在不对称受体图案上研究细胞滚动轨迹
2011年2月13日
我们描述了一种用于观察和分析细胞在不对称受体图案化基底上滚动轨迹的实验方案。所得数据可用于设计用于无标记细胞分离与分析的受体图案化基底。
本方案通过观察和分析细胞在不对称受体图案上的滚动轨迹，以促进用于无标记细胞分离与分析的受体图案基底的设计。首先在金基底上通过微接触印刷聚乙二醇（PEG）分子，形成交替的自组装单分子层图案，随后用P-选择素受体对基底进行反向填充。接着将基底集成到流动腔室中，将HL-60细胞注入腔室。
记录HL 60细胞在P选择素图案上滚动相互作用的图像序列，并分析由视频转换而来的图像。利用MATLAB程序可获得滚动细胞边缘轨迹、滚动长度以及在平面、区域和边缘上的滚动速度。该方法有助于揭示HL 60细胞在剪切流中如何在不对称受体图案上运动。
该方法可用于量化其他细胞表面相互作用，通过观察细胞在受体图案上的运动轨迹对其进行直接分析，以及用于设计用于细胞分离的微足状装置。微接触印刷技术被用来在金基底上制备聚乙二醇分子自组装单分子层的交替图案。
首先，用乙醇中浓度为5毫摩尔的聚乙二醇（PEG）溶液对PDMS印章进行蘸取。将表面干燥20分钟。然后将印章轻轻放置在金表面上，持续40秒，并确保金表面与印章之间有良好的接触。
无需施加过量压力。用乙醇冲洗表面，并在氮气流下干燥。接着使用灌注腔室，将底物与15 µg/mL P选择素溶液在室温下孵育3小时，使剩余区域形成P选择素图案；冲洗腔室后，再用1 mg/mL BSA溶液对表面进行回填封闭，孵育1小时，以阻断非特异性相互作用。
在进行细胞滚动实验之前，用DPBS缓冲液冲洗表面。组装流动室，然后在矩形流动室中以每毫升10的5次方个细胞的浓度，将HL 60细胞悬浮液流经表面，受体图案的倾斜角度为10度。
在 24.5 摄氏度的室温条件下。调节注射泵，使流速达到 75 微升每分钟，对应的层流剪切应力为 0.5 达因每平方厘米。现在使用倒置显微镜和安装的相机记录 HL-60 的滚动。
与粘附性p、选择素及底物的相互作用。使用4倍物镜，以每秒一帧的速度采集300秒时长的图像。进行三次独立实验。
以各实验所得平均值的均数和标准差形式呈现数据。显微镜图像由 HL 60.Rolling 视频转换而来。与黏附性 P 选择素的相互作用及其底物显示了亮区和暗区，分别对应 P 选择素受体区域和 PEG 区域。
此处使用定制的 MATLAB 程序来划定轨迹。边缘倾斜角度为 10 度，剪切应力为 0.5 达因/平方厘米。进一步的分析包括边缘跟踪长度的分布、边缘跟踪长度的平均值，以及 VE 和 VP，即在带状区域边缘和内部的滚动速度。
观看本视频后，您应能充分理解如何分析非对称受体图案上的细胞运动轨迹。
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概述
本方案通过观察和分析细胞在不对称受体图案上的滚动轨迹，以促进用于无标记细胞分离与分析的受体图案基底的工程化设计。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 生物材料
- 微流控
背景
- 细胞滚动是多种生物学相互作用中的关键过程。
- 受体的不对称分布可影响细胞行为。
- 无标记技术对于细胞分离与分析至关重要。
- 微接触印刷是制备图案化基底的有效方法。
研究目的
- 建立一种在受体图案化基底上观察细胞滚动的实验方案。
- 分析滚动细胞的运动轨迹，以优化基底设计。
- 揭示细胞在流动条件下的运动动力学特征。
使用的方法
- 在金基底上进行PEG分子的微接触印刷。
- 构建自组装单分子层的交替图案。
- 用P-选择素及其受体对基底进行反向填充。
- 整合流动腔并成像HL-60细胞在图案上的滚动行为。
主要结果
- 记录了HL-60细胞相互作用的图像序列。
- 使用MATLAB分析滚动细胞的运动轨迹。
- 获得了边缘追踪长度和滚动速度的数据。
- 揭示了细胞在不对称受体图案上的运动机制。
结论
- 该方案可实现对细胞滚动动态的详细分析。
- 可设计不对称受体模式以实现有效的细胞分离。
- 该方法有助于理解细胞在剪切流中的行为特征。
常见问题
行业重要性概述
理解细胞在不对称受体图案上的滚动轨迹，有助于合理设计无需标记的微流控分离装置。本方案在定义的剪切应力条件下，提供边缘追踪长度和滚动速度的定量数据，支持对流动中细胞行为的预测建模。此类见解可减少细胞纯化和表型分析工作流程中装置工程的试错迭代。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够在生理剪切力条件下研究配体-受体结合动力学，为黏附介导通路的靶点验证提供依据。
- 操作价值：提供了一种无标记方法，无需荧光标记或基因报告系统即可评估功能受体活性。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：可对不同受体密度或图案几何形状下的细胞滚动速度和边缘追踪长度进行定量读数，实现比较分析。
- 操作价值：通过微接触印刷与流动腔室整合，标准化基底制备流程，确保黏附实验的可重复性。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过将受体图案设计与可观察的细胞轨迹结果相关联，支持基于黏附分离策略的机制性风险降低。
- 操作价值：能够基于滚动行为筛选细胞表型，有助于在临床前模型中富集特定亚群。
流程与工作流整合
该方法适用于早期发现阶段，可用于指导检测方法开发和临床前工具的生成，尤其适用于以流动条件下的黏附作为功能性读数的靶点。
- Discovery Biology：在剪切流中促进受体-配体相互作用的假设验证，阐明其在细胞滚动中的机制性作用。
- Screening：提供标准化的定量黏附参数，可用于不同细胞系或受体调节剂之间的比较。
- Analytics：输出边缘追踪长度和滚动速度的分布数据，为不同实验条件间的统计比较提供依据。
- Translational Research：将体外滚动动力学研究与无标记细胞分离装置的潜在应用相连接，用于临床前样本处理。
- Enterprise Reuse：建立一个可重复使用的平台，用于评估多种靶点和细胞类型中由黏附介导的细胞行为。
运营与企业影响
- 科学价值：通过在受控剪切条件下量化轨迹参数，提高对基于黏附分离机制的预测置信度。
- 操作价值：通过标准化的微接触印刷、受体填补和流动腔室设置，确保实验可重复性。
- 战略价值：通过实现受体图案的早期功能验证，降低医疗器械开发后期的生物学风险。
- 项目影响：提供图案性能的实证数据，支持微流控分离技术的立项或终止决策。
实施注意事项
- 需要具备微接触印刷、表面化学和微流控流动控制方面的专业知识。
- 依赖倒置明场显微镜、高速相机以及基于 MATLAB 的颗粒追踪工具的使用条件。
- 为实现多中心可重复性，需跨团队统一基底制备和流动条件报告的标准。
- 应用于其他细胞类型时，需验证配体-受体对并优化剪切应力参数。
- 受限于细胞边缘相互作用的瞬时性，难以完整重建运动轨迹，需进行分段分析。
