Name: 在免疫缺陷小鼠的建立和传播人类视网膜母细胞瘤肿瘤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 了解在免疫缺陷小鼠眼内建立视网膜母细胞瘤原位模型的方法。通过玻璃体腔注射培养的人肿瘤细胞球，观察白瞳症等肿瘤生长指标，为研究肿瘤生物学和测试治疗方案提供可靠平台。

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本项目由克雷顿医学研究基金会和视网膜研究基金会提供资助。

1. 视网膜母细胞瘤肿瘤球的制备
<ol>
	<li>根据经机构审查委员会（IRB）批准的方案获取视网膜母细胞瘤肿瘤样本。</li> 
 <li>配制新鲜的无血清干细胞培养基（Neurobasal-A 培养基，1X B-27 补充剂不含维生素A，1X 非必需氨基酸溶液，1X L-谷氨酰胺，20 ng/mL EGF，10 ng/mL bFGF）。</li>
<li>在无菌条件下，使用手术刀在经组织培养处理的6孔板中采用交叉切割法对肿瘤组织进行机械解离。立即向组织中加入100 μL无血清干细胞培养基，并用手术刀轻轻铺开切碎的组织。每孔再加入5 mL无血清干细胞培养基。</li>
<li>置于37°C、5% CO2的湿化培养箱中培养，每日观察。部分肿瘤球几乎可立即从破碎的肿瘤组织中形成，并在2至4天内数量逐渐增加。</li>
<li>每周以300×g离心5分钟收集肿瘤球，重悬于新鲜配制的无血清干细胞培养基中，吹打10次，以破碎较大且中心坏死的肿瘤球，促进新的健康肿瘤球形成。</li>
</ol>
2. 注射用肿瘤细胞的制备
<ol>
	<li>若注射培养的肿瘤球，先将肿瘤球轻柔地用移液器转移至15 mL圆锥管中。用血清移液管轻柔吹打10–15次，以充分分散肿瘤球。</li>
	<li>使用血细胞计数板对拟注射的细胞进行计数，并将每份不少于50,000个细胞分装至新的离心管中。根据可用细胞数量，尽可能准备相应数量的注射样本。</li>
	<li>以300×g离心5分钟。小心吸除上清液，加入5 mL PBS重悬细胞。重复一次离心及上清去除步骤，最后按每份注射样品10 μL PBS重悬细胞。</li>
</ol>
3. 动物准备
<ol>
<li>使用胰岛素注射器，按照每千克体重 0.01 mL 的剂量，向腹腔内注射麻醉混合液（氯胺酮 37.6 mg/mL，赛拉嗪 1.92 mg/mL，乙酰丙嗪 0.38 mg/mL） 1 μL 每克体重（gbw）。等待5分钟，使动物进入镇静状态。检查心跳，并将动物置于加热垫上。在恢复前，始终将动物保持在加热垫上。</li>
<li>镇静后，向右眼滴加1滴盐酸丙帕卡因。将动物放回加热垫上，等待1分钟。</li>
<li>向右眼滴加1滴盐酸去氧肾上腺素。将动物放回加热垫上，等待5分钟。若瞳孔未扩张，再次滴加1滴，并继续等待5分钟。</li>
<li>监测动物是否出现活动或抽搐迹象，这些现象可能发生于 &gt;镇静后30分钟。一旦出现最初的动作迹象，立即给药 1 μL/gbw 盐酸氯胺酮（用PBS稀释至10 mg/mL）并等待5分钟。</li>
</ol>
4. 肿瘤细胞注射
<ol>
	<li>将麻醉后的动物侧置于显微镜下，右眼朝上，头部 resting 在纱布上并居中，通过显微镜观察时应可见右眼眼底的红光反射（此时瞳孔应已散大）。</li>
<li>用两根手指轻轻按压眼睑，同时向下施力以支撑右眼球，并在后续操作中保持此位置稳定。</li> 
<li>使用连接至鲁尔锁紧式注射器的无菌30号针头，从角膜缘附近平坦部区域的结膜和巩膜侧方穿入，穿透脉络膜进入玻璃体腔（图1）。随后将针头从穿刺口移除。</li>
<li>用酒精棉片对Hamilton针进行消毒。将细胞悬液吸入Hamilton注射器中，并将针头插入切口，直至在显微镜下可见针尖位于晶状体后方玻璃体靠近视网膜的位置。在另一人协助下保持针头位置稳定，缓慢推动注射器推杆。随后拔出针头。如有必要，可用棉签吸去切口处的液体。</li>
<li>轻轻松开对眼睑的压力，使小鼠眼睑闭合。</li> 
<li>每只眼睛滴入1滴羟丙甲纤维素，并将动物放回加热垫上恢复。</li>
</ol>
5. 注射小鼠的监测与肿瘤组织的采集
<ol>
	<li>每日检查注射眼是否存在白瞳症（白色瞳孔反射）和/或眶周肿胀，这些症状通常在注射后2-4周变得明显。</li> 
	<li>一旦检测到肿瘤生长，根据机构指南实施动物安乐死。</li>
	<li>若眼球和肿瘤被眼睑覆盖，使用手术刀沿睑裂垂直方向做两个切口，并掀开皮肤瓣。</li> 
	<li>在体视显微镜下观察，于角膜缘处做环形切口，移除角膜和晶状体，并用镊子小心将大部分肿瘤组织与其他组织分离。将肿瘤置于无菌RPMI-1640培养基中。</li> 
	<li>用镊子缓慢将眼球从眼眶中拉出。为确保视神经附着以便观察肿瘤浸润情况，应将眼球拉出至视神经暴露，然后用剪刀尽可能保留较长的视神经段进行剪断。将标本置于10%福尔马林中，常规处理后用于组织学检查。</li>
</ol>
6. 代表性结果：
视网膜母细胞瘤肿瘤球将从离散的组织中几乎立即开始出现，因为它们从肿瘤团块中被释放出来。在2-4天内，将有更多肿瘤球开始形成，并逐渐增大。这些球体通常形态规则，表现出围绕细胞团的清晰、结构完整的次级膜（图2）。
动物通常在注射后4周内出现白瞳症（图3b），随着肿瘤生长，注射后5至8周眼球增大，周围组织扩张（图3c）。 
<img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig1.jpg" alt="眼睛解剖图；标注部分：晶状体、角膜、视网膜、视神经，用于视觉研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 小鼠眼球的横截面示意图，突出显示本实验方案中提及的结构。
<img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig2.jpg" alt="细胞培养的显微镜图像；两种不同条件下生长模式的比较" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 人视网膜母细胞瘤细胞培养 体外 成像于 a) 4x，以及 b) 10倍物镜放大倍数。视网膜母细胞瘤原代肿瘤细胞形成具有规则球形形态和清晰外膜的肿瘤球。比例尺表示 a) 500 μm，以及 b) 200 μm.
<img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig3.jpg" alt="动物眼部分析；健康与感染状态的比较。研究，兽医病理学。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. Rag2-/- 小鼠的眼部，显示 a) 正常特征，b) 玻璃体腔内肿瘤团块所致的白瞳症，以及 c) 大型肿瘤团块充满眼球，伴有眶周扩张和眼内出血。

<ol><li>Chèvez-Barrios, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+and+Nonmetastatic+Models+of+Retinoblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Metastatic and Nonmetastatic Models of Retinoblastoma.</a> Am. J. Pathol. 157, 1405-1412 (2000).</li>
<li>Suber, M. L., Hurwitz, M. Y., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+consequences+of+intraocular+administration+of+modified+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune consequences of intraocular administration of modified adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 12, 833-838 (2001).</li>
<li>Mallam, J. N., Hurwitz, M. Y., Mahoney, T., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Gene+Transfer+into+Retinal+Cells+Using+Adenoviral+Vectors%3A+Dependence+on+Receptor+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient Gene Transfer into Retinal Cells Using Adenoviral Vectors: Dependence on Receptor Expression.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 1680-1687 (2004).</li>
</ol>

动物实验按照贝勒医学院 IACUC 委员会制定的指南和规定进行。

本文所述技术可促进视网膜母细胞瘤在眼内、玻璃体内的微环境中生长。眼内注射技术过去已被用于由视网膜母细胞瘤来源的细胞系建立肿瘤1，以及递送用于眼内基因治疗的病毒载体2,3。该技术现已成功应用于通过直接注射原发肿瘤细胞、肿瘤球（tumorspheres）以及连续传代异种移植瘤来生成人源视网膜母细胞瘤。通常在注射后4周内即可观察到肿瘤形成的可见迹象（通常为白瞳症），随后在5至8周内出现眼内出血及眼球或眶周组织的肿胀。少数注射小鼠会损伤注射眼，导致眼睑永久闭合。在此类情况下，肿胀是肿瘤形成的唯一征象。
并非所有人类视网膜母细胞瘤都能成功建立小鼠异种移植瘤，尽管已建立的异种移植瘤在小鼠体内传代非常成功。这一现象提示，原发肿瘤的某些特性，如侵袭性、分化程度或其他未知因素，可能影响这些肿瘤在小鼠眼内环境中的存活能力。
从人类视网膜母细胞瘤肿瘤中获取的组织量非常有限，且在培养人类视网膜母细胞瘤细胞方面存在显著限制 体外 例如有限的寿命、实体瘤组织学特征的丧失以及细胞表型的改变。本方案提供了一种相对简便的方法来扩增人类肿瘤并建立人类疾病的鼠类模型，从而允许进一步研究 体外 和 体内 视网膜母细胞瘤生物学特性的实验研究及肿瘤离体后的长期维持

<table><tbody><tr><td>盐酸去氧肾上腺素 2.5%</td><td>Bausch and Lomb</td><td>053-11</td><td>滴眼液</td></tr><tr><td>30 号针头</td><td>BD Biosciences</td><td>305128</td><td>普通斜面</td></tr><tr><td>10 mL 鲁尔锁注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>3/10 cc 胰岛素注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>328431</td><td></td></tr><tr><td>酒精棉片</td><td>BD Biosciences</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板，组织培养处理</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>盐酸丙帕他卡因 0.5%</td><td>Butler Animal Health Supply</td><td>017239</td><td>滴眼液</td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮 100 mg/mL</td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td>4402A</td><td></td></tr><tr><td>10-&amp;mu;L Hamilton 注射器</td><td>Hamilton Co</td><td>7648-01</td><td></td></tr><tr><td>32 号 Hamilton 针头</td><td>Hamilton Co</td><td>7803-04</td><td>定制长度 - 0.5&quot;</td></tr><tr><td>Neurobasal-A 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>B-27 添加剂（不含维生素 A），50X</td><td>Invitrogen</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸溶液，100X</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺，100X</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>一次性 #11 手术刀</td><td>Miltex Inc.</td><td>4-411</td><td></td></tr><tr><td>啮齿类动物麻醉混合液</td><td>N/A</td><td>n/a</td><td>本院药房配制（氯胺酮 37.6 mg/mL，赛拉嗪 1.92 mg/mL，乙酰丙嗪 0.38 mg/mL）</td></tr><tr><td>重组人表皮生长因子（EGF）</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>02633</td><td>重悬为 10 &amp;#x03BC;g/mL 储存液</td></tr><tr><td>重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>02634</td><td>重悬为 10 &amp;#x03BC;g/mL 储存液</td></tr><tr><td>OMS-75 手术显微镜</td><td>Topcon Medical Systems</td><td>OMS-75</td><td>该型号已停产</td></tr><tr><td>10% 福尔马林</td><td>VWR international</td><td>95042-908</td><td></td></tr></tbody></table>

建立和传代人视网膜母细胞瘤肿瘤在免疫缺陷小鼠中的模型

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

在特定的干细胞培养基中培养视网膜母细胞瘤肿瘤细胞可形成原代肿瘤球，但这些肿瘤球仅能短期生长和维持。与原始肿瘤相比，这些体外培养的肿瘤球可能表现出显著不同的细胞表型。验证培养后的细胞是否仍具有形成新肿瘤的能力，对于确保培养细胞能够真实模拟原始肿瘤的生物学特性至关重要。
本文介绍了一种人视网膜母细胞瘤肿瘤传代培养的实验方案 体内 使用 Rag2-/- 免疫缺陷小鼠。将低代次培养的人视网膜母细胞瘤肿瘤球或从新鲜收获的人视网膜母细胞瘤肿瘤中分离的细胞直接注射至小鼠眼玻璃体腔内，可在2-4周内形成肿瘤。这些肿瘤可被收获后进一步传代接种至小鼠眼内 体内 或以肿瘤球形式培养 体外已成功连续传代至少三次，从而建立了可持续提供的人类视网膜母细胞瘤组织来源，可用于进一步实验。 
Wesley S. Bond 和 Lalita Wadhwa 为共同第一作者。

介绍了一种在小鼠体内传代人视网膜母细胞瘤肿瘤的方法。将肿瘤细胞直接注射到免疫缺陷小鼠的眼内。该方法已成功用于建立继发性肿瘤，所用细胞既包括直接从人肿瘤组织中获取的细胞，也包括培养的肿瘤球细胞。

在限定的干细胞培养基中培养视网膜母细胞瘤肿瘤细胞可形成原代肿瘤球，其生长和维持时间仅限于较短时期……

本实验的总体目标是在免疫缺陷小鼠中建立原位视网膜母细胞瘤模型，为后续实验提供便利，并实现肿瘤的传代扩增。该过程首先从原发肿瘤或异种移植肿瘤中分离细胞，并在体外培养肿瘤球。实验的第二步是将体外培养的肿瘤细胞注射至rag2 null免疫缺陷小鼠眼球的玻璃体腔或视网膜下腔。该操作流程的第三步是监测注射后的小鼠是否出现肿瘤形成的迹象，包括白瞳症、GLO增大以及眼周膨胀。最后一步是收获异种移植肿瘤。最终，可通过组织病理学检查获得结果，显示小鼠眼球内原位肿瘤的形成。由于眼内注射操作精细，对该技术进行直观演示至关重要。如果周围结构未能被正确识别，很容易造成损伤。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为将注射物注入玻璃体腔时需要精确定位，以确保肿瘤细胞被准确送达目标位置。现在，该方法可为视网膜母细胞瘤的生物学特性提供深入见解，也可应用于其他系统，例如用于基因转移的载体眼内给药。首先，在无菌处理过的10厘米组织培养皿中配制新鲜的特定干细胞培养基。将视网膜母细胞瘤组织置于培养皿中，吸除过量的转运培养基，保留足够防止组织干燥的液体。立即使用手术刀采用交叉切割法对组织进行机械性解离，并向组织中加入100微升的特定干细胞培养基，用手术刀轻轻铺开切碎的组织。接着，向培养皿中加入10毫升的特定干细胞培养基。将培养皿置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育，每日观察培养物是否出现浑浊及pH值变化。在充分观察到新生长后，一些肿瘤球应几乎立即从破碎的肿瘤组织中形成，并在7至10天内数量逐渐增加。此后每周，以300 × g离心肿瘤球5分钟，弃上清，将其重悬于 freshly prepared 的特定干细胞培养基中，轻柔吹打10次，以破碎中央坏死的大肿瘤球，促进新的健康肿瘤球形成。为准备用于注射的培养肿瘤球，将肿瘤球轻柔转移至15毫升锥形管中。轻柔吹打10至15次以分散肿瘤球。使用台盼蓝排除死细胞后，通过血细胞计数板对拟注射的细胞进行计数。根据可用细胞数量和实验需求，准备相应次数的注射。接下来，以300 × g离心5分钟。小心吸除上清液，并将细胞重悬于5 mL中。用PBS重复离心和吸弃步骤一次。最后，将细胞重悬于每注射样本10 µL无菌PBS中。开始操作前，先将麻醉后的小鼠置于加热垫上以准备动物。为维持体温，向右眼滴入一滴盐酸丙烷肾上腺素，等待一分钟。接着向右眼滴入一滴盐酸去氧肾上腺素，等待五分钟。若瞳孔未出现散大，可再次滴入一滴，并再等待五分钟。将麻醉后的动物侧置于显微镜下，头部垫在纱布上。使右侧朝上，居中对准眼睛，以获得右眼的红光反射。通过显微镜观察眼底时，用两根手指同时轻轻下压眼睑，以支撑并固定右眼球。在整个操作的剩余过程中保持此位置稳定。使用连接至鲁尔锁注射器的无菌30号针头，从角膜缘附近睫状体平坦部区域的结膜和巩膜侧向穿刺，穿透脉络膜，进入玻璃体腔。将针头从开口处取出。使用酒精棉片对 Hamilton 针头进行消毒。将细胞悬液吸入 Hamilton 注射器中，然后将针头插入开口，直至在显微镜下可见针头穿过玻璃体位于晶状体后方靠近视网膜的位置。在另一人的协助下，保持针头在此位置稳定，同时按压推杆，缓慢拔出针头。如有必要，可用棉签吸去穿刺处的血液或液体。轻柔释放压力，使小鼠眼睑闭合。将动物放回加热垫上以恢复。注射后每天检查眼睛是否有白瞳症，该症状通常在注射后两到四周内变得明显。一旦检测到肿瘤生长，根据机构指南对动物实施安乐死。在体视显微镜下，于角膜缘处做环形切口，移除角膜和晶状体，并使用镊子小心地将大部分肿瘤组织与其他组织分离。将肿瘤置于无菌 RPMI 1640 培养基中。使用镊子缓慢将眼球从眼眶中拉出，直至视神经暴露。在轻轻抬起眼球的同时，用剪刀剪断视神经，尽量保留较多的神经组织附着在眼球上，以便评估肿瘤对视神经的侵袭情况，并将标本置于10%中性缓冲福尔马林中用于组织学检查。这是培养的肿瘤球体的一个示例。培养三天后，在解离的肿瘤组织中仅可见少量肿瘤球体。然而，培养至10天时，肿瘤球体的数量明显增加。注射数周后，如右上角插图所示，球状结构呈现出清晰的外膜。注射的小鼠出现白瞳症，即瞳孔反射呈白色，这是由于肿瘤位于眼球后部所致。在这些苏木精和伊红（H&E）染色的眼部切片示例中，注意左侧眼中异种移植的视网膜母细胞瘤充满玻璃体腔，而右侧对照注射眼则无此类生长物。观看本视频后，您应能够充分了解如何制备培养的肿瘤细胞、正确地在小鼠眼部进行眼内注射，以及如何观察肿瘤的进展。一旦掌握该注射技术，每只动物的操作可在大约30分钟内完成。操作过程中务必注意，肿瘤细胞可能存在生物危害，因此必须采取适当的防护措施，例如穿戴合适的个人防护装备（PPE），包括实验服和口罩。人源癌细胞的操作必须始终在生物安全二级（BSL-2）条件下进行。

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