使用双光子显微镜在受感染的肺部的嗜中性粒细胞吞噬和NET形成的直接观察
June 2nd, 2011
我们展示，如何使用双光子显微镜观察中性粒细胞在受感染的肺部的粒细胞动力学，而他们吞噬病原体或产生中性粒细胞（以英语为母语的英语教师）外的陷阱。
该程序的总体目标是可视化最近感染真菌病原体的肺部中活的中性粒细胞粒细胞和细胞外 DNA 网。首先，在中性粒细胞群体中 EGFP 呈阳性的小鼠感染了同样具有荧光标记的 candia。接下来，让感染发展超过 7 小时，然后处死受感染的动物。
然后，受感染动物的肺部充满低熔点的 agros，以方便 beome 切片。最后，通过 viome 和肺中性粒细胞获得受感染肺组织的厚片。对 DNA 网和真菌元件进行成像。
最终，可以通过多色双光子显微镜获得活肺组织中粒细胞的高分辨率静止图像或电影序列。与现有技术相比，这种方法的主要优点是可以在自然环境中直接观察到负责清除感染的免疫细胞。这可以在网形成和真菌杀伤过程中完成，因此可以对中性粒细胞生理学进行较少的人为分析。
当 Mathias 对我先前体外研究结果的体内相关性提出迫切的问题时，我发明了这项技术，我将在接下来的几分钟内介绍这项技术，以产生环境霉菌的肿胀 kedia。烟曲霉。将 5 毫升培养基加入 6 孔细胞培养板中，然后转移 2 次 10 次到第七个细胞培养板中，将 CEDIA 静置到板中，并在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中将孢子在 A BSL 2 设施中孵育 7 小时。
溶胀期后，轻轻混合后，向每个孔中加入 10 微升钙白色茎溶液，对孢子进行荧光标记。在相同条件下将板再孵育 15 分钟以收获荧光标记的孢子，将 70 微米的细胞过滤器放在 50 毫升锥形管的顶部。用移液管从板中收集孢子，然后将培养基溶液通过细胞训练器进入试管。
接下来，在室温下以 900 G 的浓度离心细胞 5 分钟，然后丢弃培养基。然后在相同的离心条件下用 10 毫升 PBS 洗涤孢子。将孢子沉淀重新悬浮在两毫升 PBS 中，并在与之前和之后相同的离心条件下，再次在孢子悬浮液上通过细胞逆旋测定膨胀的加拿大人总数，小心去除上清液复苏。
将沉淀的 kedia 以 1 倍 10 的终浓度悬浮于每 100 μL PBS 的 7 个细胞中，以准备小鼠感染孢子溶液，麻醉动物并通过对脚趾捏无反应来确认镇静。在本视频中，在麻醉和确认镇静后 5 分钟使用松紧带将麻醉小鼠悬挂在斜面上，使用松紧带将麻醉小鼠的牙齿悬浮在斜面上鹅颈灯下。使用镊子将舌头拉到一侧，然后将 22 号留置静脉导管插入动物的气管。
成功插入该管路后，使用 100 微升微量移液器施用 100 微升孢子悬浮液。然后，为了增强真菌颗粒在整个肺部的分布，使用小动物呼吸器以每分钟 250 次呼吸的呼吸频率和每次呼吸 300 微升的吸入量为受感染的动物机械通气两分钟。最后，取出导管并将小鼠放回笼子中 7 小时，同时感染进展。
每 5 分钟观察一次动物的恢复情况，直到在感染期结束前再次可以走动。在微波炉中融化 20 毫升低熔点 agros 并保持温暖，这样 agros 在注射前不会凝固。此时也要将一瓶 PBS 在冰箱中冷却至 4 摄氏度。
在感染期结束时，动物被安乐死。用针将鼠标固定在硅胶准备垫上，并使用剪刀和镊子小心地打开胸部，露出肺部和上呼吸道。从暴露的会厌开始，将另一根 22 号留置静脉导管插入气管。
使用缝纫针，将标准缝纫线分层在气管周围，为随后的肺填充步骤做准备。接下来，在一毫升注射器中装满预热的 aros，并通过导管施用溶液以使其充满肺部。肺部充满后，用准备好的缝纫线将气管系紧，同时取出导管，然后将整个动物放入 4 摄氏度的冰箱中 15 分钟。
aros 凝固后，从气管开始，从敞开的胸部切除整个肺，并使用一把锋利的尖头剪刀用预冷的 PBS 清洗。切除右肺叶。在一张薄纸上短暂擦干叶底部，然后用一滴纸巾粘合剂将叶固定在 vibram 制备块上一分钟。
接下来，将块安装在颤音的切割室中，然后用预冷的 PBS 填充腔室。将剃须刀设置为中等振动频率，并设置内侧驱动，并切开肺的水平横截面。然后将切片的肺组织的上半部分倒置在直径为 5 厘米的塑料培养皿中。
通过在培养皿顶部放置一个平垫圈，将肺组织固定在培养皿上。用 10 毫升 PBS 填充培养皿，并加入 10 微升胞质素染料。最后，将含有肺组织的培养皿安装在显微镜物镜下，以便缓冲液可以通过温度传感器控制的加热器加热至 37 摄氏度以进行成像。
使用 800 纳米的照明波长，沿解剖 R 扫描的不同区域低至 400 微米深度，检测绿色 530 纳米和红色 580 纳米荧光，以及二次谐波产生或 SHG 信号。在用外部非 DS 扫描检测器或 NDD 发射 400 至 470 纳米的蓝色 Councilor 荧光中，此处以蓝色显示的是 C 57 black six 小鼠未感染肺的肺泡组织结构的 SHG 信号。请注意肺切片底部的纤维组织与肺顶部呼吸活动区域内明显的肺泡组织相比。
在该图中，在制备肺切片过程中切开的肺细胞核的 cyt talk 信号以红色显示。该图显示了两个通道的叠加，并在此处显示了组织的框状区域的特写。这里。蓝色 SHG 信号表示 7 小时前 6 小时感染 C 57 black six 小鼠肺切片中存在的肺泡和真菌结构。
在此图中，红色 Cyt talk 信号不仅显示了在制备肺切片过程中切开的肺细胞核，还显示了此处的 DNA 网。在上图中框区的放大图中可以看到两个通道的叠加。真菌团块、肺泡和网状结构的不同区域分别用字母 FA 和 N 表示，组合的真菌结构和肺泡组织的 SHG 表示蓝色。
细胞核和网的 cyt talk 信号呈红色，以及许多肺浸润性中性粒细胞。绿色可以在 lys EGFP 小鼠的肺组织切片中可视化。感染 afu 女神 7 小时后，可以看到绿色的中性粒细胞迁移和吞噬，在延时摄影中可以看到蓝色的 aspers 感染肺部的真菌元素。
活肺切片的双光子显微镜。感染 7 小时后，细胞核和网状结构以红色表示。实验的实时时间显示在右下角，比例尺表示 50 微米。
现在，这种方法可以提供对真菌感染的见解。它也可能应用于其他系统，如病毒或细菌感染，它还可能深入了解肺内其他常驻免疫细胞的功能。
概述
本研究展示了使用2光子显微镜来可视化感染肺中中性粒细胞的动态。该技术允许实时观察吞噬作用和中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的形成。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 显微镜技术
背景
- 中性粒细胞在感染免疫反应中起着至关重要的作用。
- 了解体内中性粒细胞的行为对于研究其生理功能至关重要。
- 传统成像技术可能无法准确反映体内环境。
- 2光子显微镜提供了活体组织的高分辨率成像。
研究目的
- 可视化感染肺组织中活体中性粒细胞。
- 观察NET形成和病原体清除的动态过程。
- 在自然环境中提供对中性粒细胞生理的较少人为干扰的分析。
使用的方法
- 用荧光标记的白念珠菌感染EGFP阳性小鼠。
- 使用低熔点琼脂来促进肺切片。
- 使用多色2光子显微镜对中性粒细胞和DNA网进行成像。
- 为高分辨率成像准备肺组织。
主要结果
- 成功可视化中性粒细胞及其与病原体的相互作用。
- 实时观察感染过程中NET的形成。
- 展示了2光子显微镜相对于传统方法的优势。
- 获得了中性粒细胞动态的高分辨率图像和影片序列。
结论
- 该技术允许直接观察体内免疫反应。
- 它增强了我们对感染期间中性粒细胞功能的理解。
- 这种方法可以应用于研究免疫细胞行为的各个方面。
常见问题
Executive Industry Relevance
Direct visualization of neutrophil phagocytosis and NET formation in infected lung tissue provides mechanistic insight into innate immune defense strategies. This approach enables de-risking of antifungal target validation by linking cellular function to pathogen clearance in a disease-relevant system. The method supports predictive confidence in early discovery by capturing dynamic host-pathogen interactions in native tissue.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by observing neutrophil-mediated pathogen clearance in real time.
- Operational Value: Provides functional target validation through direct imaging of phagocytic and NETotic activity in infected tissue.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by visualizing immune effector functions in a disease-relevant pulmonary environment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved readouts of neutrophil recruitment, phagocytosis, and NET formation.
- Operational Value: Establishes a reproducible, multicolor imaging platform for time-lapse analysis of immune cell dynamics.
- Assay Readiness: Produces validated biological systems (infected lung slices) suitable for compound screening and mechanism-of-action studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo relevance by capturing neutrophil behavior in infected lung tissue.
- Disease Model Fidelity: Uses Aspergillus fumigatus-infected mouse lungs to model human pulmonary fungal infection.
- Preclinical De-risking: Enables risk-adjusted advancement decisions by visualizing therapeutic impact on neutrophil effector functions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation by providing direct, quantitative imaging of immune effector mechanisms in infected tissue.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing neutrophil phagocytosis and NET formation in situ.
- Screening: Delivers assay-ready tissue sections with standardized readouts for immune cell activation and pathogen interaction.
- Analytics: Enables quantitative comparison of conditions through multicolor fluorescence and second harmonic generation imaging of cellular and structural components.
- Translational Research: Connects early immune responses to preclinical outcomes by maintaining tissue architecture and cellular viability.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for studying neutrophil dynamics across infectious disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing reliance on artificial systems and capturing physiological neutrophil behavior.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized tissue preparation, imaging parameters, and quantitative image analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct evidence of target engagement in a disease-relevant context.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by visualizing mechanistic effects of candidates on neutrophil-mediated clearance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiphoton microscopy, tissue sectioning, and fluorescent sample preparation.
- Depends on access to tunable laser scanning microscopes with second harmonic generation detection.
- Necessitates standardization across teams for infection timing, tissue slicing, and imaging parameters.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different pathogen models or immune cell reporters.
- Limited by tissue viability duration and the need for specialized equipment and histological processing.
