Name: 不对称受体模式研究细胞滚动轨迹 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-13T16:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
Description: 学习利用微接触印刷技术制备不对称受体图案基底，观察HL-60细胞滚动轨迹并进行MATLAB分析。该方法为无标记细胞分离与细胞生物学研究提供了重要的技术平台。

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本项目得到了麻省理工学院技术创新德什潘德中心（R.K. 和 J.M.K.）以及美国国家科学基金会职业奖 0952493（通过化学与生物分离项目授予 R.K.）的支持。我们感谢麻省理工学院士兵纳米技术研究所（ISN）和微系统技术实验室（MTL）提供设施使用支持。

1. HL60 细胞滚动
1.1. 图案化基底的制备。
<ol>
	<li>采用微接触印刷（μCP）4-7 在镀金玻璃载片上制备交替的聚乙二醇（PEG）分子自组装单分子层（SAMs）：通过SU-8模具工艺制备具有10°倾斜角α的微接触印刷聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章。使用piranha溶液（浓硫酸与30%过氧化氢按3:1体积比混合）清洗金表面20分钟，随后在使用前用大量去离子水在24.5 °C下冲洗。将PDMS印章浸入5 mM PEG乙醇溶液中进行“上墨”，在空气中干燥20分钟。轻轻将印章贴合于金表面，持续40秒，确保印章与金表面之间充分接触，无需施加额外压力。用乙醇冲洗表面，并用N2气流吹干。</li>
	<li>使用灌注室（Electron Microscopy Sciences）将基底在P-选择素溶液（15 μg/mL，溶于DPBS）中孵育3小时，温度为24.5°C，使未被PEG覆盖的区域形成P-选择素图案。用大量DPBS冲洗表面。</li>
	<li>用牛血清白蛋白（BSA，1 mg/mL溶于DPBS）对表面进行1小时的反向填充，以阻断非特异性相互作用。用大量DPBS冲洗表面。</li>
</ol>
1.2. 流动室中的细胞滚动实验。
<ol>
	<li>在24.5°C条件下，将HL60细胞悬液（约105 个细胞/mL）流经矩形流动腔室（Glycotech, Inc；宽度 w = 1.0 cm；长度 = 6 cm；高度 h = 0.0127 cm），使用注射泵（World Precision Instruments, SP230IW）设定流速为75 μL/min，对应的剪切应力约为0.5 dyn/cm2（~0.05 Pa）。通过平面泊肃叶流动方程 τ = 6μQ/wh2 计算剪切应力τ，其中μ为运动粘度（0.001002 Pa s），Q为体积流速，w为流动腔室宽度，h为流动腔室高度。</li>
	<li>使用倒置显微镜（Nikon TE2000-U）配合连接的相机（Andor iXon 885），采用4×物镜以通常每秒1帧的速率记录HL60细胞在粘附性P-选择素基底上滚动相互作用的图像，持续时间为300秒。针对每一种剪切应力大小和图案倾斜角度，进行三次独立实验。数据以各次实验所得平均值的均值±标准差形式呈现。</li>
	<li>数据分析。 
	使用定制的Matlab（Mathworks, Inc.）程序分析图像序列，该程序结合一种粒子追踪免费软件8，沿图案化线条边缘生成轨迹。选取延伸至P-选择素条带末端的轨迹，并将其拟合为两条直线段——一条与流动方向对齐，另一条与图案边缘对齐。利用这两条线段计算边缘追踪长度、在边缘上的滚动速度以及在平坦区域上的滚动速度。</li>
</ol>
2. 代表性结果：
<img src="/files/ftp_upload/2640/2640fig1.jpg" alt="细胞迁移分析；示意图：（A）细胞在表面滚动，（B）流动方向，（C）数据直方图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图（A）显示了使用4×物镜拍摄的HL60细胞在粘附性P-选择素基底上滚动相互作用视频所转换得到的显微镜图像之一。亮区和暗区分别对应P-选择素受体区域和聚乙二醇（PEG）区域。图（B）显示了使用定制Matlab程序获得的细胞运动轨迹。边缘倾斜角度为10°，剪切应力为0.5 dyn/cm2。边缘追踪长度le、位移d，以及在边缘和条带内部的滚动速度Ve和Vp分别在图（C-1）中示出。图（C-2）显示了边缘追踪长度的分布（记录的细胞数量）。插图显示了在倾斜角α = 10°、流体剪切应力大小约为0.5 dyn/cm2条件下，le的平均值，以及边缘（Ve）和条带内部（Vp）滚动速度的平均值。误差条表示一个标准差，每种条件n = 3次重复实验（3个重复表面）。

<ol><li>Karnik, R., Hong, S., Zhang, H., Mei, Y., Anderson, D. G., Karp, J. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+control+of+cell+rolling+in+two+dimensions+through+surface+Patterning+of+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical control of cell rolling in two dimensions through surface Patterning of receptors.</a> Nano Lett. 8 (4), 1153-1158 (2008).</li>
<li>Lee, C. H., Bose, S., Van Vliet, K. J., Karp, J. M., Karnik, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+Lateral+Displacement+of+HL60+Cells+Rolling+on+Asymmetric+P-selectin+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Examining Lateral Displacement of HL60 Cells Rolling on Asymmetric P-selectin Patterns.</a> Langmuir. 27 (1), 240-249 (2011).</li>
<li>Norman, K. E., Moore, K. L., McEver, R. P., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+rolling+in-vivo+is+mediated+by+p-selectin+glycoprotein+ligand-1%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukocyte rolling in-vivo is mediated by p-selectin glycoprotein ligand-1.</a> Blood. 86 (12), 4417-4421 (1995).</li>
<li>Bernard, A., Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Bosshard, H. R., Biebuyck, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+patterns+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Printing patterns of proteins.</a> Langmuir. 14 (9), 2225-2229 (1998).</li>
<li>James, C. D., Davis, R. C., Kam, L., Craighead, H. G., Isaacson, M., Turner, J. N., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+protein+layers+on+solid+substrates+by+thin+stamp+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Patterned protein layers on solid substrates by thin stamp microcontact printing.</a> Langmuir. 14 (4), 741-744 (1998).</li>
<li>Mrksich, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+self-assembled+monolayers+to+understand+the+interactions+of+man-made+surfaces+with+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 25, 55-78 (1996).</li>
<li>Tan, J. L., Tien, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+printing+of+proteins+on+mixed+self-assembled+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Microcontact printing of proteins on mixed self-assembled monolayers.</a> Langmuir. 18 (2), 519-523 (2002).</li>
<li>Matlab Particle Tracking. , Avaliable from: 
	
 <a target="_blank" href="http://physics.georgetown.edu/matlab/">http://physics.georgetown.edu/matlab/</a> Forthcoming.</li>
<li>Lee, D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+Printing+of+P-Selectin+Increases+the+Rate+of+Neutrophil+Recruitment+Under+Shear+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow.</a> Biotechnology Progress. 24 (5), 1052-1059 Forthcoming.</li>
<li>Greenberg, A. W., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation+mediated+by+differential+rolling+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Cell separation mediated by differential rolling adhesion.</a> Biotechnol. Bioeng. 73 (2), 111-124 (2001).</li>
<li>Higuchi, A., Tsukamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation+of+hepatocytes+and+fibroblasts+through+surface-modified+polyurethane+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cell separation of hepatocytes and fibroblasts through surface-modified polyurethane membranes.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part A. 71A (3), 470-479 (2004).</li>
<li>Alexeev, A., Verberg, R., Balazs, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+surfaces+segregate+compliant+microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Patterned surfaces segregate compliant microcapsules.</a> Langmuir. 23 (3), 983-987 (2007).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

我们已描述了一种利用微接触印刷技术制备的不对称受体图案化表面来研究细胞滚动轨迹的实验方案2。通过光学显微镜观察图案化表面，可清晰区分PEG区域与P-选择素区域，从而验证印刷是否成功。当印刷操作良好时，可观察到边缘清晰、笔直。若对印章施加过大的压力，可能导致印章变形，从而降低图案的精确度。当墨水浓度过高或印刷时间过长时，可能产生波浪状边缘。当印章尺寸过小（&lt;0.5 cm2）时，印章与表面接触不良会导致PEG图案不均匀。使用非新鲜配制的墨水溶液可能导致细胞在PEG图案化区域发生滚动，原因是其钝化P-选择素的能力下降。实际倾斜角度可通过图案图像以及未与表面相互作用的自由流动细胞的轨迹图像计算得出。本实验可提供关于单个细胞沿图案边缘滚动事件的信息；然而，对于脱离一个图案后又重新附着到另一图案上的细胞，自动追踪其运动轨迹较为困难。通过调整图案间距等方法，可能实现对单个细胞连续经过多个边缘的追踪。该能力有望在单细胞水平上更精确地区分具有不同滚动特性的细胞。由于细胞滚动行为依赖于细胞表面的配体，我们推测此类实验可能有助于设计合适的图案，以基于细胞滚动行为的差异实现不同细胞表型的分离3, 9-...

<table><tbody><tr><td>人早幼粒细胞白血病细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td>HL60 细胞</td></tr><tr><td>金镀膜玻片</td><td>EMF</td><td>TA134</td><td>金玻片</td></tr><tr><td>(1-巯基十一烷基)四(乙二醇)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>674508</td><td>PEG</td></tr><tr><td>重组人 P-选择素</td><td>R&amp;D Systems</td><td>ADP3-050</td><td>P-selectin</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>BSA-50</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>21-030</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>316989</td><td></td></tr></tbody></table>

在不对称受体图案上研究细胞滚动轨迹

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

细胞在不对称受体图案上滚动时，会垂直于流动方向发生侧向位移，这一现象为开发新型无标记细胞分离与分析装置提供了可能1。此类装置可利用侧向位移实现连续流动分离，或通过调控黏附的受体图案来区分不同细胞表型或受体表达水平。要设计此类装置并优化受体图案化基底，必须深入理解细胞在受体图案化基底上的滚动轨迹特性。
在此，我们展示了一种用于研究细胞在支持细胞滚动黏附的不对称受体图案上滚动轨迹的实验方案。2界限清晰的， &mu;采用微接触印刷技术在镀金载玻片上制备微米级P-选择素受体图案，并将载玻片整合至流动腔室中。表达PSGL-1配体的HL60细胞 3在倒置明场显微镜下观察细胞流经图案化线条区域的情况。细胞沿图案的倾斜边缘滚动并定向移动，产生侧向偏转。1每个细胞通常会沿着图案边缘滚动一段特定距离（定义为边缘追踪长度），随后从边缘脱离，并重新附着到下游的另一个图案上。尽管这种脱离现象使得难以追踪细胞从流动室入口到出口的完整轨迹，但通过使用颗粒追踪软件，仍可分析并获得细胞在单个受体图案化线条上滚动期间的运动轨迹。随后对这些轨迹进行分析，以获取不同图案下细胞滚动速度及每个细胞的边缘追踪长度的分布情况。
该方案可用于量化细胞在受体图案上的滚动轨迹，并将其与图案角度和剪切应力等工程参数相关联。此类数据将有助于设计用于无标记细胞分离和分析的微流控装置。

我们描述了一种用于观察和分析细胞在不对称受体图案化基底上滚动轨迹的实验方案。所得数据可用于设计用于无标记细胞分离与分析的受体图案化基底。

细胞在不对称受体图案上滚动时，沿垂直于流动方向发生侧向位移，这为新型...的开发提供了可能

本方案通过观察和分析细胞在不对称受体图案上的滚动轨迹，以促进用于无标记细胞分离与分析的受体图案基底的设计。首先在金基底上通过微接触印刷PEG分子，形成交替的自组装单分子层图案，随后用P选择素受体对基底进行反向填充。接着将基底整合至流动腔室中，并将HL-60细胞注入腔室。记录HL 60细胞在P选择素图案上滚动相互作用的图像序列，并分析由视频转换而来的图像。利用MATLAB程序可获得滚动细胞边缘轨迹、滚动长度以及在平面、区域和边缘上的滚动速度。该方法有助于揭示HL 60细胞在剪切流中如何在不对称受体图案上运动。该方法可用于量化其他细胞表面相互作用，通过观察细胞在受体图案上的运动轨迹对其进行直接分析，以及用于设计用于细胞分离的微足装置。微接触印刷技术被用来在金基底上制备聚乙二醇分子自组装单分子层的交替图案。首先用乙醇中5毫摩尔的PEG溶液将PDMS印章染色。将表面干燥20分钟。轻轻将印章置于金表面，持续40秒，并确保金表面与印章之间有良好的接触。无需施加过量压力。用乙醇冲洗表面，并在氮气流下干燥。接着使用灌注腔室，在室温下将基底与15微克/毫升P选择素溶液孵育三小时，以在剩余区域形成P选择素图案；随后冲洗腔室，并用1毫克/毫升的牛血清白蛋白（BSA）溶液对表面进行回填封闭，孵育一小时，以阻断非特异性相互作用。在进行细胞滚动实验之前，用DPBS缓冲液冲洗表面。组装流动室，然后在矩形流动室中以每毫升10的5次方个细胞的浓度，将HL 60细胞悬浮液流经表面，受体图案的倾斜角度为10度。在 24.5 摄氏度的室温条件下。调节注射泵，使其产生 75 微升每分钟的流速，对应的层流剪切应力为 0.5 达因每平方厘米。现在使用倒置显微镜和安装的相机记录 HL-60 的滚动。与粘附性 p、选择素及底物的相互作用。使用 4 倍物镜，以每秒一帧的速率采集 300 秒时长的图像。进行三次独立实验。以每次实验所得平均值的均数和标准差形式呈现数据。显微镜图像由 HL 60.Rolling 视频转换而来。与黏附性 P-选择素的相互作用及底物显示出分别对应 P-选择素受体和 PEG 区域的亮区与暗区。此处使用定制的 MATLAB 程序来划定轨迹。边缘倾斜角度为 10 度，剪切应力为 0.5 达因/平方厘米。进一步的分析包括边缘跟踪长度的分布、边缘跟踪长度的平均值，以及 VE 和 VP，即在带边缘和带内部的滚动速度。观看本视频后，您应能充分理解如何分析非对称受体图案上的细胞运动轨迹。

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科研

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生物工程

不对称受体模式研究细胞滚动轨迹

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