幼虫和成体中增强子捕获型Flippase表达的定位与应用 果蝇 中枢神经系统

以下实验的总体目标是利用组织特异性脂肪酶结合 GAL80 转换工具，优化 GAL4 的表达。该目标通过构建一系列增强子捕获 Philippe 转基因果蝇品系，并确定每个品系中脂肪酶在中枢神经系统（CNS）的表达模式来实现。利用 GFP 报告基因的免疫化学染色及 GFP 报告信号，可在含有 GAL80 转换工具的子代果蝇中，将胶质细胞（GL）与神经元表达区分开来，从而在目标增强子捕获 flip（ET flip）品系中实现 GAL4 表达的交叉分析。

克隆分析可用于研究GAL4表达的精细化过程，例如在眼睛中的表达。与现有方法相比，该技术的主要优势在于，可以结合增强子片段驱动的品系以及GAL80转换工具，利用果蝇研究领域已广泛提供的多种GAL4品系进行快速筛选。此外，这一策略还可拓展至其他基于GAL4-UAS系统的新兴模式生物，如斑马鱼。

该方法有助于解答行为相关神经环路图谱绘制中的关键问题。尽管本实验方案展示了在部分感光细胞中使用 flip 基因开关的应用，但这种交叉遗传方法也可用于其他组织的分析，包括非神经组织。随着越来越多的增强子捕获型脂酶品系得到鉴定。

果蝇GAL4系统是果蝇生物学家广泛使用的一种重要技术。大多数GAL4品系的一个局限性在于其表达范围过于广泛，因此无法用于通过功能性成像方法进行脑与行为的图谱绘制。在利用ET-Flp转基因技术部分限制GAL4表达之前，无法对目标组织中的GAL4表达进行精细调控。

首先，了解 ET flip x two 转基因在晚期发育幼虫及成虫中的表达模式有助于可视化 CNS 中 flip a 的表达。将携带目标 ET t flip X two 转基因的雄性果蝇与携带 et flip 表达的 GFP 报告基因的处女雌蝇进行杂交。收集 F1 代爬行三龄幼虫用于解剖。将其放入干净的 S guard 培养皿中，用画笔清除任何碎片，并用一倍 PBS 冲洗培养皿一次。

现在用冰冷的1倍PBS充满培养皿，以麻醉幼虫，从而获取幼虫的中枢神经系统。用一对镊子夹住幼虫的口钩，抓住前端膨大的球状结构附近的表皮并向后剥离。中枢神经系统会连同其他一些结构一起附着在口钩上。

现在用镊子在解剖中枢神经系统（CNS）时，去除所有围绕 CNS 的多余组织。将每一份样本单独转移至盛有 PBS 的三孔玻璃培养皿中。待所有 CNS 组织解剖完成后，将其完全浸入冰上预冷的 200 µL 4% PFA 溶液中进行固定。

如果中枢神经系统（CNS）漂浮，说明其周围的组织尚未完全清除。若发生此情况，在固定15分钟后，使用一对镊子将CNS重新浸入固定液中，用预冷的PBS洗涤组织3次，然后再用预冷的PBT洗涤3次。此时组织已准备好进行成像、抗体标记，或可在4°C的PBT中保存以备后续使用。

使用同一杂交组合进行染色，以在解剖前收集F1代成虫。将5至10只果蝇浸入预冷的95%乙醇中30秒，以去除体壁表面的蜡质。为去除乙醇，用冰浴的1× PBS洗涤成虫三次；第三次洗涤后，将其中一只转移至盛有冰浴1× PBS的35毫米Silguard培养皿中，以准备成虫解剖。

将其腹面朝上放置，并在腹部中段插入一枚 minion 针。用镊子去除足部开始解剖。然后固定头部的口器部位，同时从眼下方开始将头壳自下而上剥离，以去除头部的角质层。

使用锋利的镊子小心操作，移除并清除脑部周围具有强自发荧光的脂肪组织，因为这些组织会在固定过程中导致脑组织漂浮。脑仅仅是成年中枢神经系统的一部分，另一部分是位于胸部的腹神经索（VNC），也必须进行解剖。

首先，固定果蝇后足基部，轻轻撕除从胸部至颈部基部的胸段角质层。其次，轻轻撑开胸段角质层的两半，以暴露腹神经索（VNC）。第三，固定第二对足的基部，从第一腹节腹板附近将腹部从胸部拉离，从而移除腹部。

第四步，通过固定肱节区域并轻轻撕除腹神经索（VNC）周围组织来清理VNC。撕开环绕颈连接处的环形结缔组织，并在采集脑组织的同时继续去除多余组织。将脑和VNC以类似梨形的方式转移至一个盛有预冷的1×PBS缓冲液的九孔Pyrex培养皿中，该培养皿需置于冰上。

为了固定成年组织，将其浸入冰上预冷的4%PFA中固定15分钟。随后用预冷的PBS洗涤三次，再用PBT洗涤三次。组织此时已准备好进行成像或通过抗体标记，以准确分析转基因表达情况。

使用神经元或胶质细胞标记物对中枢神经系统进行标记有助于提供参考框架。首先在4°C条件下，将组织与针对神经元或胶质细胞的抗体在4°C下孵育过夜。次日，用PBT洗涤样本五次，并在室温下与荧光标记的二抗孵育两小时。孵育过程中需用锡箔纸包裹培养板，以防止抗体发生光漂白。

用PBS清洗样本，然后将样本整体封片至载玻片上。使用OSHA塑料圈以防止盖玻片压碎组织。此时，神经系统已准备好在荧光显微镜下观察GFP和LL的表达模式。

通常检测三到五个重复样本，以确定 flip 表达模式的可重复性。flip 表达模式在 flip 品系中可与其他转基因结合使用，以改变 GAL4 抑制因子 GAL80 的表达方式。改变 GAL80 抑制因子的表达是实现调控的有效方法。

在GAL4表达系统中，一种方法是通过转基因介导的GAL80表达翻转（flip-out）来消除GAL80对GAL4的抑制作用。GAL80通常会抑制GAL4的活性，而GAL4在眼部持续表达会引发全眼范围的感光细胞退化。本实验使用ET-flip品系hash688A，用于在F1代子代的部分感光细胞中评估GAL80翻转工具的有效性，并将子代表型与亲本品系的眼部表型进行比较。若出现任何眼部畸形或色素脱失现象，则表明翻转表达模式已在感光细胞中成功实现，且GAL80的翻转切除（flipout）有效。

另一种互补的非冗余策略是利用相同的感兴趣翻转品系来激活 GAL80 的表达。该策略与前述方法非常相似，但现在 F1 代子代中的 ID 色素沉积和退化现象受到抑制。在翻转 X 二代中。

表达光感受器。一旦掌握，若操作得当，成虫中枢神经系统的解剖可在约五分钟内完成，幼虫则仅需一分钟。进行此操作时，重要的是使用锋利的镊子去除气管以及成虫和Libre C及Ss周围组织。解剖时必须使用不含固定剂的培养皿。目前采用热激翻转法来产生随机克隆。

相比之下，增强子捕获型 flip 技术能够产生可重复的克隆，从而更便于进行形态学和行为学分析。手指法（finger method）的另一个优势在于，可以通过使用额外的增强子捕获型 flip 品系及其他 gal 品系，进一步限制 GAL4 表达模式。tubulin stop GAL80 构建方式的一个缺点是，某些 GAL4 与 UAS 效应元件的组合（例如 LAG4 与 UAS-KIR）并不兼容，因为这些组合会导致果蝇死亡。

通过使用条件性 UAS 效应子（例如 UAS Shiri Ts）可以轻松克服这一问题，该效应子可在限制性温度下检测行为。正如预期的那样，并非所有增强子捕获脂肪酶品系都能表达出足够高水平的脂肪酶以供使用。尽管如此，本文所述的手指技术为果蝇研究人员提供了一种新方法，可用于优化嵌合体分析，无论是在发育回路还是行为研究方面。