Name: 幼虫和成人测绘和增强子陷阱Flippase表达中的应用果蝇中枢神经系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 了解FINGR方法在果蝇中枢神经系统中利用Flippase调控Gal4表达的精细技术。该方法通过增强子陷阱品系实现组织特异性基因表达控制，为神经环路映射和克隆分析提供强大工具。

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感谢俄克拉荷马大学的内部基金（资助人：BZ）以及美国国家科学基金会（NSF）的资助（项目号：IOS-1025556，资助人：BZ 和 RAB），为 TRF、RAB、XP、AAO、MLW、CAS 及本研究提供了支持。美国国立卫生研究院（NIH）的资助（项目号：RO1 NS060878，资助人：BZ）为 RAB 提供了部分支持。RAB 还感谢美国国立卫生研究院 NRSA（T32 NS07292）培训基金授予布兰迪斯大学，以及 NIH 基金（项目号：RO1 GM21473，授予布兰迪斯大学 Jeffrey Hall）对本研究早期阶段的支持。我们感谢 Jeffrey Hall 对本项目持续的鼓励。感谢 Kristin Scott 博士为我们提供 tubP&gt;Gal80&gt; 菌株。

1. Drosophila 品系
<ol>
<li>Gal4 驱动系： 
GMR-Gal4，可在感光细胞中表达 Gal4。</li>
<li>UAS 系 
UAS-MJD78Q（或 UAS-polyQ），可在表达 Gal4 的细胞中引发神经退行性变。 
UAS-GFP，可在表达 Gal4 的细胞中表达 GFP。</li>
<li>FLP 系 
ey-FLP，可在感光细胞及部分脑区中表达 FLP。 
ET-FLPx2 系，为包含两份 FLP 拷贝的增强子捕获系（FLP-IRES-FLP）。我们已构建约 1,000 个 ET-FLP 系（Bohm 等，2010），其表达模式尚未完全鉴定。本文描述了部分 ET-FLPx2 系在幼虫及成体果蝇中枢神经系统（CNS）中的表达模式鉴定。</li>
<li>FLP 报告系 
yw, actinP&gt;CD2&gt;Gal4; UAS-GFP（Pignoni &amp; Zipursky, 1997），通过 FLP 介导的重组切除 &gt;CD2，利用 actinP&gt;Gal4; UAS-GFP 报告 ET-FLPx2 的表达模式。</li>
<li>两种互补的 Gal80 转换工具 
TubP&gt;Gal80&gt;（Gordon &amp; Scott, 2009），为翻出型构建体，由强微管蛋白启动子驱动，在所有组织中组成型表达 Gal80。经 FLP 介导的重组后，&gt;Gal80 被翻出，仅在表达 ET-FLPx2 的组织中终止 Gal80 表达。 
TubP&gt;stop&gt;Gal80（Bohm 等，2010），为翻入型构建体，正常情况下不表达 Gal80。仅在表达 ET-FLPx2 的组织中，FLP 将 &gt;stop 翻出并将 Gal80 翻入，从而启动微管蛋白启动子驱动的 Gal80 表达。</li>
<li>用于检测复眼 FLP 活性的果蝇品系 
GMR-Gal4, UAS-polyQ; tubP&gt;stop&gt;Gal80（Bohm 等，2010），其复眼退化且脱色素。在表达 FLP 的感光细胞中，随着 Gal80 的翻入，polyQ 表达被关闭。 
GMR-Gal4, UAS-polyQ; tubP&gt;Gal80&gt;（Bohm 等，2010），其复眼正常。在表达 FLP 的感光细胞中，随着 Gal80 的翻出，polyQ 表达被开启。</li>
</ol>

2. 试剂
磷酸盐缓冲液（PBS，1X），pH 7.4。 
4% 多聚甲醛（PFA），用 PBS 将 16% PFA（电子显微镜科学公司，Hatfield，PA，货号#15710）稀释而成 
PBT，含 0.1% Triton-X 100（Sigma）的 1X PBS 
抗 Elav 抗体（单克隆抗体，9F8A9；爱荷华大学发育研究杂交瘤库），标记果蝇中的所有神经元。 
抗 Repo 抗体（单克隆抗体 8D12；爱荷华大学发育研究杂交瘤库），标记果蝇中的胶质细胞。 
Alexa 594 标记的山羊抗小鼠二抗（Invitrogen）

3. 绘制增强子捕获FLPx2品系的表达模式（* 关键步骤）
<ol>
<li>从 yw、actin 品系中收集处女雌蝇P&gt;CD2&gt;Gal4; UAS-GFP 品系与各个 ET-FLPx2 品系的雄性个体杂交。前者作为 ET-FLP 组织表达的 GFP 报告系统。</li>
<li>解剖游走的3期幼虫rd F1 龄幼虫，保留中枢神经系统（即脑和腹神经索，VNC）及体壁，置于冰上用 4% PFA 固定 1 小时，用预冷的 PBS 洗涤 3 次，再用 PBT 洗涤 3 次。 
解剖
<ol>
<li>去除游离的3rd 一龄F1幼虫放入洁净的Sylgard培养皿中（35 mm × 10 mm培养皿，内含2克按说明书配制的Sylgard）。
<ol>
	<li>用画笔清除食物残渣</li></ol></li>
<li>用预冷的1×PBS填充培养皿，并将培养皿置于冰上以麻醉幼虫</li>
<li>用一对镊子夹住幼虫的口钩，用另一对镊子夹住靠近伸出的前气门处的表皮，向后端方向剥离表皮。中枢神经系统将与口钩、唾液腺、肠道及成虫盘一同被剥离出来。</li>
<li>去除中枢神经系统（CNS）周围多余的组织和成虫盘。</li>
<li>将中枢神经系统（CNS）转移至盛有PBS的3孔Pyrex培养皿中。<ol>
		<li>可使用硅化处理的P200移液器吸头以避免组织干燥。</li></ol></li> 
<li>固定1小时 200 μl 4% PFA 冰上固定<ol>	
		<li>确保中枢神经系统完全浸没在PFA中。<ol>
				<li>如果中枢神经系统（CNS）漂浮，通常表明其周围组织未被彻底清除。</li></ol></li></ol></li> 
<li>用预冷的 PBS 洗涤 3 次，随后用 PBT 洗涤 3 次。</li>
</ol>
</li>
<li>解剖成年F1代果蝇的中枢神经系统。
<ol>
<li>用CO₂麻醉果蝇2 或将装在空试管中的果蝇置于冰上10分钟。</li>
<li>将成年果蝇放入盛有95% EtOH的玻璃培养皿中，置于冰上处理30秒。</li>
<li>将成年果蝇转移至盛有冰上预冷的1×PBS的玻璃培养皿中。<ol>
		<li>用预冷的1×PBS洗涤3次，以去除残留的乙醇</li></ol></li> 
<li>将一只果蝇放入盛有冰冻 1X PBS 的 35 mm Sylgard 培养皿中</li>
<li>将腹面朝上放置，并将一枚小型昆虫针（minutiens pins 0.1 mm）插入腹部中段。<ol>
		<li>用一对镊子夹住腿部基部，用另一对镊子去除腿部。</li></ol></li>
<li>去除头部角质层<ol>
	<li>用一对镊子夹住喙的同时，将另一对镊子置于复眼下方，向头部背侧中线方向剥离头壳。</li> 
	<li>抓住另一只眼睛，去除另一侧剩余的角质层。</li> 
	<li>使用尖头镊子和/或 sharpened tungsten 针去除脑周围气管组织<ol>
	<li>气管清洗不当会导致强烈的自发荧光，干扰GFP表达，并使脑组织在固定过程中漂浮</li></ol></li></ol></li>
<li>延髓-颈髓解剖<ol>
		<li>去除胸部角质层<ol>
				<li>从胸部后端开始，在两侧各放置两把镊子rd 前胸腹板（即抓住后腿基部）。</li>
				<li>轻轻将表皮从腹侧中线分离，重复此操作直至到达颈部基部。</li> 
				<li>轻轻分开胸部表皮的两半，暴露腹神经索（VNC）</li></ol></li>
		<li>接下来，将腹部从胸部移除。用一对镊子夹住胸部的第二对足基部以固定胸部，同时用另一对镊子夹住腹部第一节腹胸板附近，将腹部拉下。</li>
		<li>用一对镊子夹住肱部区域，再用另一对镊子轻轻撕除大部分胸部组织，以去除VNC周围的胸腔组织。</li> 
		<li>此时，颈连接处周围应有一圈结缔组织。使用两把镊子将该环状组织撕开。</li> 
		<li>去除围绕腹神经索（VNC）的多余胸部组织</li></ol></li> 
<li>将脑和腹神经索转移至含有冰上预冷的1X PBS的9孔Pyrex培养皿中<ol>
		<li>可使用硅化P200移液枪头以避免组织干燥</li></ol></li>
</ol>
</li>
<li>在冰上用4% PFA固定成年中枢神经系统1小时，用预冷的PBS洗涤3次，再用PBT洗涤3次。</li>
<li>孵育成年中枢神经系统标本或幼虫中枢神经系统与体壁 4°C 过夜孵育一抗，抗体选择神经元标记（抗-Elav，1:10）或胶质细胞标记（抗-Repo，1:10）。用PBT洗涤样本5次。</li>
<li>将成体或幼虫样本与Alexa 594标记的鸡抗小鼠二抗（1:100）在室温下孵育2小时，随后用PBS洗涤样本。</li>
<li>将幼虫或成虫的中枢神经系统（CNS）置于载玻片上。为保持CNS的自然形态，可在载玻片上使用O形塑料环（Clear Reinforcement Label，Avery Dennison，Office Products，Brea，CA）作为微型支架，以悬空方式支撑盖玻片。</li>
<li>在荧光显微镜下观察GFP和Elav（或Repo）表达模式的制备情况。</li>
</ol>
4. 两种互补的Gal80转换工具在光感受器中抑制Gal4的应用
<ol>
<li>通过 tubP&gt;Gal80&gt; 系统将 Gal80 翻转出去（图 5A）。<ol>
		<li>收集 GMR-Gal4, UAS-polyQ; tubP&gt;Gal80&gt; 品系的雄蝇。注意，这些果蝇的复眼表型正常。</li>
		<li>与 ey-FLP 处女蝇杂交。</li>
		<li>收集 F1 代果蝇并观察其眼部表型。</li></ol></li>
<li>通过 tubP&gt;stop&gt;Gal80 系统将 Gal80 翻转进入（图 5B）。<ol>
		<li>收集 GMR-Gal4, UAS-polyQ; tubP&gt;stop&gt;Gal80 雄性果蝇，并观察其眼部表型。注意，与野生型品系（Canton-S）相比，这些果蝇的眼部出现退化和脱色素现象。</li>
		<li>与 ey-FLP 处女蝇杂交；</li>
		<li>收集 F1 代果蝇并观察其眼部表型。</li></ol></li>
<li>筛选在感光细胞中具有表达的 ET-FLPx2 品系</li>
</ol>
可使用在部分感光细胞中表达FLP的ET-FLPx2品系重复步骤4.1和4.2。或者，可将GMR-Gal4, UAS-polyQ; tubP&gt;stop&gt;Gal80果蝇或GMR-Gal4, UAS-polyQ; tubP&gt;Gal80&gt;果蝇分别与各个ET-FLPx2品系杂交，以筛选在感光细胞中表达FLP的品系。有价值的ET-FLPx2品系是在部分或单个感光细胞中特异性表达FLP的品系（图6）。
5. 代表性结果
通过将 yw, actinP&gt;CD2&gt;Gal4; UAS-GFP 处女蝇与 ET-FLPx2 雄蝇杂交，可方便地观察并记录特定 ET-FLPx2 品系在 F1 代幼虫或成虫中的表达模式（图1）。通常需解剖并检测3至5个重复的F1代个体，以确定FLP表达模式的可重复性（Bohm 等，2010）。图2展示了ET-FLPx2品系173A在幼虫和成体中枢神经系统（CNS）中FLP的表达模式。可进一步利用神经元或胶质细胞标记物对FLP表达模式进行分析（图3和图4）。
所示结果 图7 说明Gal80翻入和翻出系统在FLP介导的重组后对Gal4进行交叉抑制的有效性。tubP&gt;停止&gt;Gal80 构建体似乎未表现出任何Gal80的泄漏表达（基于感光细胞均匀的退化和脱色素现象），但在eyFLP的辅助下，其翻转Gal80的效率可达100%，从而有效抑制GMR-Gal4并使眼睛恢复至正常外观图 7A）。相反，管P&gt;Gal80&gt; 完全抑制 GMR-Gal4，直至引入 eyFLP。在 Gal80 翻转切除后，GMR-Gal4 驱动 UAS-polyQ 表达，导致眼睛退化和脱色素图 7B）。在此示例中，我们使用了一种泛光感受器FLP来绘制光感受器的“神经回路”，但未研究其行为学后果。通过采用类似方法并结合与行为相关的Gal4品系，我们绘制了部分调控成年果蝇翅膀展开的CCAP-Gal4神经回路（Bohm et al., 2010）。我们认为，FINGR方法将有助于深入理解行为的神经基础。
<img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig1.jpg" alt="果蝇遗传杂交图解；ET-FLPx2 表达；UAS-GFP 标记研究；性别二态性。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 检测 ET-FLPx2 品系的表达模式。 通过将 ET-FLPx2 雄性（左上）与 actinP&gt;CD2&gt;Gal4; UAS-GFP 雌性（右上）杂交，可确定 ET-FLPx2 品系中 FLP 的表达模式（蓝色椭圆）。在母本雌性中，由于两侧由 FRT（灰色三角形）包围的 CD2 序列插入，泛在的 ActinP&gt;Gal4 表达受到阻断。在 F1 后代中，FLP 会切除 CD2 序列，从而允许 ActinP&gt;Gal4 驱动 UAS-GFP 的表达。
<img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig2.jpg" alt="果蝇发育显微观察，ET-FLP 173A 幼虫与成虫，荧光分析比较。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. ET-FLPx2 品系在幼虫和成虫中枢神经系统中的表达模式。这些图像显示的是将 yw, actinP&gt;CD2&gt;Gal4; UAS-GFP 亲本与 ET-FLPx2 173A 品系杂交后，其后代的中枢神经系统（脑和腹神经索，VNC）解剖样本。通过 FLP 介导的重组去除 &gt;CD2&gt; 插入片段，从而激活 actinP&gt;GAL4 的表达（进而驱动 UAS-GFP 的表达）。因此，GFP 的表达模式反映了 FLP 表达细胞的分布。图版 A 显示了幼虫期的 FLP 表达模式，而图版 B 显示了 173A 品系成虫期的表达模式。
<img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig3.jpg" alt="神经组织的荧光显微镜图像，GFP 标记显示基因表达，比例尺 200 μm。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. ET-FLPx2 #688A品系中表达翻转酶的细胞类型表征。 A，固定F1 3的复合图像rd ET-FLPx2 品系 #688A 与 GFP Flippase 报告品系杂交所得的龄期幼虫，经抗-REPO 染色。 B-D，从3龄幼虫腹神经索（VNC）后端获取的高倍放大图像（蔡司Plan-Apochromat 63倍油镜）rd 龄幼虫
<img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig4.jpg" alt="显示基因表达模式的荧光显微镜图像；神经细胞中的GFP、REPO标记物。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. ET-FLPx2 品系 #150 蘑菇体中细胞类型的表征。 A-C，来自固定后的F1三代幼虫蘑菇体的高倍放大图像（63倍油镜），经抗REPO染色。
<img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig5.jpg" alt="基因翻入与翻出策略示意图；GMR-Gal4、polyQ+GFP 通路、Flippase 作用" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5. Gal80 基因翻入与翻出策略示意图。A. 在翻出策略中，由微管蛋白启动子驱动的 Gal80（TubP&gt;Gal80&gt;）持续表达，导致 GMR-Gal4 被抑制，从而呈现野生型眼表型（红眼）。通过引入 FLP（紫色），可将 Gal80 翻出（中间，红色），解除对 GMR-Gal4 的抑制，使其驱动 UAS-polyQ 的表达，进而引起感光细胞退化（以眼内白点表示）。B. 在相反的策略中，微管蛋白启动子驱动的 Gal80 表达被两侧带有 FRT（灰色三角形）的“终止”密码子所阻断。在 Gal80 缺失的情况下，GMR-Gal4 结合 UAS-polyQ，导致感光细胞发生神经退行性变（以眼内白点表示）。通过将 GMR-Gal4、UAS-polyQ；tubP&gt;stop&gt;GAL80 雄性果蝇与在感光细胞中表达 FLP 的处女雌蝇杂交，FLP（紫色）将在 FRT 位点催化重组，切除“终止”密码子（中间，红色），从而允许 Gal80 表达并抑制 GMR-Gal4 活性，挽救感光细胞的神经退行性变（以眼内无白点表示）。
<img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig6.jpg" alt="果蝇复眼表型；遗传杂交结果；显微镜图像；UAS-GFP, GMR-Gal4。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6. 使用ET-FLPx2品系#688A通过FINGR方法实现Gal80的翻转切除。 ET-FLPx2品系#688A virgin雌蝇与GMR-Gal4, UAS-polyQ; tubP&gt;GAL80雄蝇杂交所得F1代子代。复眼小眼中间区域缺乏色素表明在#688A品系中FLP有表达。在此区域，Gal80对GMR-Gal4的抑制作用被解除，从而允许Gal4驱动UAS-polyQ的表达。
<img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig7.jpg" alt="果蝇眼突变比较，GMR-Gal4, UAS-polyQ; tub&gt;P&gt;stop&gt;Gal80，实验结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 7"> 
图 7. FINGR 方法在光感受器细胞中通过翻转 Gal80 的插入或切除来与 Gal4 实现交叉表达的应用。A. tubP&gt;stop&gt;Gal80 翻入系统以 FLP 依赖的方式限制 GAL4 的表达。在 GMR-Gal4, UAS-polyQ; tubP&gt;stop&gt;GAL80 果蝇中，光感受器细胞发生退化并失去色素（左侧果蝇）。引入 eyFLP 后，Gal80 在光感受器细胞中表达，从而完全抑制 GMR-Gal4，进而关闭 polyQ 的表达，产生具有正常眼睛的果蝇（右侧果蝇）。B. tubP&gt;Gal80&gt; 翻出系统的作用方式与 tubP&gt;stop&gt;Gal80 翻入系统相反。tubP&gt;Gal80&gt; 持续抑制 GAL4，从而抑制 polyQ 的表达（左侧果蝇，具有正常眼睛）。引入 eyFLP 后，Gal80 从光感受器细胞中被翻出，解除对 GMR-Gal4 的抑制，从而启动 polyQ 的表达。这导致果蝇出现退化且无色素的眼睛（右侧果蝇）。

<ol><li>Bohm, R. A., Welch, W. P., Goodnight, L. K., Cox, L. W., Henry, L. G., Gunter, T. C., Bao, H., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+mosaic+approach+for+neural+circuit+mapping+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A genetic mosaic approach for neural circuit mapping in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 16378-16383 (2010).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Bruno, B., Holbro, N., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+group+genes+are+required+for+neural+stem+cell+survival+in+postembryonic+neurogenesis+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Polycomb group genes are required for neural stem cell survival in postembryonic neurogenesis of Drosophila.</a> Development. 134, 1091-1099 (2007).</li>
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<li>Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+tissue+specific+transgene+expression+system+using+inducible+GAL4%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A conditional tissue specific transgene expression system using inducible GAL4.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12596-12601 (2001).</li>
<li>Pignoni, F., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Drosophila+eye+development+by+decapentaplegic%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Induction of Drosophila eye development by decapentaplegic.</a> Development. 124, 271-278 (1997).</li>
<li>Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P%5BSwitch%5D%2C+a+system+for+spatial+and+temporal+control+of+gene+expression+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 12602-12607 (2001).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

Gal4/UAS 系统已被果蝇研究者广泛而成功地应用于各种生物学研究（Brand &amp; Perrimon, 1993；Duffy, 2002）。迄今为止，果蝇研究领域已构建了数千个由启动子驱动或增强子捕获的 Gal4 品系。FINGR 方法的一个主要优势在于其与 Gal4/UAS 系统兼容，从而可显著拓展 Gal4 在果蝇研究中的应用能力。
FINGR 方法的一个重要应用是通过 Gal4/Gal80 交集策略精细调控与行为相关的神经环路。这些行为可能包括但不限于学习与记忆、求偶、睡眠以及昼夜节律。FINGR 方法还可用于绘制在模拟人类神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症（ALS）和帕金森病）中易发生神经退变的关键神经元。类似地，介导可卡因、酒精及其他物质成瘾的关键神经元群或神经环路也可利用 FINGR 方法进行定位。需要注意的是，条件性 Gal4 系统（Osterwalder 等，2001；Roman 等，2001）可与 FINGR 方法结合使用，以实现对神经环路和行为的时间特异性调控。通过使用温度敏感型 Gal80（Gal80ts，McGuire 等，2003）对 Gal80 转换工具进行改造，可构建 tubP&gt;stop&gt;Gal80ts 或 tubP&gt;Gal80ts&gt; 系统，从而在环路操控中提供更高的时间灵活性。除了神经系统外，FINGR 方法同样适用于在特定细胞亚群中限制 Gal4 的表达，无论是在翅还是在腿中。
ET-FLPx2 品系将为所有对基于 FRT/FLP 的克隆分析（Xu &amp; Rubin, 1993）感兴趣的果蝇生物学家提供宝贵的资源，包括 MARCM 技术（Lee &amp; Luo, 1999）。预计某些 ET-FLPx2 品系还可替代热激诱导的 FLP 系统，用于生成可重复的克隆，并进行重复的形态学和行为学分析。与增强子捕获 Gal4 品系类似，大多数 ET-FLPx2 品系不太可能仅在研究者感兴趣的特定细胞中特异性表达。大多数品系不仅会在目标细胞中表达 FLP，同时也会在其他细胞或组织中表达。然而，只要 Gal4 与 ET-FLPx2 的共同表达区域符合特定实验的需求，二者缺乏“组织特异性”就不会对 FINGR 方法构成主要问题。FINGR 的设计目的正是将两种“广泛”表达的系统转化为一种精确的系统。
这些方案中描述的方法较为常规，应具有可重复性。需要特别注意的主要步骤是固定剂的选择和使用。应避免使用除PFA以外的其他固定剂，因为它们会淬灭GFP信号。我们还注意到，不应在解剖皿中使用PFA进行固定，以避免FLP表达无法被GFP可靠报告的可能性。

幼虫和成体中增强子捕获型flippase表达的定位与应用 果蝇 中枢神经系统

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

Gal4/UAS 双元系统在 Drosophila 的基因与神经环路操控中具有强大功能。然而，在大多数神经生物学研究中，Gal4 的表达通常难以达到足够的组织特异性，从而限制了神经环路与行为读数之间的精确关联。为克服这一主要障碍，我们近期开发了 FINGR 方法，以实现目标组织中更为严格的 Gal4 表达。FINGR 方法包含三个组成部分：1）传统的 Gal4/UAS 系统；2）一组由 FLP/FRT 介导的 Gal80 转换工具；3）增强子捕获型 FLP（ET-FLP）。Gal4 用于定义目标初级神经环路。将 Gal4 与 UAS 效应子（如 UAS-MJD78Q 或 UAS-Shits）配对，可调控神经元活性，进而表现为果蝇行为的改变。通过额外引入 UAS 报告基因（如 UAS-GFP），可同时对参与特定行为的神经环路进行形态学分析的定位。对于表达范围较广的 Gal4 品系，可利用两种互补的 Gal80 转换工具来限制 Gal4 的表达：tubP&gt;Gal80&gt;（“翻出”）和 tubP&gt;stop&gt;Gal80（“翻入”）。最后，研究人员可借助组织特异性的 ET-FLP 分别开启或关闭 Gal80。在“翻入”模式中，Gal80 将在 Gal4 与 ET-FLP 表达重叠的区域抑制 Gal4 的表达；在“翻出”模式中，Gal80 将在 Gal4 与 FLP 表达重叠的细胞中解除对 Gal4 的抑制。这两种策略均可限制 Gal4 定义的神经环路中的细胞数量，但作用模式相反。FINGR 方法可兼容果蝇研究领域中已有的大量 Gal4 品系，适用于传统克隆分析及神经环路定位，具有高度通用性。在本方案中，我们展示了在选定的 ET-FLPx2 品系中 FLP 表达模式的定位，以及 FINGR 方法在光感受器细胞中的有效性。FINGR 方法的原理也应适用于其他使用 Gal4/UAS、Gal80 和 FLP/FRT 系统的遗传模式生物。

我们描述了一种由翻转酶诱导的交叉Gal80/Gal4抑制（FINGR）方法，该方法利用组织特异性的FLP来决定Gal80的表达模式。在Gal4与FLP表达重叠的区域，Gal4的表达将被开启（Gal80被翻出）或关闭（Gal80被翻入）。FINGR方法在克隆分析和神经环路图谱绘制中具有广泛的适用性。

幼虫和成体中增强子捕获型Flippase表达的定位与应用 果蝇 中枢神经系统

Gal4/UAS 双元系统在果蝇基因与神经环路操控中具有强大功能。然而，对于大多数神经生物学研究而言，Gal4……

以下实验的总体目标是利用组织特异性脂肪酶与 GAL80 转换工具，优化 GAL4 的表达。该目标通过构建一系列增强子捕获 Philippe 转基因果蝇品系，并确定每个品系中脂肪酶在中枢神经系统（CNS）的表达模式来实现。利用 GFP 报告基因的免疫化学染色及 GFP 报告信号，可在含有 GAL80 转换工具的子代果蝇中，将胶质细胞（GL）与神经元表达区分开来，从而在目标增强子捕获 flip（ET flip）品系中实现 GAL4 表达的交叉分析。克隆分析可用于研究GAL4表达的精细化过程，例如在眼睛中的表达。与现有方法相比，该技术的主要优势在于，可以结合增强子片段追踪品系以及GAL80转换工具，利用果蝇研究领域已广泛提供的多种GAL4品系进行快速筛选。此外，这一策略还可拓展至其他基于GAL4-UAS系统的新兴模式生物，如斑马鱼。该方法有助于解答行为相关神经环路图谱绘制中的关键问题。尽管本实验方案展示了在部分感光细胞中使用flip碱基的方法，但这种交叉方法也可应用于其他组织的分析，包括非神经组织。随着越来越多的增强子捕获型脂酶品系得到鉴定。果蝇GAL4系统是果蝇生物学家广泛使用的一种重要技术。大多数GAL4品系的一个局限性在于，其表达范围过于广泛，无法用于通过功能性成像方法进行脑与行为的映射研究。在利用ETn-flip转座子转基因对GAL4表达品系的表达范围进行部分限制之前，无法精确调控目标组织中的GAL4表达水平。首先，了解 ET flip x two 转基因在晚期发育幼虫及成虫中的表达模式有助于可视化 CNS 中 flip a 的表达。将携带目标 ET t flip X two 转基因的雄性果蝇与含有 et flip 表达 GFP 报告基因的雌性 virgin 果蝇进行杂交。收集 F1 代爬行三龄幼虫用于解剖。将其放入干净的 S guard 培养皿中，用画笔清除任何碎片，并用一倍 PBS 冲洗培养皿一次。现在用冰冷的1倍PBS充满培养皿，以麻醉幼虫，从而获取其幼虫中枢神经系统。用一对镊子夹住幼虫的口钩，抓住前端膨大部分附近的体壁，将其剥离。中枢神经系统会连同其他一些结构一起附着在口钩上。现在用镊子在分离中枢神经系统（CNS）时，去除所有围绕CNS的多余组织。将每一份样本单独转移至装有PBS的三孔玻璃培养皿中。待所有CNS组织分离完成后，将其完全浸入冰上盛有200 µL 4% PFA的溶液中进行固定。如果中枢神经系统（CNS）漂浮，说明其周围的组织尚未完全清除干净。若发生此情况，在固定15分钟后，使用一对镊子将CNS重新浸入固定液中，用预冷的PBS洗涤组织3次，然后再用预冷的PBT洗涤3次。此时组织已准备好进行成像、抗体标记，或可在4°C的PBT中保存以备后续使用。使用同一杂交组合进行染色，以收集用于解剖前的F1代成虫。将5至10只果蝇浸入预冷的95%乙醇中30秒，以去除体壁表面的蜡质。为去除乙醇，用冰浴的1×PBS清洗成虫三次；第三次清洗后，将其中一只成虫转移至盛有冰浴1×PBS的35毫米Silguard培养皿中，以准备成虫解剖。将其腹面朝上放置，并在腹部中段插入一枚 minion 针。用镊子去除足部开始解剖。然后固定头部的口器部位，同时从眼下方开始将头壳自下而上剥离，以去除头部的角质层。使用锋利的镊子小心操作，去除并清除脑部周围具有强自发荧光的追踪组织，因为这些组织会在固定过程中导致脑组织漂浮。脑仅仅是成年中枢神经系统的一部分；另一部分是位于胸部的腹神经索（VNC），也必须进行解剖。 首先，固定果蝇后足基部，轻轻剥离胸部角质层至颈部基部，以去除胸部角质层。其次，轻轻撑开胸部角质层的两半，以暴露腹神经索（VNC）。第三，固定第二对足的基部，从第一腹节腹板附近将腹部从胸部拉离，以分离腹部与胸部。第四步，通过固定肱节区域并轻轻撕除围绕腹神经索（VNC）的组织来清洁VNC。撕开环绕颈连接处的环形结缔组织，并在采集脑组织的同时继续去除多余的组织。将脑和VNC以类似梨形的方式转移至一个盛有预冷的1×PBS的九孔Pyrex培养皿中，该培养皿需置于冰上。为了固定成年组织，将其浸入冰上预冷的4%PFA中固定15分钟。随后用预冷的PBS洗涤三次，再用PBT洗涤三次。此时组织已准备好进行成像或通过抗体标记，以准确分析转基因表达情况。使用神经元或胶质细胞标记物对中枢神经系统进行标记有助于提供参考框架。首先在4°C条件下，将组织与针对神经元或胶质细胞的抗体在4°C下孵育过夜。次日，用PBT洗涤样本五次，并在室温下与荧光标记的二抗孵育两小时。孵育过程中需用锡箔纸包裹培养板，以防止抗体发生光漂白。用PBS清洗样本，然后将样本整体封片至载玻片上。使用OSHA塑料圈以防止盖玻片压碎组织。此时，神经系统已准备好在荧光显微镜下观察GFP和LL的表达模式。通常检测三到五个重复样本，以确定 flip 表达模式的可重复性。flip 表达模式在 flip 品系中可与其他转基因结合使用，以改变 GAL4 抑制因子 GAL80 的表达方式。改变 GAL80 抑制因子的表达是实现调控的一种有效方法。在GAL4表达系统中，一种方法是通过转基因手段将GAL80的表达翻转剔除。GAL80的表达通常会抑制GAL4的活性，而GAL4在眼部持续表达时会驱动整个眼睛的退化。本实验使用ET翻转品系hash 6 88 A，用于评估GAL80转换工具在F1代子代部分感光细胞中的有效性，并将子代表型与亲本品系的眼部表型进行比较。若出现任何眼部畸形或脱色素现象，即可证实翻转表达模式存在于感光细胞中，且GAL80的翻转剔除已成功实现。另一种互补的非冗余策略是利用相同的感兴趣翻转品系来激活 GAL80 的表达。该策略与前述方法非常相似，但现在 F1 代子代中的 ID 色素沉积和退化现象受到抑制。在翻转 X 二代中。表达光感受器。一旦掌握，若操作得当，成虫中枢神经系统的解剖可在约五分钟内完成，幼虫则仅需一分钟。进行此操作时，重要的是使用锋利的镊子去除气管以及成虫和Libre C及Ss周围组织。解剖时必须使用不含固定剂的培养皿。目前采用热激翻转法来产生随机克隆。相比之下，增强子捕获型 flip 技术能够产生可重复的克隆，从而更便于进行形态学和行为学分析。手指法（finger method）的另一优势在于，可以通过使用额外的增强子捕获型 flip 品系及其他 gal 品系，进一步限制 GAL4 表达模式。tubulin stop GAL80 构建方式的一个缺点是，某些 GAL4 与 UAS 效应元件的组合（例如 LAG4 与 UAS-KIR）并不兼容，因为这些组合会导致果蝇死亡。通过使用条件性 UAS 效应子（例如 UAS Shiri Ts）可以轻松克服这一问题，该效应子可在限制性温度下检测行为，结果符合预期。并非所有增强子捕获脂肪酶品系都能表达出足够高水平的脂肪酶以供使用。尽管如此，本文所述的手指技术为果蝇研究人员提供了一种新方法，可用于优化嵌合体分析，无论是在发育回路还是行为研究方面。

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了解FINGR方法在果蝇中枢神经系统中利用Flippase调控Gal4表达的精细技术。该方法通过增强子陷阱品系实现组织特异性基因表达控制，为神经环路映射和克隆分析提供强大工具。

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