Name: 脂质囊泡介导的亲和层析法，使用磁性细胞分选（LIMACS）:一种新的方法来分析蛋白质 - 脂质相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-26T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 学习脂质囊泡介导的亲和层析法（LIMACS）来分析蛋白质-脂质相互作用。该方法利用磁性细胞分选和Annexin V磁珠，在膜样环境中纯化并鉴定脂质结合蛋白，为疾病诊疗提供新思路。

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本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金R01NS046835和R01AG034389以及March of Dimes基金6FY08-322的支持。特别感谢Mrs. Eleanor Brown（Miltenyi Biotec，加利福尼亚州奥本）在MACS技术方面的深刻见解所提供的巨大帮助。Miltenyi无偿提供了用于实验演示的材料。同时感谢Dr. Guanghu Wang（佐治亚医学院/佐治亚健康科学大学，奥古斯塔，佐治亚州）构建了表达PKCζ的细胞系。也对佐治亚医学院/佐治亚健康科学大学分子医学研究所（在Dr. Lin Mei的领导下）提供的支持表示感谢。

1. 引言
我们实验室开发了基于脂质体介导的亲和层析结合磁性激活细胞分选技术（LIMACS），用于分离与神经酰胺相关的蛋白质复合物 1-3最初，脂质体由神经酰胺和磷脂酰丝氨酸构成，可通过与磁性微粒偶联的Annexin V（对磷脂酰丝氨酸具有高亲和力）进行磁珠分选（MACS），从而分离脂质体及其相关蛋白。我们已将LIMACS技术用于 体外 重建神经酰胺相关极性复合物及从细胞裂解液中分离神经酰胺结合蛋白 3LIMACS 可通过使用其他相互作用伙伴来修饰，以分离囊泡（例如，特异性识别糖脂的凝集素或脂质抗体）。
2. 实验步骤
脂质体的制备与aPKC结合实验
<ol>
	<li>通过改良的大脂质体（liposome）制备方法，从等摩尔量的磷脂酰丝氨酸（105 μg）和C16-神经酰胺（85 μg）的干燥混合物中获得脂质囊泡1,4-7。</li>
	<li>将脂质混合物在100 μl囊泡缓冲液（含50 mM Tris/HCl（pH 7.5）和150 mM NaCl）中重悬，并超声处理1小时。</li>
	<li>加入300 μl含0.1 mM MnCl2的囊泡缓冲液后，样品在4 °C下以12,000 μg离心20分钟。</li>
	<li>将沉淀（大脂质囊泡）重悬于100 μl囊泡缓冲液中，并与1 nmol Vybrant CM-diI在37 °C孵育1小时，以便在MACS分离后可视化囊泡组分。Vybrant CM-diI是一种特异性嵌入脂质膜的红色荧光染料。</li>
	<li>通过在300 μl低渗缓冲液（含10 mM Tris/HCl（pH 7.0）以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂）中对细胞进行超声或匀浆处理，制备无去垢剂的细胞裂解液，随后通过离心去除膜碎片。为避免内源性含磷脂酰丝氨酸的膜污染细胞裂解液，应增加一步在100,000xg下离心1小时的操作。</li>
	<li>将澄清的裂解液加入脂质囊泡悬液中，在4 °C孵育2小时。</li>
	<li>向反应混合物中加入20 μl 20x Annexin V结合缓冲液和50 μl含Annexin V偶联磁珠的溶液，随后在4 °C孵育1小时。</li>
	<li>按照生产商（Miltenyi Biotec, Inc.）的说明书进行磁珠分选（MACS）。通过微孔板荧光读数仪检测流穿组分和洗脱组分中Vybrant CM-diI的荧光强度，以确定脂质囊泡的存在及数量。</li>
	<li>通过定量高效薄层色谱法（HPTLC）分析应用于基于Annexin V的MACS的脂质混合物，验证囊泡脂质含量与囊泡结合的Vybrant CM-diI荧光强度之间的线性相关性。</li>
	<li>通过抗体竞争实验验证aPKC或其他蛋白与神经酰胺/磷脂酰丝氨酸囊泡结合反应的特异性：在与脂质囊泡孵育前，先将细胞裂解液与1 μg抗PKCζ兔多克隆抗体在4 °C孵育1小时。</li>
	<li>通过SDS-PAGE和免疫印迹分析MACS洗脱液中与神经酰胺/磷脂酰丝氨酸囊泡结合的蛋白质。</li>
</ol>
体外 脂质-蛋白质极性复合物
<ol>
	<li>的 体外 脂质-蛋白质极性复合物的重建按照前文所述的LIMACS程序进行。简言之，磷脂酰丝氨酸（420 μg）和 C16-神经酰胺（107 μg) 从有机溶剂中干燥。</li>
	<li>干燥的脂质在超声处理下重新悬浮于 500 μl 50 mM Tris/HCl（pH 7.5）；150 mM NaCl 的囊泡缓冲液。</li>
	<li>五 μl 10 mM MnCl₂ 1 μl Vybrant CM-DiI 和 500 ng PKCζ（人重组蛋白）加入后，反应混合物在温和振荡条件下于 60 分钟内孵育 4 °C.</li>
	<li>Vybrant CM-DiI 标记的磷脂酰丝氨酸/神经酰胺囊泡通过在 12,000×g 离心 60 分钟回收 4 °C.</li>
	<li>将沉淀物（粉红色）重悬于 100 μl Tris缓冲液并添加γS-GTP（100 μM），GDP（1 mM）、GST-Par6（100 ng）或 GST-Cdc42（500 ng），并在 4°C 下继续孵育 3 小时 4 °C (此处可使用任何其他感兴趣的重组蛋白组合).</li>
	<li>Annexin V缓冲液（5 μl 20倍浓缩储备液）以及偶联磁珠的Annexin V（50 μl) 加入后，反应混合物在温和振荡条件下于30分钟内继续孵育 4 °C.</li>
	<li>Annexin V-MACS 按照供应商先前所述的方案进行操作。</li>
	<li>洗脱组分（1 ml）中加入 10 μg 以纯卵白蛋白作为沉淀辅助剂。蛋白质通过Wessel-Flugge沉淀法浓缩，并按先前所述方法进行SDS-PAGE/免疫印迹分析。 8.</li>
	<li>通过检测Wessel Flugge沉淀反应中有机相（氯仿/甲醇相）内Vybrant CM-diI（粉红色）的含量，来定量洗脱的脂质体。所分析的蛋白质量以等量的脂质体进行归一化处理。</li>
</ol>
3. 结果
PKCζ-EGFP 和神经酰胺结合结构域 C20ζ-EGFP 的 LIMACS 纯化
将表达全长PKCζ（其C末端连接绿色荧光蛋白，即FLζ-EGFP）或PKCζ C末端含有神经酰胺结合域（即C20ζ-EGFP）的MDCK细胞去污剂裂解液与磷脂酰丝氨酸/神经酰胺囊泡孵育，实验步骤如“实验方法”部分所述。经MACS柱洗脱后，采用免疫印迹法分析蛋白，并使用抗PKCζ和抗EGFP抗体检测洗脱蛋白2。
<img src="/files/ftp_upload/2657/2657fig1.jpg" alt="Western blot 示意图；蛋白质表达分析；EGFP、FLζ-EGFP、C20ζ-EGFP；kDa 标记物。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1. 使用磷脂酰丝氨酸/神经酰胺囊泡对 EGFP 标记的 PKCζ 及其 C 末端片段 C20ζ 进行 LIMACS 分析。
将表达EGFP（作为非结合对照）、全长PKCζ-EGFP或具有神经酰胺结合能力的C端片段C20ζ-EGFP的MDCK细胞裂解物（不含去垢剂）与磷脂酰丝氨酸/神经酰胺囊泡孵育，实验步骤详见“实验方法”部分。经LIMACS处理后，用SDS上样缓冲液洗脱蛋白，并通过SDS-PAGE和免疫印迹分析。左图显示，EGFP未与Annexin V偶联磁珠保留的囊泡结合。中图和右图显示，全长PKCζ-EGFP和C20ζ-EGFP因与神经酰胺结合而被保留。

<ol><li>Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+binding+to+ceramide+activates+protein+kinase+Czeta+before+the+formation+of+a+pro-apoptotic+complex+with+PAR-4+in+differentiating+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct binding to ceramide activates protein kinase Czeta before the formation of a pro-apoptotic complex with PAR-4 in differentiating stem cells.</a> J Biol Chem. 280, 26415-26424 (2005).</li>
<li>Wang, G., Krishnamurthy, K., Umapathy, N. S., Verin, A. D., Bieberich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carboxyl-terminal+domain+of+atypical+protein+kinase+Czeta+binds+to+ceramide+and+regulates+junction+formation+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The carboxyl-terminal domain of atypical protein kinase Czeta binds to ceramide and regulates junction formation in epithelial cells.</a> J Biol Chem. 284, 14469-14475 (2008).</li>
<li>Chalfant, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+ceramide+regulates+the+alternative+splicing+of+caspase+9+and+Bcl-x+in+A549+lung+adenocarcinoma+cells.+Dependence+on+protein+phosphatase-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1.</a> J Biol Chem. 277, 12587-12595 (2002).</li>
<li>Simon, C. G., Holloway, P. W., Gear, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exchange+of+C%2816%29-ceramide+between+phospholipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exchange of C(16)-ceramide between phospholipid vesicles.</a> Biochemistry. 38, 14676-14682 (1999).</li>
<li>Goni, F. M., Contreras, F. X., Montes, L. R., Sot, J., Alonso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+%28and+sociology%29+of+ceramides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Symp%22%5BJournal%5D)">Biophysics (and sociology) of ceramides.</a> Biochem Soc Symp. , 177-188 (2005).</li>
<li>Kumagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CERT+mediates+intermembrane+transfer+of+various+molecular+species+of+ceramides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">CERT mediates intermembrane transfer of various molecular species of ceramides.</a> J Biol Chem. 280, 6488-6495 (2005).</li>
<li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Anal Biochem. 138, 141-143 (1984).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

检测脂质与其结合蛋白之间特异性相互作用的研究受到脂质嵌入细胞膜中的限制。细胞膜由多种脂质和蛋白质混合组成，并形成脂质微区或称脂筏结构。因此，通过共纯化微区及其相关蛋白的方法无法明确区分该蛋白是直接与某种脂质结合，还是仅仅富集于微区结构中。其他方法，例如将特定脂质包被在固相表面的脂质ELISA或表面等离子共振光谱法，能够检测特定脂质与其结合蛋白之间的相互作用。然而，若要在具有生理相关性的膜环境中确定这种相互作用，需将脂质囊泡或脂质体包被于检测表面（如用于表面等离子共振光谱法的芯片表面）。
我们开发了一种新型的脂质囊泡结合实验，作为对以往方法的替代。该方法的创新之处在于将一种锚定脂质（磷脂酰丝氨酸）整合入囊泡中，从而可利用与磁珠偶联的膜联蛋白V（Annexin V）来分离脂质囊泡。因此，我们将该实验命名为基于磁性激活细胞分选的脂质囊泡介导亲和层析法（LIMACS）。LIMACS可用于内源性蛋白、细胞中表达的蛋白，或重构于脂质-蛋白复合物中的重组蛋白的研究1-3。
通过简单地将MACS柱从磁力架上取下，并用...

<table><tbody><tr><td>偶联 Annexin V 的磁珠及 MACS 微柱和小柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脂质（最高纯度）</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

磁性激活细胞分选介导的脂质囊泡亲和层析（limacs）：一种分析蛋白质-脂质相互作用的新方法

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

由于脂质嵌入在细胞膜中，难以接触大多数纯化步骤，因此脂质与蛋白质相互作用的分析具有挑战性。作为替代方法，可将脂质涂覆在平面上，如用于脂质ELISA和表面等离子共振光谱法。然而，表面涂覆的脂质无法形成微区结构，而这些结构可能对脂质的结合特性至关重要。此外，这些方法也无法实现与靶标脂质结合的大量蛋白质的纯化。
 为了克服检测脂质-蛋白质相互作用的局限性，并实现脂质结合蛋白的纯化，我们开发了一种新方法，称为基于磁性激活细胞分选技术的脂质囊泡介导亲和层析法（LIMACS）。该方法中，将目标脂质与磷脂酰丝氨酸作为锚定脂质共同制备成脂质囊泡，用于Annexin V MACS。磷脂酰丝氨酸是一种广泛存在于细胞膜上的磷脂，可高亲和力地结合Annexin V蛋白。通过使用与Annexin V偶联的磁珠，含有磷脂酰丝氨酸的脂质囊泡即可结合到磁珠上。当将这些脂质囊泡与细胞裂解液孵育时，能够结合目标脂质的蛋白质也将随之被固定在磁珠上，从而可通过MACS实现共纯化。该方法也可用于检测重组蛋白是否能重建一个可结合目标脂质的蛋白质复合物。
我们已利用该方法揭示了非典型蛋白激酶C（aPKC）与鞘脂类神经酰胺之间的相互作用，并共同纯化出前列腺凋亡反应4蛋白（PAR-4），后者是一种可结合神经酰胺相关aPKC的蛋白质。我们还应用该方法重建了重组aPKC与细胞极性相关蛋白Par6和Cdc42形成的神经酰胺相关复合物。由于脂质体可由多种鞘脂或磷脂制备，LIMACS提供了一种灵活的检测手段，用于在接近细胞膜环境的条件下研究脂质-蛋白质相互作用。通过蛋白质组学分析与脂质体共纯化的脂质结合蛋白，还可鉴定出其他脂质-蛋白质复合物。

为了检测蛋白质与其靶向脂质的相互作用，我们使用了MACS技术以及与磁珠偶联的Annexin V，并采用靶向脂质和Annexin V结合的磷脂酰丝氨酸合成脂质体。结合在靶向脂质上的蛋白质可通过磁珠共纯化，并在洗脱后进行分析。

磁性激活细胞分选介导的脂质囊泡亲和层析（LIMACS）：一种分析蛋白质-脂质相互作用的新方法

脂质与蛋白质相互作用的分析具有挑战性，因为脂质嵌入在细胞膜中，因此难以被大多数纯化方法所获取……

本实验旨在鉴定脂质结合蛋白，并在特定的膜环境中分析脂质与蛋白质的相互作用。将细胞匀浆中的脂质筏蛋白与新制备的磷脂酰丝氨酸和神经酰胺脂质体共同孵育。随后在反应体系中加入Xin V偶联的磁珠，以将与脂质体结合的蛋白质锚定在磁珠上。接着通过磁性激活细胞分选技术纯化蛋白质-脂质体复合物。为了鉴定脂质结合蛋白的实验结果，可采用SDS-PAGE蛋白印迹法，展示在MDCK细胞中表达的内源性和重组型非典型PKC以及特异性神经酰胺结合结构域的lyx纯化结果。与现有的ELISA或表面等离子共振光谱等表面结合方法相比，该新技术的主要优势在于，脂质-蛋白相互作用是在类似膜的环境中实现的，且结合的蛋白质可被纯化并进行分析。该技术的应用前景涵盖涉及脂质相关疾病的治疗与诊断，因为在这些疾病中，生理性的脂质-蛋白相互作用受到损害。对于其中一些疾病，其蛋白质靶点甚至尚未明确，需要进行鉴定。要设计一种基于脂质的疗法，首先准备脂质体，方法是将等摩尔量的磷脂酰丝氨酸与C16神经酰胺溶于100微升sical缓冲液中形成干燥混合物。加入300微升sical缓冲液后超声处理一小时，该缓冲液中添加有0.1毫摩尔/升氯化锰。在4摄氏度下以12,000 G离心20分钟，然后将大脂质囊泡沉淀重悬于100微升sical缓冲液中。加入1纳摩尔的vibrant cm DII荧光染料，在37摄氏度孵育一小时，以便在后续最大分离后可视化SLE组分。通过离心回收染有vibrant cm DII的磷酸盐-神经酰胺脂质体形成的粉红色沉淀，并将其重悬于100微升Tris缓冲液中。接下来，为了制备无去垢剂的细胞裂解液，将细胞在300微升含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的10毫摩尔/升盐酸三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl）高渗缓冲液中进行超声处理，随后离心。为去除膜性碎片，将澄清的细胞裂解液加入脂质物理悬浮液中，并在4摄氏度下孵育两小时。由于细胞裂解液可能含有带磷酸乙醇胺的内源性膜结构，建议通过额外的离心步骤清除这些膜成分。向反应体系中加入 20 微升 XNV 结合缓冲液和 50 微升含有与 XNV 偶联的磁珠的溶液，在 4 摄氏度孵育一小时，然后按照制造商提供的方案进行磁性激活细胞分选。接下来，使用微孔板荧光读数仪检测流穿组分和洗脱组分中的活泼 CM-DII 荧光，以确定抗体竞争实验中脂质小体的存在及其数量。为验证 PKC 与神经酰胺磷酸丝氨酸囊泡结合反应的特异性，将 1 微克抗 PKC Zeta 兔多克隆抗体与细胞裂解液在 4 摄氏度孵育一小时，随后与脂质囊泡孵育。继续进行SDS-PAGE及免疫印迹分析，以检测最大洗脱液中与磷酸丝氨酸神经酰胺结合的蛋白质，用于体外重建脂质-蛋白质极性复合物。首先制备呈粉红色的沉淀，即之前所示的经活力染料CM-DII标记的磷酸丝氨酸神经酰胺囊泡。将囊泡重悬于100 µL的Tris缓冲液中，缓冲液中添加1

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