胞培养液中的聚合介质。插入直至 PEG 交联完成。对插入物上的每个 DRG 重复此操作。然后用含有 1% 青霉素-链霉素的无菌 dcos 磷酸盐缓冲液洗涤每个插入物三次。最后，在细胞培养插件下方加入1.5毫升培养基，并在37摄氏度、5%二氧化碳的组织培养孵箱中平衡30分钟。在孵育期间，将纯基质超声处理30分钟。为溶解肽段，将提供的1%溶液用无菌水稀释至0.15%，并添加1微克/毫升的可溶性层粘连蛋白。30分钟后，从培养箱中取出培养物，吸除小室中所有多余的培养基。然后在显微镜下观察微孔区域，从小室内含有DRGX的PEG结构的微孔区域中吸除培养基，并将约一微升的纯净基质溶液移入微孔周围的X explant处。确保纯净基质不会溢出微孔区域。然后在插入物下方加入1.5毫升培养基，并将培养物置于37摄氏度、5%二氧化碳的组织培养孵育箱中孵育1小时。为确保孵育结束后完全贴壁，更换培养基，然后将培养物放回孵育箱中。每48小时更换一次培养基。此处展示了包含DRGX植物的双水凝胶结构示例。DRGX植物已针对生长和增殖标志物进行标记。聚合的PEG结构呈灰色，用βIII微管蛋白标记的背根神经节（DRG）神经突呈绿色，而DPI染色的细胞核呈蓝色。请注意，细胞迁移和网状延伸仅限于双水凝胶结构的细胞许可区域。当使用任何自组装凝胶或光交联凝胶时，双水凝胶包封是合适的方法。在此情况下，聚乙二醇（PEG）为自组装凝胶的几何呈递提供结构支撑。例如，纯基质或aris。凝胶的类型和光掩模的选择将取决于特定的应用需求。按照之前已展示的方法，用Rain X处理聚酯细胞培养插件的壁面。将插入物转移至经雨X包被的载玻片上，并置于DMD下方。接着，向插入物中加入500 µL聚合反应培养基。为此项存活实验，在DMD上加载相应的掩模。使用圆柱形的纯基质材料有助于细胞成像。在交联后，将插入物暴露于紫外光下55秒，以诱导 peg 交联。用无菌 DPBS 和 1% 青霉素-链霉素洗涤新形成的空腔。使用微量移液器或无菌棉签从空腔中彻底去除所有多余液体。将Matrixx纯品通过超声处理30分钟进行制备，用无菌水稀释至0.15%，并添加1微克/毫升的可溶性层粘连蛋白和10%蔗糖。接下来，通过离心将待培养的细胞沉淀。彻底吸除细胞沉淀中的培养基，并将沉淀重悬于0.15%的纯基质溶液中，浓度约为每毫升5×10³个细胞。必须将细胞沉淀中的所有培养基完全吸除，因为纯基质在接触盐溶液时即开始自组装。接下来，将约1微升的含细胞补充纯基质混合液移入钉状结构的空隙中。此体积通常足以填充插入物下方1.5毫升生长培养基的空隙，且不会溢出。然后将纯基质次级水凝胶置于37摄氏度、5%二氧化碳的组织培养孵育箱中孵育一小时，以确保完全凝胶化。孵育结束后，吸除培养基，并在插入物下方加入新鲜培养基，注意不要损伤机械强度较弱的纯基质。将培养物放回组织培养孵育箱，并每隔48小时更换一次培养基。以下是活体背根神经节（DRG）神经元被包封在多种双组分水凝胶结构中的示例。在生长培养基中培养48小时后，细胞用钙黄绿素（calcein-AM）进行标记，这是一种呈现绿色的活细胞标记物。由于DMD光掩模具有动态特性，可用于封装的几何形状仅受限于光学系统的尺寸和分辨率。当细胞可在光交联水凝胶内进行观察，且该环境真实模拟聚酯细胞培养条件时，单个水凝胶封装是合适的选择。插入带有rain X的样品，并将其置于经rain X包被的载玻片上的DMD下方。同前，将待培养的细胞用移液器直接加入至聚合培养基中，调整至所需浓度，并充分混匀以确保细胞均匀分布。随后，将500微升的含细胞聚合培养基混合液移入插入式培养小室中。选择合适的掩膜并将其装载到DMD上，通过紫外光照射55秒以诱导PEG交联。进行细胞存活研究时，使用一个基本的圆形掩膜来代表圆柱体，用无菌DPBS和1%青霉素-链霉素溶液将插入物清洗三次，然后在插入物下方加入1.5毫升培养基，并在上方加入足量培养基以完全浸没插入物，于37°C和5%二氧化碳条件下培养，每48小时更换一次培养基。以下是活体解离皮层神经元被包封在peg内的示例。活细胞用钙黄绿素AM标记，呈绿色，而死细胞用碘化丙啶同源二聚体1（Ahy homodimer one）标记，呈红色。聚乙二醇（PEG）中的包封仅作为示例，因为PEG并非神经细胞的理想环境。所选几何结构为研究细胞存活率提供了一种简单方法，但也可适用于多种不同结构。薄层水凝胶可用于生成特定的受限细胞分布模式。再次，如前所述，用Rain X处理聚酯细胞培养小室，并将其放置在经Rain X处理的载玻片上。然后，将250至300微升聚合化培养基加入经处理的细胞培养小室内底部。此体积足以刚好覆盖小室底部，在室温下孵育30至45分钟，使培养基充分渗透小室膜，随后用微量移液器吸除小室中多余的培养基。然后用移液器吸取足量的紫外透明油，加入插入件底部，完全覆盖该区域。将插入件在室温下孵育15至30分钟，时间足以使油在聚合介质上方形成明显的分层。饱和插入膜后，将合适的掩膜加载到数字微镜器件（DMD）上。将插入物和载玻片置于DMD下后，通过暴露于紫外光诱导peg交联。用无菌DPBS和1%青霉素-链霉素溶液洗涤插入物三次；洗涤后，将插入物转移至六孔组织培养板中，收集并离心沉淀待培养的细胞。吸除培养基，用生长培养基重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至每毫升10⁴至10⁶个细胞的所需浓度。然后用移液器吸取足够体积的细胞悬液加入细胞培养小室中，以达到所需的细胞密度。在小室下方加入足量的生长培养基，以完全维持细胞活性。在37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养，孵育48小时后进行后续操作。用无菌 DPBS 和 1% 青霉素-链霉素洗涤插入物三次，以去除任何未贴壁的细胞。然后向孔中加入新鲜的生长培养基。将培养板放回组织培养孵育箱，并每 48 小时更换一次培养基。此处，使用测试图案将具有细胞限制性的聚乙二醇（PEG）聚合为一层薄膜，以选择性地使解离的细胞黏附于多孔支持物的胶原蛋白包被膜上。细胞在孵育48小时后进行标记。活细胞经钙黄绿素（calcein AM）标记后呈绿色，而死细胞经碘化丙啶同源二聚体-1（ethidium homodimer-1）标记后呈红色。可以看出，细胞毒性最小的情况出现在含有其薄层 PEG 膜的区域。这是一个不理想结果的示例。PEG 的部分聚合导致生成了无法使用的 PEG 构建物。由于预聚物介质中存在弯月面、聚合物用量不足、介质不足、紫外线照射不充分或光学聚焦不当，可能导致聚合不充分。这是A-D-R-G-X植物培养物双水凝胶三维包封不良的一个示例。在该图像中可见，以绿色显示的神经突能够生长到图案化柱状通道之外。如果在注射过程中纯基质溢出到 PEG 部分上方，这种情况常常会发生。按照本方案，还可采用其他标准方法，如膜片钳或免疫组织化学，以回答其他问题，例如电生理学或表型表达方面的研究。观看本视频后，您应能充分理解如何使用动态掩模投影光刻技术，来精确设定用于神经元细胞培养研究的单层或双层水凝胶系统的几何构型。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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