Name: 毒蝎钉感器电 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 学习使用尖端记录技术研究蝎子的化学感觉生理学，通过矿物油隔离单个感器进行电生理记录。该方法可精确检测蝎栉状器上单个感器的神经反应，为理解动物化学感知机制提供重要工具。

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感谢生命基金、俄克拉荷马大学本科生研究机会计划以及动物学系对本工作的资助。同时感谢Mariëlle Hoefnagels博士在编辑方面提供的帮助。

1. 录制前的活体动物准备
<ol>
	<li>将蝎子从其栖息的容器中取出，放入预先冷却的玻璃容器中；随后将装有蝎子的容器置于冷冻环境（-5 °C）中至少两分钟。具体时间可能因所研究蝎子的年龄、体型、种类等因素而有所不同。但通常情况下，当动物完全静止不动时，即表明冷冻阶段已完成。</li>
	<li>两分钟后，将已固定不动的蝎子从低温玻璃容器中取出，腹面朝上放置于显微镜载玻片上。使用可塑性黏土（油性，Van Aken Plastalina）固定其毒刺、尾部、足和须肢。</li>
	<li>制作一个用于放置蝎子栉器的平台。根据栉器的大小调整平台的长度和宽度。通常，我们的平台由显微镜盖玻片制成，尺寸约为10（长）× 18（宽）mm。</li>
	<li>在栉器平台上粘贴双面胶带，并根据需要修剪胶带以使其贴合平台。</li>
	<li>为构建栉器腔室，将平台四边中的三边浸入已预熔的蜡中（我们使用100%纯蜂蜡碎片），浸入深度为3–4 mm。通过将蜡碎片置于玻璃培养皿中并放置于加热板上进行熔化。待栉器腔室边缘的蜡冷却至室温后，应形成约1 mm高的蜡壁。</li>
	<li>在动物体上确定栉器插入的位置，将平台未涂蜡的一边（胶带面朝上）紧贴该位置后方放置。随后，轻轻按压平台左右两侧边缘，使其与用于固定动物足部的黏土贴合，以稳定平台，防止其后续移动。</li>
	<li>使用尖头镊子小心地将栉器或一对栉器放入腔室内。具体操作为：用镊子夹住栉器的栉齿主干，沿盖玻片下方缓缓将栉器拉出，并轻柔地将其放置于带胶的平台底部。通过小心施加压力于栉齿主干，使栉器与胶带牢固粘合。</li>
	<li>现在将熔化的蜡（我们使用预热的金属刮刀）涂抹在平台未封蜡的边缘。此步骤具有双重目的：一是固定栉器，二是完全封闭腔室，以便后续引入矿物油。在将蜡覆盖于动物栉器上方时需格外小心，避免因蜡温过高而损伤栉器。</li>
	<li>栉器腔室构建完成。接下来，通过将一根银丝插入尾部两个体节之间，建立与动物血淋巴的无关电极连接。</li>
</ol>
2. 同时进行细胞外记录与化学刺激
<ol>
	<li>我们于进行细胞外尖端记录前24小时准备实验动物，这一时间安排除了便于动物适应固定体位外，还可用于定制具有特定（依感受器而定）尖端直径的刺激电极毛细管。我们使用微电极拉制仪来制备符合此类规格的毛细管。理想情况下，毛细管的尖端直径为 &asymp; 2 &mu;比感受器孔径大，我们针对每只动物相应调整微移液管的规格。</li>
	<li>记录前1小时，我们加入5 &mu;向栉膜腔内加入矿物油，使栉膜完全浸没于油中。然后将动物置于配备长工作距离物镜和落射照明的高倍显微镜下。</li>
	<li>为了化学刺激刺形感器，我们通过油介质引入水溶性味觉刺激物（即柠檬酸和盐）。首先，使用微管填充器将刺激物注入刺激用移液管中。注意：所有刺激物溶液都应含有电解质以保证电导性。</li>
	<li>接下来，将刺激电极移液管固定在记录装置的显微操作器上后，将记录电极插入刺激电极移液管钝端的开口处。必须确保金属电极与电解刺激溶液之间形成良好接触。</li>
	<li>一旦准备就绪并通过无关电极实现电学接地，只需将移液管穿过油相介质并接触感器孔即可。对每个栉状感器的化学刺激持续时间可从长达三十分钟到短至一秒不等。通常情况下，我们可以对多个小杆状结构进行采样（&gt; 30）每支移液管。如果刺激用移液管被微小碎屑堵塞，只需将堵塞的移液管更换为一支新的、未使用过的移液管即可。</li>
</ol>
3. 准备用于多天实验的动物
<ol>
	<li>如果需要在较长时间内重复使用该动物，我们建议重复使用栉状腔，并在每次记录会话中更换矿物油液滴。在当天的记录会话结束后，将动物从记录装置中取出，并进行矿物油清洗。</li>
	<li>具体操作为：向腔内再加入一滴（5 μl）矿物油，然后将所有油液移除。此步骤有助于最大限度减少残留刺激物的存在，这些刺激物可能在记录过程中从移液管中渗漏出来。</li>
	<li>在下一次记录会话前，按照前述方法加入一滴矿物油。</li>
</ol>
4. 代表性结果：
根据所使用的记录设备（例如特定的放大器、数字化硬件等），典型结果应为信噪比至少达到3:1的细胞外记录。
成功构建矿物油腔室对于将化学刺激限制在单个感受器内至关重要，因为它为递送极性（水基）化学味觉刺激物提供了一种介质8。如果矿物油过少或完全缺失，刺激溶液将从被记录的感受器扩散至邻近的感受器，可能导致持续且不受控制的化学刺激8。

<ol><li>Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+a+Primary+Chemoreceptor+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Physiology of a Primary Chemoreceptor unit.</a> Science. 12, 417-418 (1955).</li>
<li>Newland, P. L. Taste processing in the insect nervous system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNewland%2C+PL+%22Methods+in+Insect+Sensory+Neuroscience%22">Methods in Insect Sensory Neuroscience</a>. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 289-318 (2005).</li>
<li>Foelix, R. F., Müller-Vorholt, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+scorpion+sensory+organs+II.+Pecten+sensilla%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Br.+Arachnol.+Soc%22%5BJournal%5D)">The fine structure of scorpion sensory organs II. Pecten sensilla.</a> Bull. Br. Arachnol. Soc. 6, 68-74 (1983).</li>
<li>Carthy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+structure+and+function+of+the+sensory+pegs+on+the+scorpion+pecten%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Fine structure and function of the sensory pegs on the scorpion pecten.</a> Experientia. 22, 89-91 (1966).</li>
<li>Gaffin, D. D., Brownell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+properties+of+chemosensory+peg+sensilla+on+the+pectines+of+scorpions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Response properties of chemosensory peg sensilla on the pectines of scorpions.</a> J. Comp. Physiol. A. 181, 291-300 (1997).</li>
<li>Wolf, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pectine+organs+of+the+scorpion%2C+Vaejovis+spinigerus%3A+Structure+and+%28glomerular%29+central+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Arthropod+Struct.+Dev%22%5BJournal%5D)">The pectine organs of the scorpion, Vaejovis spinigerus: Structure and (glomerular) central projections.</a> Arthropod Struct. Dev. 37, 67-80 (2008).</li>
<li>Gaffin, D. D., Brownell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+evidence+of+synaptic+interactions+within+chemosensory+sensilla+of+scorpion+pectines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological evidence of synaptic interactions within chemosensory sensilla of scorpion pectines.</a> J. Comp. Physiol. A. 181, 301-307 (1997).</li>
<li>Knowlton, E. D., Gaffin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+examining+scorpion+peg+sensilla%3A+the+mineral+oil+flood+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Arachnol%22%5BJournal%5D)">A new approach to examining scorpion peg sensilla: the mineral oil flood technique.</a> J. Arachnol. 37, 379-382 (2009).</li>
<li>Knowlton, E. D., Gaffin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+tip-recording+method+to+test+scorpion+pecten+chemoresponses+to+water-soluble+stimulants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new tip-recording method to test scorpion pecten chemoresponses to water-soluble stimulants.</a> J. Neurosci Methods. , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Haupt, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antennal+sucrose+perception+in+the+honey+bee+%28Apis+mellifera+L.%29%3A+behaviour+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Antennal sucrose perception in the honey bee (Apis mellifera L.): behaviour and electrophysiology.</a> J. Comp. Physiol. A. 190, 735-745 (2004).</li>
<li>Bland, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensilla+on+the+antennae%2C+mouthparts%2C+and+body+of+the+larva+of+the+alfalfa+weevil%2C+hypera+postica+%28gyllenhal%29+%28Coleoptera+%3A+Curculionidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Insect+Morphol.+Embryol%22%5BJournal%5D)">Sensilla on the antennae, mouthparts, and body of the larva of the alfalfa weevil, hypera postica (gyllenhal) (Coleoptera : Curculionidae).</a> Int. J. Insect Morphol. Embryol. 12, 261-272 (1983).</li>
<li>Cate, H. S., Derby, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooded+Sensilla+Homologues%3A+Structural+Variations+of+a+Widely+Distributed+Bimodal+Chemomechanosensillum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Hooded Sensilla Homologues: Structural Variations of a Widely Distributed Bimodal Chemomechanosensillum.</a> J. Comp. Neurol. 444, 345-357 (2002).</li>
</ol>

我们此前已在两本期刊中发表过这些方法，即 Knowlton 和 Gaffin（2009）以及 Knowlton 和 Gaffin（待发表）。

上述方案描述了如何准备一种沙漠草原蝎（Paruroctonus utahensis用于电生理学研究。具体而言，我们展示了如何构建一个可在油相环境下对栉器化感神经元进行可控细胞外尖端记录的记录室。由于油相与水相不相混溶，因此可将基于水相的化学刺激精确限定于单个感觉器。需要强调的是 P. utahensis是一种相对较小的动物（≈ 2.5–5 cm），将本方案应用于较大的动物时，可能需要进行多项尺寸调整，例如动物平台、腔室的大小以及所用油的用量。我们建议开展预实验，以测试实现水溶性化学刺激物可控递送所需的最低油用量。
此外，我们发现油对pectinal sensilla内的基础神经活动没有影响8。在评估化学感受性之前，也应针对其他模型系统验证这一结果。
该方法可与其他方法结合使用，以检测感觉区域中感受器之间化学响应的相互作用效应。例如，可在油下对一个感受器进行尖端记录，同时通过钨电极对邻近的感受器进行基部记录9。这种记录配置可用于评估化学刺激一个感受器是否会影响基部记录感受器的神经活动。迄今为止，尚无人对蝎子栉状器感受器进行过此类测试，这一问题在其他化学感受系统中也仍然有待研究。
总之，我们认为在油下进行尖端记录的方法拓展了电生理学研究节肢动物味觉神经基础的范围。在本文中，我们提供了一套用于该方法的动物准备方案，希望为外周感觉神经系统进一步的研究奠定坚实基础。

<table><tbody><tr><td> Lift-N-Press 标签 </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 16082 </td><td> 双面粘合剂 </td></tr><tr><td> MicroFil </td><td> World Precision Instruments, Inc. </td><td> MF34G </td><td> 微量移液管填充器 </td></tr><tr><td> 标准玻璃毛细管 </td><td> World Precision Instruments, Inc. </td><td> 1B100F-6 </td><td> 玻璃移液管 </td></tr><tr><td> Micr&amp;#8211;lectrode Holder </td><td> World Precision Instruments, Inc. </td><td> MEH3SBW10 </td><td></td></tr></tbody></table>

蝎子 peg 感觉刺的电生理学

Electrophysiology of Scorpion Peg Sensilla

我们介绍了一种对现有尖端记录技术1,2的改进方法，用于电生理学研究短小、钉状的感觉毛状感器3,4。所有蝎子的腹面中部均具有一对称为栉器的附肢，其上分布着密集的机械感受和化学感受钉状感器5,6。评估这些感器化学反应性的一种方法是使用钨电极，在向感觉区域引入挥发性气味物质时，记录感器内的细胞外神经活动5,7。该方法的局限性包括数据采集速度慢，以及对钉状感器区域施加和清除刺激物的过程缺乏控制。为克服这些局限，我们开发了一种新的尖端记录技术，采用非极性矿物油作为介质，将水溶性味觉刺激物递送至单个钉状感器8,9。我们已成功应用该方法获得了感器对柠檬酸、乙醇和盐的化学反应。本文将描述该研究的实验方案9。我们认为，这种新方法可能适用于研究其他节肢动物化学感受系统，包括昆虫10, 11和甲壳类动物12的化学感受特性。

本文介绍了一种电生理学方法，通过在矿物油下进行细胞外尖端记录，实现对单个感器的化学刺激进行分离。

我们介绍了一种对现有尖端记录技术1,2 的改进方法，用于电生理学研究短小、钉状的感觉感器3,4。在……

本实验的总体目标是研究蝎子栉器上单个 peg illa 的化学感受生理学特性。首先将麻醉后的蝎子腹面朝上固定在载玻片上，利用油泥将其固定。随后将栉器浸入自制的充油腔室中，并制备含有化学刺激物的电极，以实现上述研究目的。化学感受反应在刚毛的各个个体上进行记录，最终产生对水溶性化学刺激物相似的反应谱型。我们通过在孔隙上吹送挥发性刺激物，同时记录刚毛基部的反应。尖端记录技术的主要优势在于，它能够将刺激局限于一个刚毛，而不影响其邻近刚毛的活动。该方法可帮助我们解答化感生物学领域的一些关键问题，例如，为何动物在化学检测与感知过程中会使用如此多重复的小孔（silla）？蝎子看似并非最安全的研究对象，但并非所有物种都具有危险性或难以处理。例如，沙漠草原蝎体长仅四至五厘米，易于在实验室中饲养，且若操作得当，极少发生蜇刺行为。如果被蜇伤，毒液会人为地激活你的感觉神经元，其中部分神经元负责传递疼痛信息。这种感觉通常在约15分钟内消退。蝎子生命力顽强，可耐受多天的实验操作，实验后常可被送回其栖息环境。当实验完成需要固定蝎子时，将其放入预冷的玻璃容器中。然后将装有蝎子的容器置于冷冻环境中至少两分钟，待动物完全静止后从冷冻设备中取出。接着将已固定的蝎子腹面朝上放置在显微镜载玻片上。使用可塑性黏土固定毒刺尾部的腿和步足。蝎子的栉状器是位于生殖器官附近的一对梳状结构，为这类动物所特有。必须构建一个腔室，用于容纳单个栉状器，同时不将其从动物体上移除。首先，制作一个平台，用于固定果胶，并将其安装在尺寸约为5毫米×18毫米的玻璃盖玻片上。通常效果良好。其次，将双面胶带粘附到平台上，并根据需要修剪胶带以使其贴合。第三，使用电热板将玻璃皿中的纯蜂蜡颗粒加热至熔化。然后将平台的四个边缘中的三个浸入熔化的蜂蜡中，深度为三到四毫米。冷却后的蜂蜡形成壁状结构，从而构成一个腔室。现在，将平台未固定的边缘置于动物胸鳍插入点稍后的位置。使用尖头镊子轻轻按压平台左右两侧的外缘，使其紧贴用于固定动物腿部的黏土，以稳定平台。小心握住其中一根胸鳍条，沿胸鳍棘将其从盖玻片下方轻轻拉出，并缓缓放至黏性平台底面上。用预热的金属刮刀将熔化的石蜡涂抹在平台未封闭的边缘，以完成腔室的封闭。通过小心按压胸鳍棘，将果胶固定。此时，动物已基本准备好进行电生理记录。现在很容易建立一个无关电极连接。将一根银丝插入蝎子血淋巴的两个尾段之间。将从动物体内引出的部分银丝压入黏土中以固定，并留出足够长度以连接到放大器。现在将制备好的样品放置至少一小时后再进行记录，以使样品稳定，便于记录。使用微量移液器拉制仪制备移液管，其内径应比传感器孔径大约两微米，具体尺寸因动物个体而异。记录前一小时，向果胶室中加入五微升石蜡油。然后将动物置于具有长工作距离物镜和落射照明的高倍显微镜下，以化学方式刺激锥形感器。用含有电解质溶液的水溶性味觉刺激物填充刺激电极移液管。使用微量移液管填充器后，将装有刺激物的移液管连接至显微操作器。现在将记录电极插入刺激电极移液管的开口端。必须确保金属电极与电解刺激溶液之间有良好接触。将记录电极和无关电极的导线连接至差分放大器。将放大器连接至示波器以观察电活动，并连接至扬声器以听觉检测电信号变化。此时装置已准备就绪，可进行记录。使用显微操作器小心地将移液管下放至感受器孔上。当移液管电解液与 peg sens 内液体之间形成电接触时，可听到向更高频率的转变。此时还可听到神经动作电位特有的爆裂声。每次对 perpetual sens 进行化学刺激的持续时间可从长达30分钟到短至1秒钟不等。通常情况下，一个移液枪头可取样超过30个样钉。若移液枪头发生堵塞，应更换为干净的枪头。移液枪头易于制备，且堵塞情况较为常见，因此应始终准备充足的备用枪头。可以在更换石蜡油之前，在一次记录过程中对同一只动物持续记录数小时。同一只动物可在记录装置中固定，并在连续数天内进行多次记录。对于后续的记录，可重复使用胸腔室，但需更换石蜡油。只需用移液器吸除所有旧的油液，并加入一滴新鲜的油液即可。这有助于尽量减少残留刺激物的存在，这些残留物可能在记录过程中从刺激电极的尖端渗出。以下是针对不同刺激物的代表性尖端记录结果。该曲线显示了对 0.01 摩尔氯化钾相对稳定的一致性反应。该探针在对 0.1 摩尔柠檬酸的反应中，初始响应强度明显更强，随后在不到一秒的时间内强度迅速减弱，接着频率也有所下降。在对 30% 乙醇的典型反应中，曲线表现为在短暂的无活动间隙之间出现多个尖峰的爆发式放电。在比较不同传感器对相同刺激物（如 0.1 摩尔柠檬酸）的尖端记录时，可观察到此类反应模式。反应结果非常相似。在进行此操作时，需要注意使用基于水的刺激剂填充移液器，这种刺激剂不会与油性介质混合，从而可以逐个对单个发光体进行化学刺激。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何利用矿物油作为介质，对蝎子栉器上的单个CIN进行可控刺激。

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