受运动调节神经元的生理学、形态学及神经化学特征分析

本实验的总体目标是记录单个神经元在运动过程中的生理反应，并进一步表征这些神经元的形态学特征和神经化学性质。首先通过麻醉并对动物进行外科手术准备来实现该目标。下一步是在动物运动过程中对单个神经元的细胞内反应进行电生理记录。

在灌注动物并处理脑组织后，最后一步是观察和分析生理反应及神经元形态。最终，细胞内神经元记录、免疫组织化学与分析技术相结合，可展示运动过程中单个神经元膜电位的变化。该技术相较于细胞培养等现有方法的主要优势在于，能够保持神经元之间的连接和突触输入，且神经元既未被自发切断，也未置于人工培养基中。实验前一天，需向周围靶区注射神经示踪剂（如辣根过氧化物酶），以逆行标记运动神经元。

第二天，将大鼠麻醉后置于加热垫上，使用动物专用剪刀以无菌技术剃除覆盖后颅部的皮肤毛发。沿大腿内侧做一切口，将导管插入股静脉以给予额外麻醉剂。另将一根导管插入股动脉以监测血压。

最后，将套管插入气管。接着，将大鼠置于立体定位仪中。进行开颅手术以暴露小脑，注意避免损伤位于顶骨与间顶骨连接处正下方的大型静脉窦。

接下来，用预热的矿物油覆盖脑表面。然后将下颌粘附到连接电磁振动器的杆上。下颌的运动由信号发生器向振动器发送的指令信号来控制。

接下来，将接地电极置于颅骨开窗部位附近的皮下。为制备细胞内电极，使用IDE或四乙基罗丹明染料溶液灌注微电极。对于大直径轴突，电极阻抗应为60至80兆欧；对于小直径传入轴突和中间神经元，电极阻抗应为80至150兆欧。

接下来，使用固定在动物头部后方的小型望远镜，将微电极插入静电计的前置放大头阶段。通过望远镜的20倍封闭式目镜观察微电极。目标区域位于下丘下缘腹侧约0.5毫米处。

现在在软脑膜上制造一个小开口，以准确定位脑表面。过度补偿电容反馈，使得当电极接触脑组织时产生反馈信号。推进电极直至其进入脑内。

下一步是激活下颌骨的重复位移。然后使用步进电机将电极推进至脑内。当直流电位突然下降并出现持续的突触活动时，表明已到达神经元位置，此时应停止推进电极。

当认为穿透稳定后，开始进行斜坡保持和正弦式钳口运动。记录神经元反应，并根据其反应特性对神经元进行表征。接下来，为绘制该神经元的感受野，使用钝性探针探查头部周围皮肤及口内腔。

探究神经元对其他刺激（如肌肉收缩或有害刺激）的反应。记录完成后，注入1至4纳安的直流电流，总注射量为15至70纳安·分钟。监测电极的穿刺情况，并在适当时候停止电流注入。

如果膜电位变得比负30毫伏更偏正，则下一步是对脑组织进行切片。在处死并灌注动物后，取出脑组织，然后在额状面、矢状面或水平面切割成50至100微米的切片。

为了可视化标记的感觉神经元与多种运动神经元之间的关系，可根据组织类型对组织进行H-R-P-D-A-B或德克萨斯红处理，并可进一步使用荧光显微镜、共聚焦显微镜或定量共定位分析软件进行附加分析。根据需要，可对突触素进行免疫化学处理，以精确定位标记神经元内的突触。该图显示了一个在电生理学特性鉴定后注入IDE的脑干神经元。

根据该神经元在运动过程中的反应，可将其鉴定为次级肌梭传入神经元。棕色轮廓标示三叉神经运动核的位置。该图显示了感觉神经元在下颌位移过程中的生理反应。

神经元的反应以瞬时放电频率表示。请注意，该反应与下颌位移高度相似，表明该特定神经元提供了与下颌位置相关的感觉反馈。此图显示了一个在肌肉探查过程中有反应的感觉神经元。

神经元经免疫化学处理后用ide染色。作为红色膨大的突触棒状结构与黄色的突触素共定位。绿色为荧光示踪染色。

该图展示了来自肌梭初级传入神经元的轴突动画。该动画由标记神经元的多个光学切片生成。通过此方法，还可进一步开展电镜、共聚焦显微镜、顺行或逆行神经元标记等其他技术，以研究该神经元的超微结构特征、神经递质与突触结构的共定位以及神经元之间的连接关系。